王香玲，李嫻，何火聰，李玲玲，呂迪，陳翠煌，葉小強，劉樹滔，潘劍茹

1 福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州 350108

2 福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院/福建省腫瘤醫(yī)院放射生物學及腫瘤放射治療學研究室，福建 福州 350014

3 福建省科技廳轉化醫(yī)學重點實驗室，福建 福州 350014

病程相關 (PR) 蛋白是宿主植物因各類病原體 (例如病毒、細菌和真菌) 誘導產生的一類蛋白質[1]。目前根據(jù)生物學活性、物理化學性質及序列同源性將PR蛋白分類為17個家族 (PR-1至PR-17)[2-3]。PR-10家族蛋白屬于其中一個類別，廣泛地存在于不同單、雙子葉植物中[4]，該家族又被稱為多基因家族，例如豌豆中存在至少5種PR-10基因，麝香中有18種Mal d 1基因[5]等。據(jù)報道PR-10蛋白質是多功能蛋白，主要參與植物病原體入侵的防御反應以及各種生物和非生物脅迫的應答反應，但家族成員間沒有統(tǒng)一的生物學功能[1]。

研究表明，大多數(shù)PR-10蛋白是一類分子量小 (15–18 kDa)、酸性、結構相似且與核糖核酸酶同源的胞內蛋白[4]。最早從人參中分離出具有核糖核酸酶活性的PR-10蛋白為IPR 1和IPR 2[6-7]。類似地，從白羽扇豆根中分離的LaPR-10蛋白具有核糖核酸酶活性[8]。

當歸[Angelica sinensis (Oliv.) Diels]是傘形科當歸屬的一種生多年草本植物。其干燥的貯藏根是我國一味常用的中藥材，素有“十方九歸”之說。性溫，味甘、辛；歸肝、心、脾經；具有補血活血、調經止痛、潤腸通便的功能[9-10]?，F(xiàn)有研究結果表明，當歸多糖能有效地改善高脂飲食小鼠的脂肪肝并維持體內葡萄糖平衡[10-11]；當歸揮發(fā)油對高血脂小鼠動脈粥樣硬化具有一定的保護作用[12]；阿魏酸是較早被分離和鑒定的當歸有效成分，也是當歸有機酸主要成分之一，能抗動脈粥樣硬化[9,13-14]。雖然目前關于當歸多糖和當歸藥效小分子已有很多研究，但對于當歸中重要的高分子化合物——蛋白質的研究卻很少。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)當歸中蛋白含量較為豐富，且當歸總蛋白具有清除DPPH自由基能力，可促進人正常肝細胞L02增殖[15]。

本課題組近期發(fā)現(xiàn)初步純化的當歸低分子量蛋白AP可顯著改善小鼠的急性放射損傷[16]，且在當歸鮮根中也存在PR-10家族蛋白[17]。本研究對當歸生藥中的AP蛋白進行了進一步純化，首次從當歸生藥中純化得到兩種PR-10蛋白亞型(命名為ASPR-C-1和ASPR-C-2)，并對二者的理化性質進行了表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當歸生藥購自甘肅省岷縣琪祥閣食品專營店。蛋白分子量marker購自美國Thermo公司。酵母tRNA購自上海寶曼生物科技有限公司。BCA蛋白含量測定試劑盒選購自美國Thermo公司。Sephadex G-50填料購自美國GE公司。DEAE Sepharose Fast Flow填料購自Pharmacia Biotech公司。其余試劑均為分析純。

1.2 當歸蛋白的制備與純化

1.2.1 制備當歸蛋白粗提液

將12.96 g當歸生藥切成片狀，加入10倍體積 (即130 mL) Tris-HCl緩沖液 (0.05 mol/L，pH 8.0)，4 ℃靜置過夜，次日用4層紗布過濾，濾液于12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清 (蛋白粗提液)，測定其蛋白含量和核糖核酸酶活力。

1.2.2 硫酸銨一步沉淀

將61.71 g硫酸銨加入蛋白粗提液 (110 mL)進行硫酸銨一步沉淀 (0–80%) (即561 g/L)，沉淀過夜后于12 000 r/min、4 ℃離心10 min。收集沉淀，將沉淀溶于2倍體積的Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH 8.0) 中，12 000 r/min、4 ℃離心10 min取上清 (當歸生藥蛋白粗提液)，測定其蛋白含量和核糖核酸酶活力。

1.2.3 凝膠過濾層析分離

將當歸生藥蛋白粗提液流經以Tris-HCl緩沖液 (0.05 mol/L，pH 8.0) 預先平衡的Sephadex G-50層析柱 (3 cm×105 cm)，流速為0.25 mL/min，收集第二個洗脫峰 (P2)，測定其蛋白含量和核糖核酸酶活力，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 弱陰離子交換柱分離

將樣品 (P2) 上柱于用 Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.3) 預先平衡的DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱 (2.5 cm×10 cm)，流速為1 mL/min，收集穿透峰 1 (C1)、穿透峰 2 (C2)，直至OD280<0.035，最后以含1 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液 (0.05 mol/L，pH 7.3) 洗脫結合的雜蛋白，分別測定穿透峰1和穿透峰2的蛋白含量和核糖核酸酶活力，并于4 ℃保存。

1.3 PAGE和SDS-PAGE

PAGE分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%；SDS-PAGE分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為4%。以考馬斯亮藍R-250染色鑒定蛋白，結合PAGE和SDS-PAGE結果檢測蛋白純度；用高碘酸-希夫 (PAS) 染色鑒定糖蛋白[18]；以Carestream MI SE 軟件通過還原與非還原條件下 (即有無β-巰基乙醇) SDS-PAGE結果計算蛋白質分子量。

1.4 蛋白質及糖基含量測定

以BCA試劑盒測定粗提液和每一步純化得到的當歸蛋白的蛋白含量。以蒽酮硫酸法測定蛋白中糖基含量[19]。

1.5 質譜鑒定

相關蛋白經PAGE電泳后，剪下膠上對應目的蛋白質的條帶，送至復旦大學蛋白質組學研究中心使用MALDI-TOF-TOF? (AB SCIEX) 進行質譜鑒定，并用GPS Explorer (V 3.6) 數(shù)據(jù)庫檢索分析。

1.6 核糖核酸酶活性的活性表征

1.6.1 核糖核酸酶活力測定

1.6.2 反應pH的影響

以酵母tRNA為底物，使用緩沖體系 (0.1 mol/L磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液，pH 3.0–7.0；0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.0–8.0) 分別將兩種蛋白調至pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。按照本文方法1.6.1，在37 ℃反應15 min測定蛋白的核糖核酸酶活性。以最適pH條件下的酶活性為100%，計算各處理的相對酶活性。

1.6.3 反應溫度的影響

以酵母tRNA為底物，將兩種蛋白分別調至其最適pH，然后分別在溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下反應15 min，測定蛋白的核糖核酸酶活性。測定方法參照本文方法1.6.1，以最適溫度條件下的酶活性為100%，計算各處理的相對酶活性。

1.6.4 溫度穩(wěn)定性研究

將ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白分別在常溫(25 ℃)、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃下水浴30 min，待樣品冷卻至室溫，4 ℃離心 (12 000 r/min，5 min)取上清，以酵母tRNA為底物，分別于最佳反應條件下測定當歸蛋白核糖核酸酶活性。測定方法參照本文方法1.6.1，兩種蛋白均以其最適反應條件下的酶活性為100%，計算各處理的相對酶活性。

1.6.5 金屬離子、螯合劑、表面活性劑和還原劑等對ASPR-C-1和ASPR-C-2酶活性的影響

過腔的特征主要有音調的依附性、或0性（即可去過腔）、音樂材料的以主調和級音為主性、構式的多樣性、音數(shù)的不定性、起音的眼位性、樂音進行的級進性、節(jié)奏的頓逗性等。下面僅以音調的依附性、音數(shù)的不定性、結構的類型性和構式的多樣性三點為例。

各種試劑對ASPR-C-1和ASPR-C-2酶活性的影響是分別在最適反應體系中加入含1 mmol/L(終濃度) 的金屬離子 (Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ag+、Cu2+、Fe2+)、螯合劑EDTA、蛋白還原劑DTT和表面活性劑SDS下測定當歸蛋白核糖核酸酶活性。測定方法參照本文方法1.6.1，兩種蛋白均以其最適反應條件下的酶活性為100%，計算各處理的相對酶活性。

2 結果與分析

2.1 當歸蛋白的純化

110 mL當歸生藥蛋白粗提液經過80%硫酸銨沉淀后，復溶，離心取上清，進行Sephadex G-50凝膠過濾層析，收集Sephadex G-50第二峰 (P2)，色譜及SDS-PAGE結果如圖1所示。由圖1B可知，P2峰中含有分子量約為17 kDa蛋白，在PAGE中顯示為兩條條帶 (圖2B)。

圖1 當歸生藥蛋白粗提液的Sephadex G-50凝膠過濾層析圖譜 (A) 與SDS-PAGE分析 (B)Fig.1 Sephadex G-50 gel filtration chromatography (A) and SDS-PAGE (B) of crude extracts of Angelica sinensis.M:protein weight markers; 1: P2 fractions.

圖2 P2組分的DEAE-Sepharose陰離子交換柱圖譜 (A) 與PAGE分析 (B)Fig.2 DEAE-Sepharose chromatography (A) and PAGE (B) of P2 fractions.P2: P2 fractions; 58–188: fractions of DEAE-Sepharose chromatography.

將Sephadex G-50第二峰進行DEAE-Sepharose弱陰離子交換層析，分別收集穿透峰1 (67–82管，C1) 和穿透峰2 (88–121管，C2)，其色譜結果和PAGE分析結果如圖2所示。由圖2B可知，DEAE-Sepharose可將PAGE上對應的兩種蛋白分離開，穿透峰1 (C1) 和穿透峰2 (C2) 均為PAGE純的蛋白，將其分別命名為ASPR-C-1和ASPR-C-2。為進一步驗證其純度，分別取兩個峰的組分進行SDS-PAGE分析，結果如圖3A所示，由圖可知，ASPR-C-1 (泳道1) 和ASPR-C-2 (泳道2) 在還原條件下為SDS-PAGE純的組分。兩種蛋白的純化過程如表1所示，ASPR-C-1比活力為73.69 U/mg，純化倍數(shù)為5.35，ASPR-C-2酶的比活力為146.68 U/mg，純化倍數(shù)為10.64。

2.2 蛋白二聚體和糖基分析

如圖3所示，ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白在還原條件下經Carestream MI SE 軟件計算得出分子量分別為17.33 kDa和17.18 kDa。在非還原條件下，ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白都出現(xiàn)了少量高分子量條帶，分子量分別為35.66 kDa和35.32 kDa，是ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白分子量的2倍，可知高分子量的蛋白是ASPR-C-1和ASPR-C-2在溶液中部分聚集所形成的二聚體。

表1 兩種蛋白亞型的純化表Table 1 Purification summary of two isoforms.

圖3 兩種蛋白亞型的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of two isoforms.(A) SDS-PAGE of the isoforms with β-mercaptoethanol.(B) SDS-PAGE of the isoforms without β-mercaptoethanol.(C) PAS staining of the isoforms.M: protein weight marker, 1: ASPR-C-1, 2:ASPR-C-2.

如圖3C所示，ASPR-C-1和ASPR-C-2蛋白在SDS-PAGE上的條帶經PAS染色后均呈紫紅色，表明兩種蛋白均為糖蛋白。經蒽酮硫酸法檢測，ASPR-C-1和ASPR-C-2糖基含量分別為2.6%和8.2%。

2.3 質譜鑒定

對純化的當歸生藥蛋白進行AB SCIEX 5800 TOF/TOF質譜分析，得到其肽指紋圖譜 (PMF，并將PMF質荷比為1 861.69 (ASPR-C-1)、952.52(ASPR-C-2) 的肽段作為母離子進行MALDI-TOF-MS(AB SCIEX) 二級質譜分析，用Masoct軟件搜索NCBI nr 蛋白質數(shù)據(jù)庫，鑒定結果如表2所示。由表2結果可知，與ASPR-C-1最為匹配的蛋白是來自胡蘿卜Daucus carota的分子量為16 508 Da、得分為100、登錄號為gi/18652047的Dau c 1.0201蛋白。同樣的，與ASPR-C-2相匹配的除了與ASPR-C-1相似的major allergen isoform Dau c 1.0201蛋白外，還有來自芹菜Apium graveolens的分子量為17 079 Da、得分為102、登錄號為gi/14423646的Api g 1蛋白和同樣來自Apium graveolens、登錄號為gi/1769847的Api g 1.0201。這些蛋白均屬于PR-10家族蛋白。由此可知ASPR-C-1和ASPR-C-2均為PR-10類蛋白，是當歸PR-10蛋白的兩個亞型。

表2 ASPR-C-1和 ASPR-C-2質譜分析結果Table 2 Mass spectrometry analysis results of ASPR-C-1 and ASPR-C-2

2.4 ASPR-C-1和ASPR-C-2的酶學性質研究

2.4.1 反應pH的影響

圖4所示的pH-活性曲線的結果表明，ASPR-C-1在pH 5.8左右相對酶活性最高，在pH 4.0–5.8之間，該酶相對酶活性隨pH的增加而快速增加，pH 5.8–7.0之間，該酶相對酶活性隨pH的增加反而急劇減少，當pH＜4.0或pH＞7.0時，其活性變化緩慢，該酶的相對酶活性均不到30%。反應pH 對ASPR-C-2核糖核酸酶活性的影響與ASPR-C-1的相似，但ASPR-C-2的最適反應pH為5.5。

2.4.2 反應溫度的影響

圖4 兩種蛋白亞型核糖核酸酶活性的最適pHFig.4 The optimum pH of the ribonuclease activity of two isoforms.

圖5 兩種蛋白亞型核糖核酸酶活性的最適溫度Fig.5 The optimum temperature of the ribonuclease activity of two isoforms.

分別在最適pH的條件下進一步研究反應溫度對兩種蛋白核糖核酸酶活性的影響，結果如圖5所示。當反應溫度為30–50 ℃時，ASPR-C-1的相對酶活性隨反應溫度的增高而增加，當反應溫度達到50 ℃時，該酶的相對酶活性最高，當反應溫度繼續(xù)增大時，ASPR-C-1的相對酶活性反而隨著溫度的增高而降低。ASPR-C-2酶活性的最適反應溫度為60 ℃，反應溫度低于或高于60 ℃都會使其相對酶活性下降。

2.4.3 溫度穩(wěn)定性研究

在兩種蛋白的最適pH與最適溫度下，兩種蛋白的核糖核酸酶活性的熱穩(wěn)定性如圖6所示。實驗結果表明，兩種蛋白在60 ℃下均有最佳的穩(wěn)定性。其中ASPR-C-1在30–70 ℃保持15 min后剩余酶活性均大于50%，但是當溫度超過70 ℃后，剩余酶活力急劇下降，表明ASPR-C-1在30–70 ℃時有較好的熱穩(wěn)定性；而ASPR-C-2在20–100 ℃保持15 min后剩余酶活性均大于50%，且在50–100 ℃的剩余酶活力均大于80%，表明ASPR-C-2在20–100 ℃時有較好的熱穩(wěn)定性活性。比較二者而言，ASPR-C-2具有良好的熱穩(wěn)定性，100 ℃處理后仍余80%以上活力。

2.4.4 金屬離子、螯合劑、表面活性劑和還原劑等對ASPR-C-1和ASPR-C-2酶活性的影響

圖6 兩種蛋白亞型核糖核酸酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 The thermal stability of the ribonuclease activity of two isoforms.

圖7 金屬離子、螯合劑、表面活性劑和還原劑等對ASPR-C-1和ASPR-C-2酶活性的影響Fig.7 Influence of metal ions, chelating agent,surfactant and protein reducing agent on ribonuclease activity of ASPR-C-1 and ASPR-C-2.EDTA: elhylene diamine tetraacetic acid; SDS: sodium dodecylsulphate;DTT: dithiothreitol.

如圖7所示，F(xiàn)e2+對ASPR-C-1和ASPR-C-2的核糖核酸酶活性有激活作用，分別使ASPR-C-1和ASPR-C-2的相對酶活性提高近60%和70%。而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對二者的酶活性顯示輕微抑制作用，二者在這四種離子下相對酶活性均保留在80%以上。但二者的酶活性受Ag+、Cu2+、EDTA和SDS的抑制程度較強，特別是ASPR-C-1在有DTT存在下相對酶活性僅剩15%，而ASPR-C-2有50%的酶活性殘留。

3 討論

本研究中通過硫酸銨一步沉淀 (0–80%)、Sephadex G-50凝膠過濾層析和DEAE-Sepharose陰離子交換柱三步純化從當歸生藥中分離純化得到ASPR-C-1和ASPR-C-2兩種蛋白，經質譜測序鑒定均為PR-10類蛋白，得率分別為16.44%和39.13% (圖1，圖2，表1)。兩種蛋白在SDS-PAGE中分子量分別為17.33 kDa (ASPR-C-1)和17.18 kDa(ASPR-C-2) (圖3A)，與已報道的大多數(shù)PR-10蛋白的分子量相似[21-26]。

PR-10蛋白通常以單體形式存在，但也有一些例外。例如豆薯Pachyrrhizus erosus中的PR-10蛋白質 SPE-16[27]、黃芪 AmPR-10[26]和綠豆CSBP[28]在溶液中均為同二聚體，人參PgPR-10.1和PgPR-10.2蛋白在溶液中既能以同二聚體形式存在，又能因為相互作用彼此間形成異二聚體[29]，樺樹花粉過敏原Bet v 1在溶液中則既以單體存在又能形成二聚體[30]。

由于凝膠過濾層析Sephadex G-50分級分離的范圍為1.5–30 kDa，本研究中所得的G-50第二峰中的蛋白分子量應低于30 kDa，但最終該峰中除了存在17 kDa左右的蛋白還存在35 kDa左右的蛋白 (圖1B)，由于后者的分子量為前者的兩倍，可知后者應該為前者在溶液中形成的二聚體。最終純化得到的蛋白的SDS-PAGE分析結果(圖3B) 也證實了這一點，兩種當歸生藥PR-10蛋白在溶液中的存在形式與樺樹花粉過敏原Bet v 1類似，在溶液中主要以單體形式存在，但會部分形成二聚體[30]。

在已發(fā)現(xiàn)的植物PR-10家族的蛋白中具有糖基化的只有黃芪AmPR-10，糖基含量為13.7%[26]，本課題組發(fā)現(xiàn)，源于當歸的PR-10蛋白也是糖蛋白，且源于當歸生藥的兩種PR-10蛋白 (糖基含量分別為2.6%和8.2%) 比鮮根中的PR-10蛋白[17]糖基含量高。

PR-10家族蛋白具有多種功能，其中核糖核酸酶活力是許多PR-10蛋白共同具有的生物學功能，例如黃芪AmPR-10[24]、羽扇豆根LaPR-10[8]、棉花GaPR-10[23]、豆薯中的 SPE16[24-27]、辣椒CaPR-10[25]等均具有核糖核酸酶活性。本研究純化得到的兩種當歸生藥PR-10蛋白也具有核糖核酸酶活性，與同為糖基化蛋白的黃芪AmPR-10蛋白 (74.11 U/mg)[22]相比，ASPR-C-1的比活(73.60 U/mg) 與之相當，ASPR-C-2的比活(146.76 U/mg) 是其近2倍 (表1)。當歸生藥PR-10蛋白也比當歸鮮根中的PR-10蛋白具有更高的核糖核酸酶活性。當歸生藥PR-10蛋白核糖核酸酶活性的最適pH相近，均為5.6左右，但二者的最適溫度不同，ASPR-C-1的為50 ℃，ASPR-C-2的為60 ℃ (圖4，圖5)。與ASPR-C-1以及當歸鮮根中的PR-10蛋白[17]相比，當歸生藥中的ASPR-C-2具有最佳的耐熱性能，在50–100 ℃熱處理后的剩余酶活力均大于80% (圖6)。

不同金屬離子、螯合劑和表面活性劑、還原劑對PR-10蛋白的核糖核酸酶的影響有顯著差異。有研究表明Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、EDTA、Cu2+、Ag+和SDS對玉米Zm PR10和Zm PR10.1有輕微的抑制活性[31]，但Cu2+、Ag+對黃芪AmPR-10有強烈的抑制活性[26]。在本研究中，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對二者的活性都輕微抑制作用，Cu2+、Ag+、EDTA、DTT和SDS對二者酶活性的抑制程度較強。而Fe2+對二者的核糖核酸酶活性有明顯的激活作用 (圖7)。

當歸中不同PR-10蛋白PR-10蛋白核糖核酸酶活性的酶學參數(shù)及穩(wěn)定性的差異可能源于二者不同的氨基酸組成及糖基含量。未來將進一步測定當歸中不同PR-10蛋白的全序列、三維結構及生物學功能，以進一步揭示當歸中不同PR-10蛋白之間的結構與功能的異同點。