張君娜

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 開封475000)

星形細胞瘤是常見的腦腫瘤，有資料[1]顯示其約占腦腫瘤的45%左右，并且近年來其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢。星形細胞瘤患者采用手術(shù)治療難以根治，預(yù)后普遍較差，這不僅與腫瘤的組織學(xué)類型有關(guān)，還有腫瘤細胞的侵襲增殖能力相關(guān)[2]。因此如何阻止腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療星形細胞瘤的熱門研究方向。乙酰肝素酶（HPA）是一類內(nèi)切糖苷酶，能夠?qū)⒓毎饣|(zhì)的組織屏障破壞，使其他物質(zhì)進入基質(zhì)。有研究[3]顯示，多類惡性腫瘤的患者存在體內(nèi)HPA異常表達的現(xiàn)象，在腫瘤細胞的侵襲過程中起到重要作用。故在本次試驗中，觀察HPA在星形細胞瘤患者體內(nèi)的表達情況，并研究其對腫瘤細胞侵襲的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下：

1 材料與方法

1.1 樣本來源 選取2013年3月-2017年3月期間在我院行手術(shù)切除的67例腦星形細胞瘤患者的病理切片標本，切片標本均經(jīng)2位病理科副高醫(yī)師按WHO的《神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤》[4]復(fù)查審核，將其設(shè)為腫瘤組。腫瘤組：男37例，女30例，年齡26~73 歲，平均年齡（58.23±12.51）歲，病理分型：Ⅱ級21例，Ⅲ級27例，Ⅳ級19例。納入標準：①符合星形細胞瘤的診斷標準；②年齡＞18歲；③患者未接受過放化療；④研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。排除標準：①有精神疾病史；②有其他顱內(nèi)疾病的。選擇同時期39例因腦外傷在我院行顱內(nèi)減壓術(shù)的患者的正常腦組織，制作切片，設(shè)為正常對照組。正常對照組：男24例，女15例，年齡24~69歲，平均年齡（47.12±10.47）歲。

1.2 儀器與試劑 主要試劑：兔抗人HPA多克隆抗體（BA1630），購于武漢博士德生物工程有限公司。即用型非生物素免疫組化EliVisionTM plus試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液，購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。10%胎牛血清，購于杭州四季青生物有限公司。DMEM培養(yǎng)基，購于GIBCO公司。HPA一抗，購于Santa Crus公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購于KPL公司。siRNA購于Dharmacon公司。人工基底膜基質(zhì)凝膠(matrigel)購自美國BD公司。Trizol試劑盒和質(zhì)粒購于Invitrogen公司。星形細胞瘤U87細胞，購于上海北諾生物科技有限公司。Transwell小室購于Costar公司。

主要儀器：切片機，購于Microm公司。光學(xué)顯微鏡，購于鎮(zhèn)江新天醫(yī)療有限公司。PCR擴增儀購于湖南赫西儀器裝備有限公司。倒置顯微鏡，購于重慶化學(xué)試劑玻璃儀器總公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組化染色 每例研究對象的腦組織用10%中性甲醛固定后，用石蠟包埋，然后連續(xù)切片（厚度為 4μm），60℃干燥 40min，脫蠟，然后加檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)，98℃15min，自然冷卻。再用PBS緩沖液沖洗3次，加DAB液，沖洗后蘇木素染色封片，用已知陽性切片做陽性對照，用PBS液代替一抗做陰性對照。鏡下觀察：胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒即為HPA陽性；每個切片取5個視野，每個視野下計算100個腫瘤細胞中陽性細胞所占的比例，并進行計分：細胞數(shù)＜10%為0分，10%~50%為1分，51%~75%為2分，＞75%為3分。然后根據(jù)染色程度進行計分：未著色為0分，著色淺為1分，黃色為2分，深棕色為3分。陽性占比×染色程度＞1分為+，＞3分為++，＞6分為+++。 +及+以上即為陽性表達。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染 選擇星形細胞瘤U87細胞系分3組進行培養(yǎng)：將細胞置于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。調(diào)整細胞密度至1×105個/ml，分別為空白對照組、陰性對照組和轉(zhuǎn)染組。細胞融合至50%，24h后開始轉(zhuǎn)染，陰性對照組加入空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染組加入HPA siRNA。

1.3.3 PCR技術(shù)檢測HPA mRNA的表達 采用RT-PCR法檢測，按1.3.2中培養(yǎng)所得的細胞以及1.3.1中研究對象的腦組織取組織約152400mg，轉(zhuǎn)移到勻漿管中，加入1ml Trizol，用勻漿器研磨3min，然后加入氯仿 200μl，混勻 30s，靜置 10min；轉(zhuǎn)移到1.5ml DEPC處理的無菌離心管中，混勻，離心（12000rpm，15min）；取上層清液至另一離心管中，加入等容積異丙醇，混勻，靜置10min，再次離心（12000rpm，15min）；吸除上清液，加入 700μl 75%乙醇，懸浮沉淀，再次離心（12000rpm，10min）；吸除上清液，用移液器吸干殘余酒精，室溫空氣干燥；加入20ttl DEPC處理的滅菌水，溶解RNA；然后進行反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計引物：HPA：5’-GAATGGACGGACTGCTAC-3’ （ 上 游 ）、5’ -CCAAAGAATACTTGCCTCA-3’（下游），擴增產(chǎn)物138bp；內(nèi)參β-actin：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3’（上游 ）、5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’（下游）， 擴增產(chǎn)物180bp； 反應(yīng)條件：95℃ 1min，95℃15s，50℃ 1min，72℃ 20s，循環(huán) 40 次，測得 Ct值，計算出HAP mRNA的相對表達量。

1.3.4 Transwell細胞侵襲試驗 將mareigel膠用不完全DMEM培養(yǎng)基按1：5稀釋，取50μl在Transwell上室制作人工基底膜，將1.3.2轉(zhuǎn)染的細胞制成密度為3×105個/ml的細胞懸液取100μl，加入Transwell上室，取600μl的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基加入到下室，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)18h，吸除培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗，室溫下用甲醛固定30min，干燥過夜，取下微孔膜，在倒置顯微鏡下觀察，計數(shù)穿過微孔的細胞數(shù)即為侵襲細胞數(shù)。

1.3.5 Transwell細胞遷移試驗 不用matrigel膠制作基底膜，選用1.3.2轉(zhuǎn)染所得的細胞，按1.3.4操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗，當P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HPA表達情況的比較 正常對照組患者腦組織中未出現(xiàn)HPA表達，腫瘤組中有53例患者陽性表達，且HPA mRNA表達量高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1、圖 1。

表1 兩組HPA表達情況的比較（，%）

表1 兩組HPA表達情況的比較（，%）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05。

1.87±0.36*組別正常對照組腫瘤組例數(shù) HPA陽性率%（n） HPA mRNA表達量39 67 0 0 77.61（52）*

圖1 HPA在星形細胞瘤U87細胞中的表達（×100）

2.2 不同分型組織中HPA的表達情況 隨著腫瘤組織惡性程度的升高，HPA陽性表達率和HPA mRNA表達量也明顯升高，其中Ⅲ、Ⅳ級腫瘤組織中HPA陽性表達率和HPA mRNA表達量高于Ⅱ級，Ⅳ級腫瘤組織中HPA mRNA表達量高于Ⅲ級，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Ⅳ級腫瘤組織中HPA陽性率高于Ⅲ級，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

2.3 HPA在有無轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中表達情況 發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中HPA陽性率為94.17%，高于未轉(zhuǎn)移的55.17%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 不同分型腫瘤組織中HPA的表達情況（，%）

表2 不同分型腫瘤組織中HPA的表達情況（，%）

注：與Ⅱ級比較，*P＜0.05，與Ⅲ級比較，#P＜0.05。

1.05±0.44 1.37±0.35*1.92±0.26*#分型Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級例數(shù) HPA陽性率%（n） HPA mRNA表達量21 27 19 57.14（12）81.48（25）*94.74（18）*

表3 HPA在有無轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中表達情況（%）

2.4 siRNA沉默HPA基因表達對U87細胞侵襲、遷移的影響 Transwell試驗顯示：空白對照組與陰性對照組之間，侵襲和遷移細胞數(shù)無明顯差異（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組侵襲和遷移細胞數(shù)顯著低于空白對照組與陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），見表 4、圖 2、圖 3。

表4 siRNA沉默HPA基因表達對U87細胞侵襲、遷移的影響（）

表4 siRNA沉默HPA基因表達對U87細胞侵襲、遷移的影響（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，與陰性對照組比較，#P＜0.05。

65±11 63±10 22±4*#組別空白對照組陰性對照組轉(zhuǎn)染組侵襲細胞數(shù) 遷移細胞數(shù)86±15 82±12 21±4*#

圖2 三組細胞侵襲能力的比較（×100）

圖3 三組細胞遷移能力的比較（×100）

3 討論

星形細胞瘤是最常見的腦內(nèi)腫瘤，起源于胚胎外胚層[5]，由于預(yù)后差，嚴重威脅了患者的生命健康。通過手術(shù)治療難以根治，星形細胞瘤預(yù)后差的原因是無論分化程度的高低，腫瘤細胞都出現(xiàn)浸潤性生長[6]。腫瘤的浸潤性生長是通過破壞細胞外基質(zhì)[7]，穿過其與血管基底膜形成的天然屏障來實現(xiàn)。

HPA是一類細胞外基質(zhì)降解酶，正常情況下主要儲存于淋巴結(jié)、脾臟和胸腺等免疫組織中，在非免疫組織中不表達，但是近年來大量研究[8，9]顯示其卵巢癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥組織內(nèi)異常高表達。HPA的作用機制是通過特異性鏈接硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）上的硫酸肝素，將其裂解，從而導(dǎo)致：①細胞外基質(zhì)被降解，天然屏障被破壞，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)[10]；②將堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）釋放出來，bFGF是活性較強的促進內(nèi)皮細胞有絲分裂的生長因子[11]，平時儲存于細胞外基質(zhì)內(nèi)，基質(zhì)被破壞后，bFGF大量釋放，促進內(nèi)皮細胞的增殖，使新生血管形成，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移；③纖溶酶原（PA）被HPA釋放，活化生長因子[12]，為腫瘤細胞的增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

正常對照組患者腦組織中未出現(xiàn)HPA表達，腫瘤組中有53例患者陽性表達，且HPA mRNA表達量高于正常對照組（P＜0.05），與劉宏雷[13]的研究結(jié)果一致，這說明HPA在星形細胞瘤患者組織中異常表達，其為何在正常組織內(nèi)不表達的作用機制還有待進一步研究探尋。而且隨著腫瘤組織惡性程度的升高，HPA陽性表達率和HPA mRNA表達量也明顯升高，其中Ⅲ、Ⅳ級腫瘤組織中HPA陽性表達率和HPA mRNA表達量高于Ⅱ級，Ⅳ級腫瘤組織中HPA mRNA表達量高于Ⅲ級 （P＜0.05），這提示HPA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是HPA基因被激活[14]，并且可以反映疾病的嚴重程度。Ⅳ級腫瘤組織中HPA陽性率高于Ⅲ級，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這可能是由于病例標本較少導(dǎo)致，下一步研究應(yīng)擴大樣本量來證實。發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中HPA陽性率為94.17%，而未轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中HPA陽性的55.17%（P＜0.05），這說明HPA參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。

RNA干擾是指通過在細胞中導(dǎo)入與mRNA同源的dsRNA，使mRNA降解，從而沉默該基因的表達[15]。這為抗腫瘤治療提高了一條新思路，在本次的Transwell試驗中，發(fā)現(xiàn)通過采用siRNA沉默HPA基因的表達后，轉(zhuǎn)染組侵襲和遷移細胞數(shù)顯著低于空白對照組與陰性對照組（P＜0.05），說明經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，腫瘤細胞的侵襲和遷移能力明顯下降，并且HPA基因也可以作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶點。有學(xué)者[16]稱，RNA干擾成功的關(guān)鍵在于siRNA序列的設(shè)計，采用不同序列的siRNA進行轉(zhuǎn)染，造成的抑制作用效果不一樣，這為下步研究提供了新方向，尋找抑制作用最好的siRNA。

綜上所述，HPA在人腦星形細胞瘤高度表達，隨著惡性程度的升高，HPA表達也相應(yīng)升高，通過siRNA沉默HPA基因表達，可以使腫瘤細胞的侵襲遷移能力顯著降低。