蔣鵬飛，王 英，潘 坤，彭 俊，徐 劍＊＊，彭清華1,＊＊

（1.湖南中醫(yī)藥大學 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 長沙 410007；3.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室 長沙 410208）

視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa，RP）是一組以進行性感光細胞及色素上皮功能喪失為共同表現(xiàn)的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，根據(jù)不同的遺傳學方法，視網(wǎng)膜色素變性可以分為常染色體顯性[1]、常染色體隱性[2]、X連鎖[3]等。視網(wǎng)膜色素變性在世界各國的發(fā)病率在1/5000-1/3000之間，是最常見的遺傳性危害眼底致盲的眼病之一。大多數(shù)視網(wǎng)膜色素變性患者在青少年時期發(fā)病，發(fā)病時隱匿，主要臨床特征為夜盲、進行性視野缺損、眼底的特征性改變以及視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）異常[4]，晚期僅殘留中央管狀視野，嚴重影響患者生活質量，若不及時治療，病情將持續(xù)發(fā)展[5]。大多數(shù)學者認為RP的視力損傷機制與視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡有關[6]。本研究以經(jīng)典模型鼠視網(wǎng)膜色素變性皇家外科學院(Royal College Surgeons，RCS)（rdy-/,p-/-）大鼠為研究對象，通過觀察益氣明目丸對RCS（rdy-/,p-/-）大鼠視網(wǎng)膜各層結構、凋亡相關基因Bcl-2相關X蛋白（Bcl2-Associated X protein，Bax）mRNA與天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase3，Caspase-3）mRNA的表達的影響，探討益氣明目丸治療RP的可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級1.5月齡RCS大鼠24只（質量合格證號：NO.201614068，蘇州昭衍新藥研究中心有限公司），體重75-130 g，其中16只RCS(rdy-/-，p-/-）大鼠，8只RCS（rdy+/+,p+/+）大鼠，兩種大鼠均雌雄各半，飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學實驗樓動物實驗中心SPF級實驗房，濕度50-55%，室溫23±2℃，自由進食進水，每3-4天更換一次墊料。本研究中使用的RCS(rdy-/-，p-/-）大鼠為已造模成功（視網(wǎng)膜色素變性大鼠模型）的大鼠，無需再次造模。

1.2 主要儀器設備和手術器材

電泳儀（北京六一儀器廠）、輪轉石蠟切片機（徠卡）、數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（深圳市沅恒科技有限公司）、-80°超低溫冰箱（中科美菱）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、低溫臺式高速離心機（赫西儀器裝備有限公司）、超微量分光光度計（美國nanodrop）、PCR儀（德國Biometra）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）、微量移液器（德國eppendorf）、垂直板電泳槽（北京六一儀器廠）、臺式高速冷凍離心機（Thermo）、水平電轉槽（北京六一儀器廠）、超純水儀（millipore公司）、紫外可見分光光度計（上海spectrum公司）、恒溫搖床（金壇）、水平搖床（北京六一儀器廠）、壓片夾（koda）、掃描儀（日本Canon）。

1.3 主要藥品和試劑

益氣明目丸（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，湘藥制字Z20080745）由黨參10 g、黃芪15 g、白術10 g、菟絲子15 g、山藥10 g、茯苓10 g、黃精15 g、北柴胡10 g、葛根10 g、丹參15 g、當歸10 g、三七粉7 g、甘草3 g組成，按現(xiàn)代制劑工藝制成小丸劑，每瓶120 g。

水合氯醛（湖南中醫(yī)藥大學病理實驗室，國藥準字H37022673）、Harris蘇木素（湖南中醫(yī)藥大學病理實驗室，批號：71020784）、PV9000型二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司，批號：zb-5301）、細胞裂解液（江蘇碧云天，批號：P0013）、RIPA蛋白裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G2002）、ECL發(fā)光試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G2014）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天，批號：P0006）、脫脂奶粉（伊利公司，批號G5002）、轉移緩沖液（武漢賽維爾生物科技有限公司，G2017）、羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB23303）。

2 實驗方法

2.1 分組方法

將8只RCS（rdy-/,p-/-）公鼠依次編為1-8號，通過隨機數(shù)字表法：從隨機數(shù)字表第3行第5個數(shù)開始抄錄8個數(shù)（84、51、67、47、97、19、98、40），令單數(shù)劃入模型組，雙數(shù)劃入益氣明目丸組，隨機分為2組：模型組公鼠（4只）和益氣明目丸組公鼠（4只）；將8只RCS（rdy-/,p-/-）母鼠依次編為9-16號，同樣方法分為2組：模型組母鼠（4只）和益氣明目丸母鼠（4）只，使模型組與益氣明目丸組大鼠雌雄各半?？瞻捉M：RCS（rdy+/+,p+/+）大鼠（8只）。

2.2 干預方法及療程

大鼠購回后予適應性飼養(yǎng)1周后進行灌胃，灌胃時間為30天，每日灌胃一次，灌胃藥物為益氣明目丸。按照“人-動物體表面積等效劑量比值表”折算實驗動物的給藥劑量，折算公式：W*成人用量（g）/動物體重（kg），折算系數(shù)W=0.018，每組灌胃藥物詳情如下：模型組和空白組的灌胃藥物為0.9%生理鹽水，其劑量按照12 mL/kg·d計算；益氣明目丸組的灌胃藥物為益氣明目丸懸濁溶液，灌胃劑量按7.8 g/·kg-1的混懸液（0.156 g·mL-1）計算。溶液配制方法為相當于7.8 g益氣明目丸粉末與50 mL滅菌蒸餾水混合，室溫搖勻。每日灌胃一次。實驗過程中對動物的處置符合2006年國家科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定。

2.3 取材方法

于灌胃第30天結束后第1天取材。用10%水合氯醛3.5 mL·kg-1腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，迅速摘取兩只眼球，斷頸處死老鼠。從每組RCS大鼠眼球中選取一只眼球固定于4%多聚甲醛溶液中，備行HE染色和免疫組化檢測。剩下另只眼球置于冰塊上，在顯微鏡下用眼科顯微器械仔細去除眼前節(jié)及玻璃體等多余組織，小心分離視網(wǎng)膜組織后，將其置于EP管內，保存于-80℃冰箱中，備行WB及PCR檢測BaxmRNA、Caspase-3mRNA的表達。

表1 引物序列表

表2 加入試劑名稱及數(shù)量

表3 加入冷卻反應液中的試劑及數(shù)量

2.4 指標檢測

2.4.1 HE染色觀察標本視網(wǎng)膜各層結構的形態(tài)學變化

經(jīng)脫水浸蠟、二甲苯溶液脫蠟、無水乙醇洗蠟、乙醇浸泡、自來水洗、蘇木素染色、乙醇鹽酸分色、伊紅染色、乙醇分色脫水、二甲苯溶液透明、中性樹膠封片等步驟，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.2 RT-qPCR法檢測RCS大鼠視網(wǎng)膜BaxmRNA、Caspase-3mRNA的表達

（1）參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列下載基因序列，用primer premier 6.0進行引物設計，設計的引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，具體引物序列如表所示（表1）；（2）提取總RNA：①處理實驗器皿：浸泡、高溫高壓滅菌；②總RNA的提?。簞驖{、離心、去上清液、晾干、入DEPC水溶解RNA；③等到RNA沉淀完全溶解后，用凝膠電泳進行檢測，放在-20℃的環(huán)境中保存。（3）測RNA濃度與純度；（4）逆轉錄cDNA：①解凍反應液，混勻，離心，置于冰上；②在冰上進行下述操作：往預冷的200 μL離心管（RNasefree）中加入以下試劑（表2）；③混勻，離心，42℃溫浴10 min，冷卻；④將以下試劑加入冷卻的反應液中（表3）；⑤混勻上述④中反應液，42℃，溫浴1小時；⑥85℃5 min，-20℃保存，備用。（5）PCR檢測。

2.4.4 Western blot法檢測RCS大鼠視網(wǎng)膜Bax、Caspase-3的相對表達量

（1）制備蛋白樣品；（2）Bradford 法測定蛋白質含量；（3）SDS-PAGE凝膠電泳；（4）轉膜；（5）抗體孵育和顯色；（6）凝膠圖像分析。

2.5 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示。統(tǒng)計學分析采用SPSS23.0進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)性和方差齊性則進行單因素方差分析（one way ANOVA）。P＜0.05表示差異具有顯著性，P＜0.01表示差異具有極顯著性。

3 結果

3.1 各組RCS大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結果

空白組：大鼠視網(wǎng)膜色素上皮層、視桿視錐層、外核層、外從狀層、內核層、內從狀層、神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)神經(jīng)纖維層等各層結構清晰正常（圖1）。

模型組：大鼠視網(wǎng)膜的厚度顯著薄于空白組RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠。其主要病灶位于外層視網(wǎng)膜，視細胞萎縮變性。HE染色可見的視網(wǎng)膜色素上皮細胞不連續(xù)并大部分損失。視網(wǎng)膜的外層較薄，部分感光細胞形態(tài)欠規(guī)則，且細胞核數(shù)量減少，大部分區(qū)域無外感光器核染色，一小部分區(qū)域可見聚集成團的細胞核染色。并有少量的點狀黑色素顆粒散在視網(wǎng)膜內層（圖2）。

圖1 空白組(HE×400)

圖2 模型組(HE×400)

圖3 益氣明目丸組(HE×400)

益氣明目丸組：大鼠視網(wǎng)膜厚度明顯高于模型組，并且可以見到一部分視網(wǎng)膜色素上皮?？梢钥闯觯摻M感光細胞核的數(shù)量大于模型組的數(shù)量，外從狀層、外核層、視桿視錐層的結構厚于模型組清晰，并且結構更清晰(圖 3)。

3.2 各組RCS大鼠視網(wǎng)膜Bax、Caspase-3的mRNA表達情況

各組視網(wǎng)膜組織中檢測指標BaxmRNA相對表達量模型組與空白組比較有極其顯著性差異（P＜0.01），益氣明目丸組與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05），益氣明目丸組與模型組比較有極其顯著性差異（P＜0.01）；各組視網(wǎng)膜組織中檢測指標Caspase-3mRNA相對表達量模型組與空白組比較有極其顯著性差異（P＜0.01），益氣明目丸組與空白組比較無顯著性差異（P＜0.05），益氣明目丸組與模型組比較有極其顯著性差異（P＜0.01）（圖4）。

以上結果表明益氣明目丸組BaxmRNA、Caspase-3mRNA相對表達量均較模型組減少，且與空白組接近，通過給RCS（rdy-/,p-/-）大鼠灌胃益氣明目丸在一定程度上抑制了其BaxmRNA、Caspase-3mRNA的相對表達。各組PCR檢測結果與Bax、Caspase-3mRNA檢測結果見圖5。

3.3 各組RCS大鼠視網(wǎng)膜WB檢測Bax、Caspase-3的蛋白表達情況

各組視網(wǎng)膜組織中檢測指標Bax蛋白相對表達量模型組與空白組比較有極其顯著性差異（P＜0.01），益氣明目丸組與空白組比較有極其顯著性差異（P＜0.01），益氣明目丸組與模型組比較有極其顯著性差異（P＜0.01）；各組視網(wǎng)膜組織中檢測指標Caspase-3蛋白相對表達量模型組與空白組比較有極其顯著性差異（P＜0.01），益氣明目丸組與空白組比較無顯著性差異（P＞0.05），益氣明目丸組與模型組比較有極其顯著性差異（P＜0.01）（圖6）。

以上結果表明益氣明目丸組Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對表達量均較模型組減少，且與空白組接近，通過給RCS（rdy-/,p-/-）大鼠灌胃益氣明目丸在一定程度上抑制了其Bax蛋白、Caspase-3蛋白的相對表達。各組WB檢測結果與Bax、Caspase-3蛋白相對表達量檢測結果見圖7。

4 討論

圖4 視網(wǎng)膜組織Bax mRNA、Caspase-3 mRNA相對表達量

圖5 PCR檢測結果

圖6 視網(wǎng)膜組織中Bax、Caspase-3蛋白相對表達強度

圖7 Western blot檢測結果

中醫(yī)將視網(wǎng)膜色素變性歸為“高風內障”的范疇，并認為虛是視網(wǎng)膜色素變性發(fā)生的主要原因，或腎陽虛虧，命門火衰；或肝腎兩虧，精血不足，陰陽不濟，陽氣不能為用；或脾胃虛弱，清陽不升，濁陰上盛，陽不彰明；或氣血不足等。RP的主要發(fā)病機制為本虛標實，虛中夾瘀，且血瘀貫穿視網(wǎng)膜色素變性的始終[7-8]。李傳課教授基于此病機根據(jù)滋補肝腎、活血明目的治療法則創(chuàng)立了治療視網(wǎng)膜色素變性的的純中藥制劑——益氣明目丸，在臨床上治療虛中夾瘀型的RP取得了一定的療效。

益氣明目丸中黨參、黃芪、白術、山藥、茯苓、黃精健脾補虛，益氣明目；山藥、黃精、菟絲子既可補脾，又可補腎，久服聰耳明目；柴胡助補益藥升舉清陽，上達于目；當歸、丹參養(yǎng)血活血以化瘀；葛根可助柴胡升舉脾胃之清氣，又因葛根含黃酮苷，現(xiàn)代研究認為其能擴血管，增加血流，用此以助當歸、丹參加強活血化瘀，改善微循環(huán)，增加局部營養(yǎng)，以提高視網(wǎng)膜功能。諸藥合用，共奏補脾益氣、活血明目之功。

已有研究證實：視網(wǎng)膜色素變性RCS（rdy-/,p-/-）大鼠具有“虛中夾瘀”證候[9]，本實驗則以該種遺傳性RCS大鼠作為研究對象，在益氣明目丸組經(jīng)過30天灌胃治療后，視網(wǎng)膜各層組織結構、視網(wǎng)膜厚度均高于模型組，Bax、Caspase-3的mRNA表達、蛋白相對表達也明顯低于模型組，表明益氣明目丸可抑制Bax、Caspase-3等凋亡相關基因的mRNA表達，進而抑制視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡。

視網(wǎng)膜感光細胞能將視覺信號轉換為光能信號，是傳送視覺信息的第一級神經(jīng)元，在視覺形成中占據(jù)著舉足輕重的地位[10]，細胞凋亡（apoptosis）是細胞自主有序死亡的過程，它由基因控制，并分為起始、效應器、凋亡執(zhí)行三個階段，各個階段的完成也受到相關基因的激活、表達以及調控等[11]。視網(wǎng)膜中的感光細胞很脆弱，隨著人造光源的污染增加以及來自外界環(huán)境的光刺激都極易引起感光細胞損傷，而感光細胞一旦受損，便無法再生[12]。感光細胞的凋亡是RP病程的最終結局，所以通過有效的方法延緩或者抑制視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡是治療RP的關鍵所在。

Bax屬于Bcl-2家族眾多成員之一，當外界刺激誘導凋亡時，Bax在受到死亡信號的刺激后被激活，從細胞質中轉移到線粒體膜上與膜結合，并快速形成同源二聚體，促進細胞凋亡[13]。Caspase是存在于細胞質中的蛋白酶，它參與細胞的生長、分化與凋亡調節(jié)各個環(huán)節(jié)，并且與真核細胞的凋亡有著密不可分的關系，但是只有在Caspase活化以后才能發(fā)揮其促凋亡的作用。Caspase的活化是細胞凋亡的過程中一個多步水解并且有序進行的過程，包括了同源、異源活化。異源活化是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經(jīng)典途徑，它是由一種Caspase活化另一種Caspase。而Caspase-3就是被異源活化的Caspase之一，能夠直接促發(fā)細胞凋亡[14]。多年以來，Caspase-3的這一促凋亡作用已被國內外多項研究證實[15-19]。

綜上所述，益氣明目丸可抑制BaxmRNA、Caspase-3mRNA的相對表達，從而抑制了RP的感光細胞的凋亡，改善視網(wǎng)膜超微結構，改善了視功能，這可能是益氣明目丸治療RP有效的可能機制之一。