苗燕平，周小英，熊莉，何華慶，李國良，孫瑜

(江西省血液中心，江西 南昌 330052)

Rh血型系統(tǒng)幾乎是除了ABO血型系統(tǒng)外最重要的血型系統(tǒng)，是人類最復(fù)雜和最具多態(tài)性的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)[1]，由位于1號(hào)染色體短臂上兩個(gè)緊密連鎖的RHD和RHCE基因編碼，兩者之間的同源性大于96%，極易發(fā)生重組交換和不等交換，產(chǎn)生眾多的RHD和RHCE基因變異體，從而影響Rh系統(tǒng)抗原的表達(dá)。Rh系統(tǒng)各抗原均有重要的臨床意義，如胎母免疫、臨床輸血等，本研究試圖從RhCcEe抗原表達(dá)的角度探討江西地區(qū)RhD陰性人群的分子背景，確認(rèn)本地區(qū)相關(guān)血型系統(tǒng)的特點(diǎn)，為臨床醫(yī)療提供一定的參考，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 樣本來源 江西省血液中心RhD初篩陰性的無償獻(xiàn)血者464名，均為無關(guān)人群，年齡18~54周歲，均經(jīng)研究對(duì)象知情同意后采集標(biāo)本備用。

1.2 主要試劑 血清學(xué)試劑中，單克隆抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、抗體篩查試劑、抗人球蛋白試劑均來自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，抗-D抗體分別來自北京金豪、上海血液生物和德國BIOSCOT；基因?qū)W試劑有基因組DNA提取試劑盒 （TBG公司）、Taq酶（Promega公司）、RHD 基因分型試劑盒（PCR-SSP法）（天津秀鵬公司）。所有試劑均按說明書在有效期內(nèi)使用。

1.3 Rh血型系統(tǒng)抗原檢測(cè) 血清學(xué)直接凝集法檢測(cè) D、C、c、E、e 抗原，間接抗人球蛋白試驗(yàn)（IAT）確認(rèn)RhD陰性血型[2]。

1.4 RHD基因分型 對(duì)IAT確認(rèn)為RhD抗原陰性的樣本，隨機(jī)抽取111例，使用PCR-SSP法行RHD基因分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各血型；使用SPSS 19.0對(duì)所得數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 RhD血清學(xué)結(jié)果 464例標(biāo)本中，確認(rèn)為RhD陰性者 451例 (97.1983%)，RhD變異性 13例（2.8017%）。

2.2 RHD基因型與RhCcEe抗原的關(guān)系 排除D變異型后，隨機(jī)抽取111名RhD確認(rèn)陰性者，使用PCR-SSP方法檢測(cè)其RHD基因，表型的分布見表1和表2。

3 討論

Rh血型抗原由2個(gè)具有共顯性的連鎖基因RHD和RHCE基因編碼，在染色體上緊密連鎖，而且堿基序列非常類似，各含10個(gè)外顯子，同源性大于96%，這2個(gè)血型基因是產(chǎn)生不同Rh表型的遺傳基礎(chǔ)，而表型是臨床免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)。隨著RhD抗原臨床免疫預(yù)防的進(jìn)一步規(guī)范，反襯出RhCcEe抗原在臨床輸血和胎母免疫中的問題越來越突出，RhCcEe抗體引起的新生兒溶血病(HDN)逐年增加，而受血者血清中的同種抗體70%～80%與 RhCcEe抗體有關(guān)[3]。2008 年，蘭炯采[4]等便發(fā)現(xiàn)RhD陰性而存在RHD基因的個(gè)體，其表型均為RhC陽性，即CC或Cc，推測(cè)或在RhD陰性個(gè)體中，RHD基因和RhC表型間存在某種聯(lián)系，2014年，陳青[5]等人發(fā)現(xiàn)在江蘇地區(qū)人群中，RhD陰性而存在RHD基因的個(gè)體中，RHCE*C基因的0.4811，本研究由此得到啟示，試圖發(fā)現(xiàn)本地區(qū)RhD陰性人群RhCcEe表型及其與RHD基因間的關(guān)系，從此角度探討RhD的分子背景。

由于目前“紅細(xì)胞膜D抗原有無”的檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)典IAT技術(shù)，本研究使用3種抗D試劑以間接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)（IAT）檢測(cè)RhD抗原以確認(rèn)RhD陰性[6]，但事實(shí)上，以往有研究報(bào)道，使用血清學(xué)方法確定的RhD陰性人群中，有20%～30%為放散型[7，8]，本研究未行吸收放散實(shí)驗(yàn)，選擇的標(biāo)本理論上包括了Del型，但是，2010年國內(nèi)1個(gè)由10家血液中心組成的“Del母同種免疫觀察”小組[9]，初步觀察數(shù)百例真實(shí)RhD陰性和Del孕婦妊娠RhD陽性胎兒是否發(fā)生抗-D同種免疫反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，無1例Del孕婦發(fā)生抗-D同種免疫反應(yīng)，即使其生育＞4次；他們還同時(shí)回顧性研究了200多名抗-D陽性的孕婦，結(jié)果無1例檢測(cè)為Del型，且目前，有關(guān)Del型致敏的文獻(xiàn)并不多見，考慮到Del型臨床意義不大，再加上目前Del型的檢測(cè)所使用的吸收放散實(shí)驗(yàn)與操作者水平密切相關(guān)，結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性并不盡如人意，所以，本研究選擇的標(biāo)本未剔除Del型。

表1 RhD陰性人群RHD基因型與RhCcEe表型的分布關(guān)系（n=111）

表2 RHD外顯子與RhCcEe抗原表達(dá)的關(guān)系（n=111）

本研究發(fā)現(xiàn)，在111名檢測(cè)了RHD基因的人群中，九種理論上的RhCcEe表型只檢出了五種，其中最多的是ccee(54.96%)，其次是Ccee（32.43%），緊隨其后的是CCee（7.21%）和CcEe（2.70%）與 ccEe（2.70%），雖然在人群所占比例上與其他實(shí)驗(yàn)室有出入[10，11]，甚至與本室其他時(shí)間內(nèi)不同實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果也有出入[12-14]，但ccee和Ccee占據(jù)順序前兩位是一致的，我們認(rèn)為，這表明各表型在人群中所占比例的結(jié)果雖然與地區(qū)差異和標(biāo)本量大小導(dǎo)致的穩(wěn)定性有關(guān)，但是該影響因素在比例較大的表型中的影響不足以改變其在整體中的排列順序，所以不論在哪個(gè)調(diào)查中，ccee和Ccee均是主要表型。假如對(duì)我們幾次的調(diào)查做一個(gè)統(tǒng)一的研究，或者會(huì)更接近于群體的真像，這部分工作將留待進(jìn)一步的研究后確認(rèn)。但是作為遺傳標(biāo)志物，血型具有地域特征，本次調(diào)查的Rh系統(tǒng)血型對(duì)研究江西地區(qū)RhD陰性人群遺傳學(xué)特征來說有一定的意義。

PCR-SSP試劑盒僅僅在111名RhD陰性的獻(xiàn)血者中檢出了6種RHD等位基因，根據(jù)外顯子是否完整將其分為三大類，在Fisher精確概率法的提示下，外顯子完整性不同的RHD陰性獻(xiàn)血者，其RhCcEe表型是有差異的，我們初步判斷雖然有地區(qū)差異，但RHD基因外顯子的差異可能決定了CcEe抗原表達(dá)的差異，但是，從本次調(diào)查的RHD（-）基因者僅占被調(diào)查的RhD陰性人群的4.50%（5/111）來看，調(diào)查是有抽樣誤差的，我們尚須加大樣本量，獲得更多標(biāo)本，方能接近更具群體特征的數(shù)據(jù)。國際上經(jīng)RHD全基因序列分析鑒定和Genebank登錄的部分D中顯示的D類別（D category）中，本次實(shí)驗(yàn)只發(fā)現(xiàn)了其中的兩種，即D Cat.VIⅢ和RHD-CE(2-9)-D，部分D多是由于RHD基因一部分被相應(yīng)RHCE基因部分替換形成的RHD/CE融合等位基因，理論上，這個(gè)分子基礎(chǔ)足以對(duì)出現(xiàn)部分D的Rh陰性人群的RhCcEe的表達(dá)有極大影響，但因本研究中樣本量不足，僅從本次數(shù)據(jù)中無法發(fā)現(xiàn)必然聯(lián)系。每個(gè)血型系統(tǒng)的表現(xiàn)均存在地區(qū)差異，王志紅等人關(guān)于Rh系統(tǒng)的血清學(xué)研究中顯示[15]，Cc，cc抗原組合的標(biāo)本可能出現(xiàn)D凝集強(qiáng)度減弱或者極弱形成弱D或者Del型，甚至D抗原不表達(dá)形成D陰性的現(xiàn)象，本室本次檢測(cè)則發(fā)現(xiàn)，在存在RHD（+）的等位基因但血清學(xué)實(shí)驗(yàn)為RhD陰性的20例標(biāo)本中，共有7例顯示為CC，排除地區(qū)差異，這提示江西地區(qū)的RHD基因與RHCE基因間的關(guān)系或可做更進(jìn)一步研究。而隨著研究樣本數(shù)量的增加，我們將發(fā)現(xiàn)越來越多的D的基因型及分子背景，這對(duì)于安全輸血和遺傳學(xué)的研究都具有重要的價(jià)值。

所有研究的目的都是為臨床服務(wù)，本次檢測(cè)的111名RhD陰性的獻(xiàn)血者，其CcEe抗原的出現(xiàn)的頻率依次為 e（111/111）、c（106/111)、C(44/111)、E(6/111)，這提示隨著臨床輸血技術(shù)的提高，檢測(cè)Rh陰性獻(xiàn)血者的表型相當(dāng)有必要，因?yàn)橐坏┗颊弋a(chǎn)生抗-e，尋找合適的供血者將是非常艱難的，本次試驗(yàn)還提示我們，D抗原的表達(dá)多種多樣，有不同的分子基礎(chǔ)，易與相關(guān)抗原互相影響，在日常工作中可能誤判，應(yīng)當(dāng)給予足夠重視，必要時(shí)采取基因?qū)W方法，確認(rèn)正確的分型。