黃 赫，甘 雨，袁 媛，喬 敏，馬 進(jìn)

（1.遼寧省中醫(yī)藥研究院 沈陽 110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 沈陽 110034）

急性腦梗死是一類多見的突發(fā)性心腦血管疾病，致殘率和死亡率較高，嚴(yán)重危及人類健康[1-4]。血液粘度、血小板聚集、炎癥的增加和細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)是患者溶栓后繼發(fā)血栓和死亡的主要原因[1,5,6]。當(dāng)急性腦梗死發(fā)生時(shí)冠狀動(dòng)脈阻塞，血管供應(yīng)大腦的血流中斷并引起壞死或缺血腦組織的軟化。急性腦梗死缺血半暗帶是正常腦組織之間一個(gè)可逆的壞死區(qū)域，然而缺血中心組織存在不可逆的功能損害[2]。許多以往研究表明成人大腦有對腦缺血損傷進(jìn)行自我修復(fù)的能力[7]。一般來說，神經(jīng)營養(yǎng)因子是參與神經(jīng)可塑性和腦卒中后修復(fù)的重要調(diào)節(jié)因子[7,8]。同時(shí)，特異性生長抑制劑的高表達(dá)是參與限制神經(jīng)可塑性[7]。本文意在尋找通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性生長刺激因子與生長抑制因子來放大某些內(nèi)源性過程以替代神經(jīng)修復(fù)的療法。

Nogo-A是一類著名的髓鞘相關(guān)軸突生長抑制蛋白，已被證明能抑制神經(jīng)細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散并在阻斷軸突再生方面發(fā)揮重要作用[9,10]。Nogo-A主要通過與受體NGR結(jié)合，通過其功能部件激活胞內(nèi)Nogo-A信號RhoA和它的下游靶基因ROCK，最終導(dǎo)致軸突生長錐凋亡[7,11,12]。

治療急性腦梗死包括溶栓藥和活血藥等。中醫(yī)藥由于其安全性被廣泛應(yīng)用，《本草綱目》中記載：“芎?，血中氣藥也?！贝ㄜ河谢钛袣?，祛風(fēng)止痛之功效，常用來治療缺血性腦血管病?！兜崮媳静荨分刑岬匠嗌志摺靶醒?，破瘀，散血塊”之功效。具有高安全性的中醫(yī)藥可能在急性腦梗死過程起神經(jīng)修復(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)將川芎赤芍作為行氣活血方，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR手段從Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK途徑探討川芎赤芍治療急性腦梗死的機(jī)制，并尋求最佳給藥劑量，為臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：組織用RNA提取試劑盒Ⅲ0333059-1001，鑼蓋管03358941001，SYBR GREEN染料04707-516001均購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR047A購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由華大基因公司合成。

實(shí)驗(yàn)儀器：羅氏全自動(dòng)核酸分離純化系統(tǒng)MagNA Pure LC 2.0、羅氏勻漿儀MagNA Lyser、羅氏實(shí)時(shí)定量PCR儀LC 480。

1.2 動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量250±10 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司供應(yīng)；動(dòng)物生產(chǎn)合格證號為SCXK（遼）2015—0001，動(dòng)物使用許可證號為SYXK（遼）2012—0003。隨機(jī)分為8組，分別為空白組、模型組、假手術(shù)組、川赤低劑量組，川赤中劑量組，川赤高劑量組，銀杏葉組，尼莫地平組。

1.3 模型建立與給藥

線栓法制備大鼠局灶性腦缺血（MCAO）模型。使用10%水合氯醛（3 mL·kg-1）注射大鼠腹腔麻醉，使大鼠仰臥并固定在手術(shù)臺上，頸前術(shù)區(qū)脫毛殺菌。無菌操作下做頸部前正中切口長約3 cm，經(jīng)右側(cè)胸鎖乳突肌后氣管旁進(jìn)入，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，向外牽引二腹肌及胸鎖乳突肌，由頸總動(dòng)脈向頭端依次剝離出頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈剪一切口，插入魚線18.5±0.5 mm，尼龍線固定，依次縫合切口。2 h動(dòng)物清醒后拔出線栓1 cm，并剪斷皮膚外部分，進(jìn)行神經(jīng)功能評分，放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

第二日開始喂藥，予其等體積的藥物，第三日取材，取其受損腦組織和腹腔血清。剩余繼續(xù)喂藥，分別在第7天和14天以上述方法取材。

1.4 RNA提取

本實(shí)驗(yàn)在羅氏全自動(dòng)核酸分離純化系統(tǒng)中進(jìn)行。啟動(dòng)系統(tǒng)，油脂工作站檢查；洗脫盒、儲存盒、加工盒、反應(yīng)吸頭、廢物袋、廢液瓶、試劑桶放入機(jī)器；使用電子天平稱取35 mg組織加入裝有600 mL組織裂解液的鑼蓋管中；組織勻漿儀研磨組織，6500 r·min-150 s兩次；兩次裂解之間的等待將樣品放在冷凍塊里；冷凍塊里培育樣品30 min；13000 r·min-1離心2 min，將350 μl裂解的勻漿加入到樣本管中備用；按照說明的量加注試劑桶，將樣本管放到樣本槽，運(yùn)行“RNA Tissue Fresh-Frozen”程序，進(jìn)行RNA提取反應(yīng)。

表1 Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK2、GAPDH引物序列

1.5 cDNA合成

cDNA合成使用寶生物cDNA合成試劑盒RR047A，在反應(yīng)體系1中加入5 μl RNA，1 μl oligo（dT）18，7 μl ddH2O至總體積13 μl，混勻，離心，65 ℃，10 min。在反應(yīng)1混合物中加入0.5 μl Protector RNase Inhibitor，4 μl反轉(zhuǎn)錄酶 Buffer，2 μl Deoxynucleotide Mix，0.5 μl反轉(zhuǎn)錄酶至總體積 20 μl，混勻，離心，55℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ +∞。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系包括cDNA 1 μl，上、下游引物各1 μl（引物序列見表1），10 μl Master Mix，7 μl ddH2O。反應(yīng)程序如下95 ℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，65℃ 1 min，4℃30 s。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 2-ΔΔCt公式計(jì)算 mRNA 的相對表達(dá)量。使用SPSS18.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有顯著性差異。

2 結(jié)果分析

為探索川芎赤芍對大鼠急性腦梗死的療效，檢測不同川赤劑量組與空白組、模型組、假手術(shù)組Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK2 mRNA相對表達(dá)量的差異，銀杏葉組和尼莫地平組分別作為中藥陽性和西藥陽性對照組。同時(shí)，本研究對用藥3天、7天和14天后急性腦梗死大鼠Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK2 mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行對比，統(tǒng)計(jì)其差異。

圖1 不同組大鼠Nogo-A mRNA相對表達(dá)量變化

圖2 不同組大鼠NgR mRNA相對表達(dá)量變化

圖3 不同組大鼠RhoA mRNA相對表達(dá)量變化

結(jié)果如圖1、2、3、4，不同用藥天數(shù)模型組與空白組、假手術(shù)組相比，Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK2 mRNA相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05)。

見圖1，給藥3天后Nogo-A mRNA相對表達(dá)量川赤高劑量組＞低劑量組＞中劑量組（P＜0.05)，且與模型組相比以上三組都顯著降低（P＜0.01)，銀杏葉組和尼莫地平組Nogo-A mRNA相對表達(dá)量亦顯著低于模型組（P＜0.01)。給藥7天后，川赤中、高劑量組與模型組相比Nogo-A mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)。川赤低劑量組對Nogo-A mRNA相對表達(dá)量的抑制作用低于川赤中、高劑量組（P＜0.01)，川赤中高劑量組Nogo-A mRNA相對表達(dá)量無顯著差異，銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比Nogo-A mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)。給藥14天后，川赤低、中、高劑量組Nogo-A mRNA相對表達(dá)量與模型組相比顯著降低（P＜0.01)，且川赤中劑量組Nogo-A mRNA相對表達(dá)量低于高劑量組（P＜0.05），川赤低、高劑量組無明顯差異，而銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比Nogo-A mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)。

如圖2，給藥3天后，川赤低、中、高劑量組NgR mRNA相對表達(dá)量與模型組相比顯著降低（P＜0.01)，且川赤中劑量組＜低劑量組＜高劑量組（P＜0.05），銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比NgR mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)。給藥7天后與模型組相比，川赤低、中、高劑量組NgR mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)，但川赤低、中、高劑量組之間該基因相對表達(dá)量無顯著性差異，銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比NgR mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)。給藥14天后川赤低、中、高劑量組比模型組NgR mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)，川赤中劑量組NgR mRNA相對表達(dá)量略低于川赤高劑量組（P＜0.05），川赤中劑量組NgR mRNA相對表達(dá)量顯著低于川赤低劑量組（P＜0.01），川赤低、高劑量組之間NgR mRNA相對表達(dá)量無顯著性差異，銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比NgR mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)。

如圖3所示，給藥3天后與模型組相比，川赤低、中、高劑量組RhoA mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)，川赤低劑量組RhoA mRNA相對表達(dá)量高于川赤中、高劑量組（P＜0.01)，銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比明顯降低（P＜0.01)。給藥7天后與模型組相比，川赤低、中、高劑量組RhoA mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)，川赤低劑量組RhoA mRNA相對表達(dá)量高于川赤中、高劑量組（P＜0.01)，川赤中、高劑量組RhoA mRNA相對表達(dá)量無顯著差異，銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比顯著降低（P＜0.01)。給藥14天后與模型組相比，川赤低、中、高劑量組RhoA mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)，川赤低、中、高劑量組RhoA mRNA相對表達(dá)量無明顯差異，而銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比顯著降低（P＜0.01)。

給藥3天后與模型組相比，川赤低、中、高劑量組ROCK mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)，川赤低劑量組ROCK mRNA相對表達(dá)量高于川赤中、高劑量組（P＜0.05)，川赤中、高劑量組之間無顯著性差異，銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比顯著降低（P＜0.01)。給藥7天后與模型組相比，川赤低、中、高劑量組ROCK mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)，川赤中劑量組ROCK mRNA相對表達(dá)量低于川赤低、高劑量組（P＜0.01)，川赤低、高劑量組ROCK mRNA相對表達(dá)量無顯著差異，銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比顯著降低（P＜0.01)。給藥14天后與模型組相比，川赤中、高劑量組ROCK mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01)，川赤低劑量組低于模型組（P＜0.05），川赤低劑量組ROCK mRNA相對表達(dá)量高于中劑量組（P＜0.05），川赤高劑量組與中劑量組ROCK mRNA相對表達(dá)量無顯著性差異，而銀杏葉組和尼莫地平組與模型組相比顯著降低（P＜0.01)（圖4）。

3 討論

急性腦梗死是一類嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[13]。當(dāng)前關(guān)于急性腦梗死的研究大多集中在炎癥細(xì)胞因子[1,13]和細(xì)胞凋亡[2]的角度上，從保護(hù)神經(jīng)角度研究的較少。本研究從軸突生長抑制因子mRNA水平的改變?nèi)胧痔接懘ㄜ撼嗌种委熂毙阅X梗死的分子機(jī)制。

信號因子Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK2可以限制軸突生長和神經(jīng)可塑性[7,14]。Nogo-A是一類眾所周知的髓鞘相關(guān)軸突生長抑制蛋白，已被證明參與抑制神經(jīng)細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散，并在阻止軸突再生和中風(fēng)后軸突重建方面具有重要作用[7,9,15]。NgR為Nogo-A受體，通常與Nogo-A一起發(fā)揮抑制神經(jīng)突生長的作用[11]。抑制RhoA能顯著促進(jìn)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)突生長與神經(jīng)元分化[7,16]。抑制ROCK可調(diào)節(jié)軸突生長并保護(hù)神經(jīng)元免于興奮性毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[7,17,18]。在小膠質(zhì)細(xì)胞中，活化的ROCK會(huì)影響神經(jīng)炎癥和多巴胺能神經(jīng)變性，而被抑制的ROCK主要在多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮作用[7,19]。

圖4 不同組大鼠ROCK mRNA相對表達(dá)量變化

當(dāng)腦血管疾病發(fā)生時(shí)，Rho和ROCK活動(dòng)通常增加，不僅僅在血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞，也存在于炎癥細(xì)胞和神經(jīng)元[20,21]。Rho和ROCK通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對平滑肌細(xì)胞功能產(chǎn)生影響[22]。Rho通過其下游效應(yīng)物ROCK調(diào)節(jié)細(xì)胞重組肌動(dòng)蛋白骨架，廣泛參與細(xì)胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)再生[23]。ROCK是Rho下游產(chǎn)物，包括兩種細(xì)胞亞型ROCK1和ROCK2，后者主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中像海馬錐體神經(jīng)元和腦區(qū)皮質(zhì)。韋斯等人[24]表明ROCK通過許多渠道影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，并參與平滑肌細(xì)胞增殖和再狹窄的調(diào)節(jié)。其作用機(jī)制已得到證實(shí)，如促進(jìn)MLC磷酸化，增加內(nèi)皮細(xì)胞滲透，并下調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)[25,26]，上述機(jī)制可導(dǎo)致大腦供血障礙，影響記憶與學(xué)習(xí)能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK2相對表達(dá)量與空白和假手術(shù)組相比上調(diào)，提示急性腦梗死可能增加大鼠軸突生長抑制因子的表達(dá)。川赤中劑量組Nogo-A相對表達(dá)量在給藥3天和14天與川赤低、高劑量相比下調(diào)最多（P＜0.05），在7天時(shí)川赤中高劑量組間相對表達(dá)量無差異，且低于川赤低劑量組（P＜0.01）。川赤中劑量組NgR相對表達(dá)量在給藥3天、7天和14天均低于川赤低、高劑量組（P＜0.05）。給藥3天、7天川赤中、高劑量組RhoA相對表達(dá)量下調(diào)最多（P＜0.01），而給藥14天川赤低、中、高劑量組RhoA相對表達(dá)量差異不明顯。給藥3天川赤中、高劑量組ROCK相對表達(dá)量低于川赤低劑量組（P＜0.05）；給藥7天與川赤低、高劑量組比，川赤中劑量組下調(diào)最多（P＜0.01）；給藥14天，川赤中劑量組比低劑量組下調(diào)明顯（P＜0.05），與高劑量組無差異。由此可以推測，川芎赤芍組成的益氣活血方能夠下調(diào)內(nèi)在生長抑制因子Nogo-A/RhoA/ROCK2 mRNA的表達(dá)以降低急性腦梗死帶來的神經(jīng)損傷，且中劑量川芎赤芍療效可能較好。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)川芎赤芍可降低急性腦梗死大鼠Nogo-A、NgR、RhoA、ROCK2 mRNA的相對表達(dá)量（P＜0.05），且給藥3天、7天和14天后這種下降趨勢依然存在，因此推測川芎赤芍對于急性腦梗死大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)是持續(xù)性的，川赤中劑量組可能治療效果較好。這些數(shù)據(jù)均支持川芎赤芍可能有神經(jīng)修復(fù)作用，為研究其作為治療急性腦梗死潛在新藥打下基礎(chǔ)。