盧燕芳 ，李彬 ，林齊立 ，陳瑋媛 ，張婧玲

(1.福建省婦幼保健院檢驗(yàn)科，福建 福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350001；3.福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與技術(shù)工程學(xué)院，福建 福州350001)

Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)是臨床常用的全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏儀之一，可以快速高效地對多種微生物進(jìn)行鑒定與藥敏分析，其高級專家系統(tǒng)（AES）更能提示菌株可能存在的耐藥機(jī)制，對臨床診療有重要的指導(dǎo)意義[1]。近年來，CRE菌株的出現(xiàn)給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[2]，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)評價(jià)其所用的全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏儀對CRE的鑒定及預(yù)警功能，以降低漏檢率，防止耐藥菌株的流行[3]。本研究擬探討Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)在CRE鑒定及預(yù)警產(chǎn)碳青霉烯酶的可靠性和臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 收集2011年8月3日至2012年8月3日某醫(yī)院臨床送檢樣本中分離并保存的93株非重復(fù)的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌作為受試菌株。

1.1.2 儀器與試劑 Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及相配套的細(xì)菌生化NMIC/ID4藥敏鑒定卡（購自美國BD公司）。

1.1.3 質(zhì)控菌株 產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC700324、大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定與藥敏 將初篩的菌落移種至血平板上培養(yǎng)過夜，獲得單個(gè)純種菌落；將所獲菌株制成相應(yīng)麥?zhǔn)蠞岫鹊木涸赑hoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定藥敏分析，同時(shí)對儀器高級專家系統(tǒng)所提示的產(chǎn)酶信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。具體操作步驟參考儀器廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟。

1.2.2 耐藥基因的檢測 煮沸法提取細(xì)菌模板DNA，采用PCR特異性的引物序列[4]擴(kuò)增常見的碳青霉烯耐藥基因 （如 blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaNDM），測序PCR陽性產(chǎn)物以確定基因型。

1.2.3 Phoenix-100儀器AES性能指標(biāo)統(tǒng)計(jì) 以PCR法擴(kuò)增碳青霉烯酶基因后的檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，使用Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對該基因型的碳青霉烯酶菌株數(shù)進(jìn)行鑒定并對AES提示產(chǎn)酶情況的相關(guān)性能指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 CRE菌株分布和Phoenix-100鑒定情況 共篩選出碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌93株，其分布及Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定情況見表1。Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定CRE菌株的符合率為41.9%(39/93)，其中產(chǎn)酸克雷伯菌的符合率最高，為75.0%(3/4)。

表1 CRE菌株的分布和不同菌株中Phoenix-100鑒定情況

2.2 PCR和Phoenix-100 AES系統(tǒng)提示碳青霉烯酶陽性菌株情況 93株CRE中有55株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因，而Phoenix-100 AES系統(tǒng)提示44株CRE產(chǎn)碳青霉烯酶，見表2。

2.3 PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因及測序結(jié)果 通過PCR擴(kuò)增和測序分析，實(shí)驗(yàn)菌株檢測出的碳青霉烯酶基因型分布見表3。在攜帶不同碳青霉烯酶基因型的55株CPE菌株中，Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)判定為CRE菌株的能力及AES提示產(chǎn)酶情況有所不同，見表4。

2.4 Phoenix-100 AES檢測碳青霉烯酶的參數(shù)指標(biāo) 以PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因及DNA測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測CRE菌株時(shí)，AES在提示產(chǎn)碳青霉烯酶方面靈敏度為52.7%，特異性為60.5%，陽性預(yù)測值為65.9%，陰性預(yù)測值為46.9%，準(zhǔn)確度為55.9%。參數(shù)指標(biāo)見表5。

表2 CRE菌株中PCR證實(shí)CPE和Phoenix-100提示碳青霉烯酶陽性菌株情況對比

3 討論

碳青霉烯類抗生素目前被認(rèn)為是治療革蘭陰性菌感染的最后一道防線，而近年來，碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌所致感染爆發(fā)的報(bào)道呈現(xiàn)上升趨勢，給臨床抗感染治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[2]。為了解Phoenix-100鑒定CRE菌株的預(yù)警能力，本研究收集非重復(fù)臨床分離的CRE，以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)在鑒定及預(yù)測CRE是否產(chǎn)碳青霉烯酶的可靠性，探討Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測CRE的性能及預(yù)警中的指導(dǎo)價(jià)值和臨床意義。

表3 碳青霉烯酶基因型病原菌構(gòu)成比（%）

表4 Phoenix-100對不同碳青霉烯酶基因型菌株的判定和提示產(chǎn)酶情況

表5 Phoenix-100 AES檢測腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶的參數(shù)指標(biāo)

本研究收集的93株CRE菌株主要以肺炎克雷伯菌為主，與目前CRE菌株的研究分布相符[4，5]。本研究發(fā)現(xiàn)大量的IMP型碳青霉烯酶基因已在多種腸桿菌科細(xì)菌中播散，應(yīng)引起高度重視。本研究中Phoenix-100對不同菌種CRE預(yù)測能力均較低，這與李春娟等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大出入，這可能與不同地域中CRE菌株對亞胺培南或美羅培南的耐藥率不同有關(guān)。

以PCR為金標(biāo)準(zhǔn)，Phoenix-100 AES篩檢碳青霉烯酶陽性的符合率也較低，可能由于一部分產(chǎn)誘導(dǎo)酶的細(xì)菌及延遲表達(dá)耐藥性的細(xì)菌在短時(shí)間內(nèi)難達(dá)到可檢測水平而造成Phoenix-100儀器漏報(bào)耐藥結(jié)果，且儀器對菌懸液的濃度要求相當(dāng)嚴(yán)格，稍微誤差則有可能會(huì)不報(bào)結(jié)果。然而在預(yù)測大腸埃希菌是否為碳青霉烯酶陽性時(shí)，Phoenix-100 AES系統(tǒng)的陽性提示率反而高于PCR對碳青霉烯酶的檢出率（見表2），可能與Phoenix-100僅是表型監(jiān)測，而一些如生長溫度、PH值等非基因因素導(dǎo)致的假陽性影響檢出率有關(guān)，又或許與PCR未能檢出少見碳青霉烯酶基因 （如blaIMI，blaVIM等）有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)顯示Phoenix-100對不同基因型的CRE菌株的預(yù)測率不同（見表4），對blaKPC-2與blaNDM-1基因型的CRE預(yù)測率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于blaIMP-4及blaIMP-8基因型?？赡芘c本研究收集的菌株中blaKPC-2與blaNDM-1基因型的CRE的菌株數(shù)量較少有關(guān)，必要的時(shí)候可以增加CRE菌株的數(shù)量與菌屬總類進(jìn)一步確認(rèn)Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)判定CRE的性能。此外，在判定攜帶blaIMP-4的CRE菌株時(shí)，Phoenix-100 AES的陽性提示率高于儀器對CRE的直接鑒定（見表4）。導(dǎo)致該現(xiàn)象的可能原因與菌株復(fù)雜的耐藥表型而造成Phoenix-100 AES的誤判有關(guān)。因此，Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)可結(jié)合如PCR的方法以提高對產(chǎn)酶株檢測的準(zhǔn)確率。

本結(jié)果顯示Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌的鑒定及預(yù)警能力不足，可能是由于本儀器僅有美羅培南和亞胺培南兩種藥敏卡片，而并沒有厄他培南卡片。但是CLSI推薦[7]使用厄他培南紙片是檢測CRE最好的藥敏紙片，本儀器缺少的厄他培南藥敏信息可能是其鑒定CRE的指導(dǎo)價(jià)值低的原因。

綜上所述，Phoenix-100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)預(yù)測CRE菌株的靈敏度較低，對于工作中使用本儀器的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室筆者建議必要時(shí)應(yīng)輔以聯(lián)用厄他培南紙片擴(kuò)散法，以提高CRE的檢出率，以便臨床根據(jù)病原菌的種類以及藥敏試驗(yàn)結(jié)果及時(shí)制定有效且合理的治療方案，來減少產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的出現(xiàn)和流行。