孟慶山，李嘉祥，張飛，趙心清,3，白鳳武,3

1 大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024

2上海交通大學 生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240

3 上海交通大學 教育部代謝與發(fā)育國際合作聯合實驗室，上海 200240

木質纖維素資源是分布廣泛、含量豐富的可再生生物資源。利用微生物生產的纖維素酶降解木質纖維素生成可發(fā)酵糖，再進一步轉化成生物液體燃料和生物基化學品，不僅能緩解化石能源逐漸枯竭的危機，還可以保護環(huán)境，促進經濟可持續(xù)發(fā)展。但存在的挑戰(zhàn)是目前木質纖維素原料生物煉制成本過高，尤其是纖維素降解酶生產成本過高[1-2]。

里氏木霉Trichoderma reesei，又稱為瑞氏木霉，由于其較高的纖維素酶和半纖維素酶合成水平和胞外分泌能力而被廣泛研究，其中里氏木霉Rut-C30菌株廣泛應用于纖維素酶工業(yè)生產中[3]。進一步提高該菌株的產酶水平，有利于提高木質纖維素生物轉化的經濟性。

里氏木霉纖維素酶誘導和合成的調控機制非常復雜[4-5]。隨著絲狀真菌遺傳操作技術的進步，代謝工程改造技術不斷發(fā)展。利用轉錄因子或酶基因的過表達或敲除，成功選育了高產纖維素酶的菌株。例如，我國學者在里氏木霉中通過將纖維素酶基因轉錄抑制因子基因cre1敲除，使突變株總纖維素酶濾紙酶活較出發(fā)株提高72.6%[6]。但目前里氏木霉功能基因組研究還處于起步階段，其纖維素酶合成的調控機制仍需要深入研究。

鋅指蛋白可與DNA、RNA和蛋白相互作用，很多鋅指蛋白在基因表達調控過程中發(fā)揮著重要作用[7]。已經報道里氏木霉中至少存在3個纖維素酶基因正向轉錄因子 (XYR1、ACE2、ACE3)和3個負調控轉錄因子 (CRE1、ACE1、RCE1)，而這些轉錄因子均屬于鋅指蛋白家族[7-8]。基于鋅指蛋白能特定識別DNA序列，研究者設計了C2H2型人工鋅指蛋白轉錄因子文庫。該文庫中每個轉錄因子由3或者4個C2H2型鋅指蛋白串聯的結合域及一個效應域構成[9]。在原核生物大腸桿菌以及真核釀酒酵母中導入該人工鋅指文庫，分別篩選到對高滲透壓和乙酸耐性增強的突變菌株[10-11]。本課題組前期利用人工鋅指轉錄因子文庫轉化里氏木霉Rut-C30，獲得了里氏木霉人工鋅指突變體文庫，并從中篩選獲得一株纖維素酶高產菌U3，發(fā)現其β-糖苷酶酶活顯著升高，證明了人工鋅指轉錄因子可用于里氏木霉纖維素酶生產菌株的選育[12]。由于人工鋅指蛋白含有多樣的鋅指結構域，可識別不同的靶點序列，我們推測不同人工鋅指蛋白過表達突變體可能存在多樣的產酶調控機制，因此對更多突變體進行分析，有助于獲得里氏木霉纖維素酶合成調控更多信息，但目前相關研究還沒有報道。

本研究對轉化人工鋅指蛋白文庫獲得的里氏木霉突變體進行篩選，獲得了兩株高產纖維素酶突變株M1和M2。通過對突變株的產纖維素酶能力和關鍵纖維素降解酶基因及其調控因子轉錄分析，證明了人工轉錄因子調控纖維素酶生產的多樣性，為進一步深入研究纖維素酶合成調控機理、挖掘關鍵基因進行里氏木霉代謝工程改造，提高木質纖維素資源生物煉制效率提供了參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

里氏木霉Trichoderma reeseiRut-C30 (ATCC 56765)，本實驗室保存。

PDA固體培養(yǎng)基、生孢培養(yǎng)基、MM培養(yǎng)基、分別參考文獻[12]和[13]。葡萄糖基礎培養(yǎng)基(g/L)：MM培養(yǎng)基，葡萄糖 20，pH 4.8。纖維素酶活篩選培養(yǎng)基 (g/L)：MM培養(yǎng)基，碳源采用2%珠磨纖維素，1‰ TritonX-100，瓊脂粉 20。液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：2%纖維素，2%麩皮，MM培養(yǎng)基，pH 4.8。

1.2 主要生化試劑

染色體步移試劑盒 (Genome walking kit)、rTaqDNA聚合酶、實時定量RT-qPCR染料試劑盒及其DNA 分子量標準為寶生物TaKaRa公司產品；可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono-D-xylan為Sigma公司產品；BCA試劑盒為生工生物工程 (上海) 股份有限公司產品。

1.3 鋅指轉化子遺傳穩(wěn)定性測試

轉化子接種在無抗生素的PDA培養(yǎng)基28 ℃恒溫培養(yǎng)5–7 d，將得到的菌絲體挑出并接種在無抗生素的生孢培養(yǎng)基內，28 ℃培養(yǎng)傳代4–5次，蒸餾水洗下孢子并稀釋104–107倍后，取少量涂布于葡萄糖基礎培養(yǎng)基固體平板中，28 ℃培養(yǎng)3 d后，挑單孢子接種至含有300 μg/mL的潮霉素PDA平板，觀察菌絲生長。

1.4 液體搖瓶發(fā)酵

轉化子分別以108個孢子/L接種到葡萄糖基礎培養(yǎng)基上及液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，用于突變體產酶性能評價。

1.5 里氏木霉染色體DNA提取

真菌染色體DNA的提取采用液氮研磨法[14]。將濃度為1×108個/mL的新鮮分生孢子接種于葡萄糖基礎培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h，將菌體過濾收集，放入研缽中加入液氮進行研磨破碎，收集破碎后的少量菌體于1.5 mL離心管中加入適量抽提緩沖液，65 ℃水浴30 min，然后加入苯酚/氯仿振蕩充分混合均勻后，離心收集上清液，加入0.1倍體積的3 mol/L醋酸鈉(pH 4.8)和500 μL異丙醇，-20 ℃放置20 min后離心收集沉淀物，用70%乙醇洗滌1次，待乙醇完全揮發(fā)后加入雙蒸水溶解。

1.6 人工鋅指轉錄因子DNA片段擴增

以M1和M2突變株基因組為模板，用驗證引物進行PCR擴增。反應體系參考寶生物rTaqDNA聚合酶使用說明書。驗證引物：VE1-F 5?-TG TGAGACCATGAGCTATTATTGC-3?；VE1-R 5?-CG ACACCAACGATCTTATATCCAG-3?。

1.7 蛋白質含量測定

參考生工生物工程 (上海) 股份有限公司改良型BCA (Bicinchoninic acid) 法蛋白質濃度測定試劑盒說明，以牛血清蛋白BSA作為標準。實驗重復3次，所列出的結果為3次實驗的平均值。

1.8 濾紙酶活、內切葡聚糖酶活、木聚糖酶活測定

酶活測定參考文獻[14]。具體描述如下。

濾紙酶活 (FPase)：取1 cm×6 cm 定量濾紙條，加入1 mL醋酸緩沖液 (pH 4.8) 和0.5 mL稀釋后的粗酶液，50 ℃酶解1 h。

內切葡聚糖酶活 (CMCase)：1 mL 1%的CMC-Na溶液中加入0.5 mL稀釋后的酶液，50 ℃酶解30 min。

木聚糖酶活 (Xylanase)：1 mL 1%的燕麥木聚糖懸浮液加入0.5 mL稀釋后的酶液，50 ℃酶解30 min。

以上3種酶活測定中，均以DNS法測定還原糖量。

1.9 人工鋅指蛋白在基因組中插入位點分析

利用寶生物 (TaKaRa) 公司染色體步移試劑盒中隨機引物，通過交錯式熱不對稱PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)方法[15]將突變株基因組中人工鋅指蛋白基因插入位點側翼序列擴增，擴增條帶測序后與C30基因組序列比對，確定人工鋅指蛋白基因在染色體中插入位點。

1.10 人工鋅指蛋白基因組結合位點預測

每個鋅指α螺旋的–1、+2、+3、+6位氨基酸可與基因組DNA大溝上的特異堿基三聯體結合[16]。對突變體的人工鋅指蛋白序列進行測序，根據文獻提供的人工鋅指蛋白DNA結合域中每個鋅指可能的結合序列[9]，分析突變體的人工鋅指蛋白DNA結合域相應的可能結合序列，然后與里氏木霉Rut-C30基因組核苷酸序列進行比對 (https://genome.jgi.doe.gov/TrireRUTC30_1/TrireRUTC30_1.home.html)，找出可能的靶基因。

1.11 實時定量PCR分析 (RT-qPCR)

等量出發(fā)株和突變株新鮮孢子 (108/L) 接種于液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，分別在24 h和48 h取1 mL發(fā)酵菌絲液，10 000 r/min離心2 min收集菌體，ddH2O洗2遍后，用生工生物工程 (上海) 股份有限公司植物RNA提取試劑盒 (B518661) 提取里氏木霉RNA，經NanoDrop檢測質量和純度后，利用PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa) 將RNA反轉為cDNA用于后續(xù)RT-qPCR分析。RT-qPCR反應過程中使用tef1基因作為內參基因，表達變化分析采用相對定量2–ΔΔCt方法[17]。RT-qPCR結果用3次獨立實驗的平均值±標準差表示。使用的RT-qPCR基因檢測主要引物見表1。其中主要纖維素酶基因及其調控因子基因引物見參考文獻[12]。

所有實驗獨立重復2次，每次3個平行。統(tǒng)計分析采用t檢驗法，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

表1 本文使用的實時定量引物Table 1 Primers for the RT-qPCR analysis used in this study

2 結果與分析

2.1 高產纖維素酶突變體篩選

本課題組前期構建適用于里氏木霉表達的人工鋅指轉錄因子文庫pCB303-Lib-Zfps雙元載體(圖1A)，并導入到里氏木霉Rut-C30中，獲得約600個轉化子[12]。搖瓶培養(yǎng)發(fā)現多株突變體纖維素酶 (FPase) 濾紙酶活與出發(fā)菌株Rut-C30有差異，圖1B為有代表性的幾株不同轉化子的產酶水平比較，可見不同轉化子產酶性能的多樣性，其中酶活提高明顯的兩株分別命名為M1和M2。

2.2 纖維素酶高產株M1和M2搖瓶發(fā)酵驗證

將所篩選到的M1和M2突變株分別進行遺傳穩(wěn)定性測試，結果表明，兩株突變株傳代后在抗性平板中生長良好，遺傳性能穩(wěn)定。搖瓶復篩結果見圖2。由圖2A可以看出，發(fā)酵第6天M1和M2突變株纖維素酶濾紙酶活分別為2.5 FPU/mL和1.9 FPU/mL，較出發(fā)株Rut-C30的1.24 FPU/mL分別提高了100% 和53%。發(fā)酵第8天Rut-C30產酶增加，與M1和M2差距縮小。內切酶活性測定結果如圖2B所示，在發(fā)酵第6天，突變株M2胞外內切酶活性在3株菌中最高，比出發(fā)菌株Rut-C30的內切酶活性提高64%。同時發(fā)現M1突變株木聚糖酶活及其胞外蛋白含量較出發(fā)株Rut-C30分別提高了35%和69%，在M2突變株中分別提高12%和18% (圖2C和2D)。

圖1 雙元載體pCB303-Lib-Zfps圖譜 (A) 及里氏木霉Rut-C30突變體纖維素酶發(fā)酵產酶 (B)Fig.1 Map of the binary vector pCB303-Lib-Zfps (A) and cellulase production by the T.reesei Rut-C30 mutants (B).

圖2 里氏木霉Rut-C30和突變體纖維素酶活、胞外蛋白和生物量比較Fig.2 Comparison of cellulase activities, secreted protein and biomass for T.reesei Rut-C30 and the mutants.(A–C)FPase, CMCase and xylanase activities, respectively.(D) Total extracellular protein content.(E) Biomass determination represented by OD260 value of genomic DNA of the strains (*P<0.05; **P<0.01).(F) Transparent zone observations of T.reesei strains grown on cellulose plates for 5d.

利用DNA濃度表征菌株的生物量，3株菌株DNA量對比可見，M1突變株較出發(fā)株有明顯提高，而M2與出發(fā)株差別不大 (圖2E)。結合以上相應酶活和胞外蛋白結果，初步推測M1突變株生長更迅速，因此胞外分泌蛋白能力強；M2則是由于改變了酶系中不同酶的比例，導致濾紙酶活提高。另外，通過突變株在以微晶纖維素為碳源的雙層平板產生的透明圈大小證明M1和M2突變株較出發(fā)株Rut-C30產纖維素酶能力提高。此外，還發(fā)現M2突變株菌落形態(tài)發(fā)生改變 (圖2F)。

2.3 高產菌株M1和M2鋅指序列分析

將PCR擴增獲得的突變株M1和M2中人工鋅指蛋白序列片段測序，所對應的氨基酸序列分別命名為AZFP-M1和AZFP-M2，均為四鋅指蛋白。將其與本課題組前期篩選到的纖維素酶高產菌U3中鋅指轉錄因子AZFP-U3氨基酸序列進行對比，結果發(fā)現AZFP-M1、AZFP-M2與AZFP-U3中鋅指結合域氨基酸序列明顯不同 (圖3)。由AZFP-M1和AZFP-M2的鋅指氨基酸序列分析推測 AZFP-M1在基因組中潛在結合位點為5′-GTCNGGGAWGTC-3′ (N代表A，C，G或者T；W代表A或者T)，而AZFP-M2潛在結合位點為5′-GTTGYAHGAGGG-3′ (Y代表C或者T；H代表A，C或者T)。分別將上述人工鋅指轉錄因子12 bp核苷酸序列與里氏木霉Rut-C30基因組核苷酸序列進行比對，結果發(fā)現AZFP-M1可能結合在8個基因啟動子區(qū) (距離ATG<1 600 bp)、35個基因ORF區(qū)域。AZFP-M2可能結合在15個基因的啟動子區(qū)域 (距離ATG<1 600 bp)、6個基因的ORF區(qū)。推測不同鋅指轉錄因子識別不同靶基因，以不同方式調控纖維素酶生產。

2.4 人工鋅指轉錄因子在菌株M1和M2基因組中插入位點分析

經過3輪PCR確定Azfp-M1和Azfp-M2基因片段在基因組中整合位點均位于里氏木霉Rut-C30染色體 Scaffold 1: TrireC30_4597和TrireC30_67627兩個基因間隔區(qū)，這兩個基因方向相反，且該區(qū)域不存在基因啟動子或終止子(圖4B)。整合位點分析表明，人工鋅指轉錄因子的引入未影響里氏木霉Rut-C30內源基因的表達。因此，M1和M2突變株產酶能力不同由不同人工鋅指轉錄因子的表達引起，而非整合位點差異所致。

2.5 人工鋅指轉錄因子對突變株纖維素降解酶合成主要基因轉錄影響

圖3 纖維素酶高產菌株M1和M2人工鋅指轉錄因子氨基酸序列分析Fig.3 Alignment of the amino acid sequences of the AZFP-binding domains from the T.reesei U3, M1 and M2 mutants.

圖4 人工鋅指轉錄因子序列在里氏木霉突變體基因組中的整合位點分析Fig.4 Tail-PCR analysis of the Azfp insertion site in the two mutants.(A) Gel electrophoresis analysis for products of three TAIL-PCR reactions from the genomes of the M1 and M2 mutants.(B) Sequence analysis of the T-DNA integration site in the two mutants.Lane 1–3 represented the products of three TAIL-PCR reactions, respectively.

圖5 突變體中主要纖維素降解酶、轉錄因子及預測靶基因轉錄水平與對照菌株的比較Fig.5 Comparison of transcription levels of the key genes encoding cellulolytic enzymes (A), transcription factors (B), as well as the predictive target genes (C–D) in the M1 and M2 mutants comparing with that of the control strain.* P<0.05; ** P<0.01.

從突變株搖瓶發(fā)酵中的纖維素酶、半纖維素的酶活水平看出，人工鋅指轉錄因子直接或間接參與調控纖維素降解酶合成。進一步分析了人工鋅指轉錄因子對纖維素降解酶基因及其轉錄因子的影響。結果如圖5A所示，產酶培養(yǎng)48 h，突變株M1和M2纖維二糖水解酶 (cbh1和cbh2)、內切葡聚糖酶 (egl1和egl2) 基因轉錄較出發(fā)株上調1.6倍以上。培養(yǎng)24 h，M1突變株中β-葡萄糖苷酶 (bgl1)、木聚糖酶 (xyn1和xyn2) 基因較出發(fā)株C30分別提高了2.5、4.3和3.2倍，而M2突變株卻與之相反，這與搖瓶發(fā)酵酶活測量水平一致。同時，相比出發(fā)株Rut-C30，鋅指轉錄因子突變株M1和M2中已知的纖維素酶抑制調控因子ace1轉錄水平在48 h分別下調2.6和2.0倍。主要的纖維素酶激活因子xyr1在M1突變體培養(yǎng)48 h明顯上調，達到7.0倍，但在M2中未發(fā)現明顯變化 (圖5A和5B)。

對預測的人工鋅指轉錄因子可能結合的靶基因轉錄水平進行分析。通過與Rut-C30對比，M1突變株預測的8個基因中，Tr_75235轉錄水平有明顯上調，而Tr_35757則有明顯下調 (圖5C)。M2突變株Tr_10530和Tr_124264轉錄水平有明顯下調 (圖5D)。未來對這些潛在的靶基因進行分析，研究其表達水平的差異與纖維素降解酶合成的關系，有希望發(fā)現新的產酶調控機理，鑒定代謝工程改造的新靶點基因。綜上所述，人工鋅指轉錄蛋白 (AZFP) 參與纖維素酶和半纖維素酶基因合成調控，并且不同人工鋅指轉錄因子調控機制存在差異，提示了人工鋅指蛋白調控機理的多樣性。

3 討論

高產纖維素酶工業(yè)菌株的育種對纖維素酶的生產成本節(jié)約至關重要。人工轉錄因子是人為構建的，有可能以新的機制調控纖維素酶合成。目前國內外研究普遍關注利用內源轉錄因子的遺傳操作提高產酶，如國內學者利用里氏木霉Rut-C30內源多個纖維素酶轉錄因子結合域和激活域進行重新組裝后導入菌株，獲得了一株纖維素酶和半纖維素酶高產轉化子菌株4C4[18]。本課題組將人工鋅指轉錄因子技術應用于里氏木霉育種領域，通過構建外源人工鋅指轉錄因子突變體文庫，成功篩選到一系列纖維素酶產量提高的里氏木霉工程菌。我們使用的人工鋅指蛋白具有多種來源的鋅指結構域，有可能識別不同的靶基因，產生多樣的調節(jié)效果[9]。

本研究從前期課題組構建的里氏木霉人工鋅指轉錄因子 (AZFP-TFs) 突變體文庫中篩選到兩株纖維素酶高產突變株M1和M2。液體搖瓶發(fā)酵結果顯示，突變株M1由于生長旺盛進而外泌蛋白量增加導致總體纖維素酶產量提高，M2則內切酶增加從而提高纖維素酶活。而之前篩選的U3突變體則是由于β-葡萄糖苷酶活力的提高從而影響整體纖維素酶活力[12]，體現了人工鋅指蛋白調控產酶的多樣性。AZFP-M1預測結合的靶基因共有43個，其中結合在啟動子區(qū)域的有8個基因，結合在ORF區(qū)域的有35個基因。而AZFP-M2預測結合靶基因共有21個，其中結合在啟動子區(qū)域的有15個基因。對所鑒定的人工鋅指蛋白可能結合的靶基因進行分析，在AZFP-M1結合在啟動子區(qū)域的8個基因中，僅有Tr_33190編碼蛋白被預測具有轉運功能，其余均為未知蛋白。但Tr_33190在M1菌株中轉錄量較出發(fā)株并沒有明顯差異，推測可能不參與AZFP-M1對纖維素酶合成調節(jié)。而在AZFP-M2所結合在啟動子區(qū)域的15個靶基因中，共有10個基因被注釋。Tr_84925和Tr_10530被預測可編碼轉錄因子功能蛋白，但在里氏木霉中其功能未知。M2突變株中基因Tr_10530轉錄量有明顯下調，推測其可能與纖維素酶合成有關。并且發(fā)現人工鋅指轉錄因子AZFP-M2可能結合在bgl1基因ORF區(qū)域，因此有可能阻礙bgl1基因轉錄，這可能與M2突變株中β-葡萄糖苷酶活力降低有關，有待進一步實驗驗證。轉錄因子BglR在兩個突變體均下調，該蛋白可以特異調控除胞外β-葡萄糖苷酶bgl1基因以外的其他β-葡萄糖苷酶類基因轉錄，有報道在纖維二糖培養(yǎng)基中，BglR的缺失會提高纖維素酶產量[19]，但突變體酶活上升是否與BglR下調有關有待實驗驗證。我們還發(fā)現突變體M2中內切酶轉錄改變，但目前還不清楚里氏木霉中是否存在特異調控內切酶表達的調控因子，人工鋅指蛋白AZFP-M2可能對該調控因子進行直接或者間接調控，進而提高CMC酶活，也有可能直接結合在內切酶啟動子上游調控CMC酶活。對人工鋅指蛋白靶基因的研究，有助于進一步揭示絲狀真菌纖維素酶合成調控的分子機制，從而開發(fā)更有效的代謝工程改造技術。

絲狀真菌纖維素酶的合成調控網絡很復雜，仍有非常多纖維素酶調控因子的功能不明晰，有待發(fā)掘[20]。隨著里氏木霉纖維素酶合成調控的深入研究，新的轉錄因子不斷被發(fā)現。例如，國內學者通過與構巢曲霉中鈣響應轉錄因子CrzA序列對比，在里氏木霉中找到了其同源蛋白Crz1，并證明鈣響應鋅指轉錄因子Crz1可直接調控纖維素酶合成[21]。本課題組對人工鋅指蛋白突變體進行分析，發(fā)現T.reesei轉錄因子Vib-1過表達可促進纖維素酶生產[22]。本文對M1和M2突變株中人工鋅指轉錄因子可能結合的靶基因進行轉錄水平分析，發(fā)現個別靶基因的轉錄量發(fā)生了明顯上調或者下調 (圖5C和5D)，后續(xù)我們將對突變體中人工鋅指蛋白的直接作用靶點進行實驗驗證，并在此基礎上深入研究里氏木霉纖維素酶的合成調控。另外，由于本實驗中所采用Ppki啟動子在已報道的啟動子中屬于弱啟動子[23]，可能導致人工鋅指蛋白表達水平較低。改變啟動子強度，進而改變人工鋅指轉錄因子的表達水平，有可能影響關鍵調控基因和酶基因的表達水平，從而得到產酶性能不同的菌株。文獻報道我國學者在草酸青霉中通過理性設計同時過表達XlnR和ClrB纖維素酶轉錄激活因子和敲除主要抑制轉錄因子CreA，獲得較出發(fā)株濾紙酶活提高8.9倍的纖維素酶高產菌[24]，因此，多基因協(xié)同控制有可能進一步提高產酶效率。后續(xù)工作中我們將嘗試不同人工轉錄因子在同一個菌株中進行組合優(yōu)化，希望達到更優(yōu)良的調控效果。本文工作結果為進一步研究里氏木霉纖維素酶合成調控網絡，進而進行代謝工程改造提高產酶提供了參考。