唐群力，肖林林，魏取好，肖 虎，趙衛(wèi)衛(wèi)，馮 景

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院檢驗(yàn)科，上海 201499)

無乳鏈球菌(或稱B族鏈球菌)是一種可以在胃腸道和泌尿生殖道中定植的條件致病菌，常定植于人類直腸和生殖道中，屬β溶血的革蘭陽性鏈球菌。無乳鏈球菌通常和懷孕期間與產(chǎn)后期間的醫(yī)療間期相關(guān)易感因素關(guān)系密切，當(dāng)機(jī)體免疫力低下、廣泛使用抗菌藥物等時，容易引起機(jī)會性感染[1-2]。無乳鏈球菌與新生兒的致命疾病如敗血癥、肺炎和腦膜炎有關(guān),被認(rèn)為是新生兒疾病發(fā)展的最重要風(fēng)險之一，無乳鏈球菌在孕婦中的定植率根據(jù)社會經(jīng)濟(jì)、文化和人口狀況及用于檢測的方法而有所不同[3]。本研究采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測孕晚期婦女無乳鏈球菌帶菌狀況,采用半定量法檢測其陰道分泌物乳酸桿菌水平，并結(jié)合數(shù)據(jù)分析相互之間的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2018年1月在本院婦產(chǎn)科門診和住院病房就診的孕晚期婦女(34～37周)共5 855例作為研究對象，并選取100例健康體檢女性為對照組，每位研究對象由婦產(chǎn)科醫(yī)生同時采集陰道分泌物(一支拭子樣本)及直腸分泌物(一支拭子樣本)送檢，無乳鏈球菌攜帶組、陰性組、對照組的乳酸桿菌檢測樣本使用白帶常規(guī)涂片后進(jìn)行瑞姬染色。陰性質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，陽性質(zhì)控菌株為無乳鏈球菌ATCC13813。采集過程嚴(yán)格按照樣本采集手冊執(zhí)行，取樣對象知情同意。

1.2儀器與試劑 RT-qPCR儀購自瑞士羅氏診斷推出的Roche lightcycle 480Ⅱ，無乳鏈球菌核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)購自泰普生物科學(xué)(中國)有限公司，瑞氏-姬母薩染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。試劑盒采用PCR及熒光標(biāo)記探針，檢測臨床樣本中無乳鏈球菌特定基因(CAMP)，從而判斷無乳鏈球菌的存在。據(jù)文獻(xiàn)報道，對于無乳鏈球菌的臨床樣本檢測中，RT-qPCR法與細(xì)菌培養(yǎng)法、測序法(金標(biāo)準(zhǔn))的符合率達(dá)95%以上[4]。

1.3方法

1.3.1無乳鏈球菌檢測 在樣本拭子管內(nèi)加入1 mL清洗液(10×濃縮清洗液與滅菌純化水按1∶9進(jìn)行稀釋)，用震蕩混勻器高速震蕩2 min，將其制成樣本混懸液。吸取全部樣本混懸液至1.5 mL離心管內(nèi)，13 000 r/min離心5 min后棄去上清，加入1 mL清洗液震蕩混勻重懸，13 000 r/min離心5 min后棄去上清(視樣本渾濁情況可重復(fù)本步驟)，加入50 μL清洗液重懸。然后向每只樣本管中加入1管等量提取固形物，用震蕩混勻器高速震蕩5 min，連同陰性對照、陽性對照質(zhì)控樣本同樣提取流程提取基因組模板后，瞬時離心，每管分別加入10 μL內(nèi)參照，95 ℃干浴2 min，冰浴5 min后13 000 r/min離心1 min，各取5 μL上清作為模板加入至配好的PCR擴(kuò)增體系中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。擴(kuò)增完畢，調(diào)整基線和閾值，確認(rèn)陰陽性對照及質(zhì)控在有效范圍內(nèi)后判讀結(jié)果，陰性樣本FAM Cp值=40或“Undet”，陽性樣本FAM Cp值≤33且曲線呈明顯對數(shù)增長。

1.3.2陰道微環(huán)境指標(biāo)檢測[5]將送檢的陰道分泌物制作出分泌物涂片，高倍鏡下觀察判讀清潔度并記錄結(jié)果，待干燥后用瑞氏-姬母薩染色液染色、晾干，于顯微鏡下油鏡下觀察乳酸桿菌水平及陰道菌落多樣性。依據(jù)2010年廖秦平[6]提出的陰道微生態(tài)評價標(biāo)準(zhǔn)，陰道乳酸桿菌菌群密集度及陰道菌群多樣性均可分為4個等級。其中，陰道乳酸桿菌菌群密集度的4級分級情況為：Ⅰ級(+)，油鏡下觀察每個視野平均細(xì)菌數(shù)量為1～9，換算成具體數(shù)值為105～106/mL；Ⅱ級(++)：油鏡下觀察每個視野平均細(xì)菌數(shù)量為10～99，換算成具體數(shù)值為107～108/mL；Ⅲ級(+++)：油鏡下觀察每個視野平均細(xì)菌數(shù)量超過100，換算成具體數(shù)值為109～1010/mL；Ⅳ級(++++)：油鏡下觀察每個視野細(xì)菌聚集成團(tuán)，或密集黏膜上皮細(xì)胞，換算成具體數(shù)值為1010/mL以上。陰道菌群多樣性4級分級情況為：Ⅰ級(+)，油鏡下觀察每個視野平均能辨別1～3種細(xì)菌；Ⅱ級(++)，油鏡下觀察每個視野平均能辨別4～6種細(xì)菌；Ⅲ級(+++)，油鏡下觀察每個視野平均能辨別7～10種細(xì)菌；Ⅳ級(++++)，油鏡下觀察每個視野平均能辨別11種及以上細(xì)菌。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以率表示，不同分組間采用兩組樣本率的χ2檢驗(yàn)。以Ρ<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1孕晚期婦女無乳鏈球菌攜帶情況 5 855例門診和住院病房就診的孕晚期婦女(孕34～37周)中共檢出無乳鏈球菌攜帶者563例(563/5885,9.6%)，其中陰道分泌物檢出143例(143/5 885,2.4%)，直腸分泌物檢出426例(426/5 885,7.2%)，二者同時檢出陽性有106例(106/5 885,1.8%)，占總陽性人群的18.8%。對照組中檢出陽性4例，陽性率為4.0%。

2.23組研究對象陰道清潔度、乳酸桿菌水平及陰道菌群多樣性情況 無乳鏈球菌陽性組乳酸桿菌(Ⅱ～Ⅲ級)、菌群多樣性(Ⅱ～Ⅲ級)、清潔度(Ⅰ度)、微環(huán)境失調(diào)的概率見表1。其中無乳鏈球菌陽性組、陰性組各指標(biāo)與對照組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陰性組各指標(biāo)與對照組相比，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組研究對象陰道微環(huán)境相關(guān)指標(biāo)的比較[n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05；與陰性組比較，#P<0.05

3 討 論

目前研究報道普遍認(rèn)為，無乳鏈球菌是孕晚期婦女發(fā)生嚴(yán)重感染性疾病的主要致病菌之一，可以造成孕婦及嬰兒不良后果[7-8]。女性陰道通常被認(rèn)為是一個復(fù)雜的微生態(tài)體系，乳酸桿菌含量、菌群多樣性、清潔度等因素對維持微環(huán)境的平衡和預(yù)防感染的發(fā)生起到了非常重要的作用[7,9-10]。因此，對孕晚期婦女進(jìn)行無乳鏈球菌篩查，同時調(diào)查陰道微環(huán)境相關(guān)指標(biāo)，結(jié)合分析后可采取積極有效的預(yù)防和治療措施，降低孕晚期婦女感染率。

微生物細(xì)菌培養(yǎng)鑒定是鑒別及診斷無乳鏈球菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其周期長、操作繁瑣、檢出率低等明顯的缺點(diǎn)不能很好地滿足臨床準(zhǔn)確、快速鑒定的訴求，同時煩瑣的操作一定程度了造成了檢驗(yàn)人力資源的浪費(fèi)。RT-qPCR法檢測無乳鏈球菌具有快速、操作簡便、靈敏度高等特點(diǎn)，可以較好地解決以上問題，目前廣泛應(yīng)用于無乳鏈球菌的檢測[10]。陰道微環(huán)境有一套較為完善的臨床評價體系，當(dāng)陰道菌群密度為Ⅱ～Ⅲ級、多樣性為Ⅱ～Ⅲ級、清潔度為Ⅰ度、乳酸桿菌正常、陰道酸堿度為小于4.5時，定義為陰道微環(huán)境正常。當(dāng)任何一項異常，均可診斷為微環(huán)境失調(diào)[11]。

本研究對孕晚期婦女采用RT-qPCR法檢測無乳鏈球菌攜帶情況，并檢測記錄微環(huán)境相關(guān)的各項指標(biāo)結(jié)果。結(jié)果顯示，本院孕晚期婦女無乳鏈球菌攜帶率為9.6%，與國內(nèi)報道的漢中[12]、北京[13]、重慶[14]地區(qū)的攜帶率持平，低于韓國的13.0%[10]，處于歐洲國家6.5%～36.0%和美國2.0%～29.0%[15]范圍的中下游水平。本研究顯示，孕晚期無乳鏈球菌陽性組陰道微環(huán)境失調(diào)率高于陰性組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了育齡婦女無乳鏈球菌感染高發(fā)可能與生殖道微環(huán)境改變有關(guān)的猜測。

4 結(jié) 論

本院孕晚期婦女的無乳鏈球菌攜帶率處于已有文獻(xiàn)報道的正常范圍內(nèi)，無乳鏈球菌感染的孕晚期婦女陰道微環(huán)境表現(xiàn)為失調(diào)，陰道微生態(tài)平衡遭到破壞，增加了罹患生殖道感染的風(fēng)險，在臨床上應(yīng)該引起足夠的重視，應(yīng)該加強(qiáng)無乳鏈球菌的檢測和監(jiān)控，以便采取預(yù)防措施，提高孕期生活質(zhì)量，避免帶來嚴(yán)重后果。同時，無乳鏈球菌檢測的影響因素眾多，樣本異質(zhì)性問題尤甚，分析前其過程應(yīng)該加強(qiáng)監(jiān)控。