戈 旺，王 博，閆風連，徐國梅，靳 峰，張青青，馬 群，司傳平△

(1.青島大學基礎醫(yī)學院免疫學系，山東青島 266071；2.濟寧市婦幼保健計劃生育服務中心，山東濟寧 272000；3.濟寧醫(yī)學院免疫學與分子醫(yī)學研究所，山東濟寧 272067；4.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內科，山東濟寧 272029；5.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經外科，山東濟寧272029)

動脈粥樣硬化(AS)是由血管壁中脂質滯留及其觸發(fā)的免疫反應引起的一種慢性炎癥性疾病。巨噬細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞，以及多種細胞因子參與AS斑塊形成及其穩(wěn)定性下降[1-3]。白細胞介素16(IL-16)可由T細胞、巨噬細胞和內皮細胞等分泌產生[4-5]。已有研究表明，IL-16能夠促進 CD4+T細胞、單核細胞及嗜酸性粒細胞的遷移，尤其對CD4+T淋巴細胞具有強烈的趨化作用[6]。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)IL-16具有抗炎作用，可增加人外周血單個核細胞中FoxP3的表達，并降低T細胞對活化信號的反應，從而發(fā)揮潛在的免疫負向調節(jié)作用[7]。IL-16在AS相關疾病中的作用尚存在分歧。一方面，有研究提示IL-16可加劇AS進程使斑塊趨向不穩(wěn)定，從而引發(fā)卒中和心肌梗死等[8]；另一方面，IL-16在斑塊中的水平與卒中、心肌梗死等疾病呈負相關，提示IL-16可能具有維持斑塊穩(wěn)定性的作用[9]。目前，尚缺乏IL-16對于AS影響的直接證據(jù)，且IL-16影響AS的具體機制也不明確。本研究擬通過分析AS外周血IL-16水平和AS小鼠模型IL-16水平干預，初步探討IL-16在AS患者和小鼠外周血和AS斑塊中的表達水平，以及IL-16在AS發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年8月至2016年8月在濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院就診并行冠狀動脈造影檢查確定為AS的患者30例作為病例組，其中男13例，女17例，年齡42～83歲，平均64歲。全部病例均為新發(fā)病例。選取同期體檢健康者29例作為健康對照組，其中男12例，女17例，年齡36～75歲，平均62歲。每位受試者空腹抽取靜脈血3 mL入凝血管，另抽取2 mL入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血管備用。凝血管2 000 r/min，離心10 min分離得到血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究經過濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有調查者簽署知情同意書。濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科獲取具有代表性2例AS患者頸總動脈斑塊剝脫術后斑塊標本備用。實驗動物采用無特定病原體(SPF)級ApoE-/-小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，養(yǎng)于12 h光照周期、恒溫恒濕SPF環(huán)境。相關飼養(yǎng)及處置遵循實驗動物福利原則及濟寧醫(yī)學院實驗動物倫理委員會的要求。

1.2儀器與試劑 Cytation5細胞成像酶標儀購自美國BioTek公司，Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機及TRIzol和逆轉錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。FTC-200 PCR儀購自英國Fedbio公司。顯微鏡型號為日本OLYMPUS IX-ILL30。IL-16酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，SYBR Green Master Mix購自Vazyme公司。兔抗人IL-16一抗、羊抗兔二抗及CD3抗體均購自英國Abcam公司。

1.3方法

1.3.1ELISA檢測血清IL-16表達水平 采用ELISA檢測血清IL-16表達水平，參照ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)說明進行操作，繪制標準曲線，計算出IL-16血清水平。

1.3.2外周血單個核細胞IL-16的mRNA水平測定 密度梯度法分離外周血單個核細胞。Trizol法提取標本中單個核細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后進行實時定量PCR檢測(RT-qPCR)。總體系10 μL：SYBR Green Master Mix 5 μL，Primer-Reverse 0.5 μL，Primer-Forward 0.5 μL，DDW 3 μL，cDNA 1 μL。PCR反應程序為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40個循環(huán)。每個樣品均設置復孔并至少檢測3次。結果分析采用2-ΔΔCt法，其中ΔΔCt=(樣本的Ct值-內參的Ct值)-(對照組Ct值-內參的Ct值)。

1.3.3重組小鼠IL-16的表達與鑒定 構建IL-16和谷胱甘肽融合蛋白原核高表達載體pGEX-IL16-GST，轉化感受態(tài)細胞后鑒定并挑選成功轉化菌落于30 ℃，空氣浴搖床80 r/min培養(yǎng)過夜。待細菌濃度吸光度值達到0.5時，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，37 ℃ 150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。離心收獲細菌，提取細胞總蛋白，經GST吸附柱富集IL-16+GST融合蛋白，進一步經Western blot鑒定。

1.3.4免疫組化檢測斑塊中IL-16的表達 從濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科收集患者頸總動脈內膜剝脫術后AS斑塊石蠟切片；頸椎脫臼處死AS模型小鼠后，沿腹中線剪開皮膚和胸骨后取腹主動脈根部，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗去血凝塊后迅速放于4%多聚甲醛中固定48 h，然后常規(guī)石蠟包埋切片。分別對切片進行HE染色和免疫組化染色，然后在顯微鏡(OLYMPUS IX-ILL30)下觀察拍照。

1.3.5IL-16對AS小鼠斑塊形成的影響 采用ApoE-/-雄性小鼠20只,雌雄各半，將其隨機分為兩組，每組10只。兩組均給予0.25%膽固醇和15%可可油喂食8周。實驗組高脂喂養(yǎng)小鼠于第4周每周1次腹腔注射重組IL-16(每只2 μg)，連續(xù)注射4周；對照組小鼠同時給予腹腔注射同等劑量PBS。兩組均在4周后處死小鼠，取小鼠主動脈根部制備連續(xù)石蠟切片。

2 結 果

2.1病例組與健康對照組外周血IL-16水平比較 應用ELISA檢測研究對象外周血IL-16水平，病例組IL-16水平明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1A。病例組患者外周血單個核細胞中IL-16 mRNA水平明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B。

注：A為ELISA檢測外周血IL-16水平；B為RT-qPCR檢測外周血單個核細胞中IL-16的mRNA水平;與健康對照組比較，*P<0.05

圖1病例組和對照組外周血IL-16水平及單個核細胞中IL-16的mRNA水平比較

2.2IL-16在人和ApoE-/-小鼠AS斑塊中高表達 通過免疫組化檢測AS患者頸總動脈剝脫術后斑塊中IL-16水平，發(fā)現(xiàn)AS患者AS斑塊局部IL-16表達水平高于其周圍非斑塊區(qū)，見圖2A。免疫組化染色顯示非高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠IL-16表達明顯比高脂喂養(yǎng)AS ApoE-/-小鼠IL-16表達水平低，見圖2B、2C。

注：A為AS斑塊局部IL-16表達水平；B為非高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠IL-16表達水平；C為高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠IL-16表達水平

圖2人頸總動脈剝脫術斑塊應小鼠斑塊IL-16免疫組化染色(200×)

2.3腹腔注射IL-16可減小高脂喂養(yǎng)AS ApoE-/-小鼠斑塊面積，提高斑塊穩(wěn)定性 HE染色顯示，與對照組高脂喂養(yǎng)AS ApoE-/-小鼠腹腔注射PBS的相比，注射重組IL-16可減小小鼠AS斑塊的總面積，而且注射PBS對照組小鼠斑塊中CD3+細胞數(shù)量明顯多于注射IL-16小鼠主動脈斑塊中CD3+細胞數(shù)量，見圖3。此外，與腹腔注射PBS的小鼠對照組AS斑塊相比，腹腔注射IL-16的小鼠斑塊相對穩(wěn)定，并未破裂，見圖3C、3D。

注：A為腹腔注射PBS的高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊HE染色(200×)；B為腹腔注射IL-16的高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊HE染色(200×)；C為腹腔注射PBS的高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊CD3+免疫組化染色(400×)；D為腹腔注射IL-16的高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊CD3+免疫組化染色(400×)

圖3小鼠主動脈根部斑塊HE染色和CD3+免疫組化染色

3 討 論

IL-16在哮喘、過敏及風濕性關節(jié)炎等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮促炎并加劇病情的作用[10-13]，但其在AS疾病中的作用尚存在分歧。一方面，李秀芹等[8]的研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者IL-16水平較健康人群高，并據(jù)此認為體內升高的IL-16可能增加干擾素γ(IFN-γ)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-15等促炎細胞因子以及CD40L的表達，進而促進AS斑塊的形成，促使斑塊不穩(wěn)定，導致冠狀動脈血栓形成。另一方面，有研究報道IL-16在斑塊中的水平可能與卒中、心肌梗死等AS相關疾病的發(fā)生呈負相關[9]。GR?NBERG等[14]的研究發(fā)現(xiàn)頸動脈斑塊中高水平的IL-16與斑塊的穩(wěn)定性表型相關。這種穩(wěn)定性表型以增加的彈性蛋白、膠原蛋白和FoxP3為特征，并在平均21個月的隨訪期內較少發(fā)生術后心血管事件。這提示IL-16可能具有維持斑塊穩(wěn)定和減輕疾病的作用?？傊壳暗难芯績H局限于觀察IL-16和臨床癥狀之間的關系，且研究結果存在分歧，缺乏IL-16影響AS斑塊的直接證據(jù)。

本文在前人研究的基礎上檢測了臨床患者IL-16的水平，證實AS患者外周血中IL-16蛋白水平及mRNA水平均明顯高于健康人群，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在患者頸總動脈斑塊局部發(fā)現(xiàn)IL-16高表達。提示IL-16與AS存在密切關系。為進一步研究IL-16對AS斑塊的影響，本研究把誘導純化的IL-16腹腔注射到ApoE-/-小鼠模型體內，發(fā)現(xiàn)IL-16可以有效地減小斑塊形成、降低斑塊內CD3+細胞的含量、增加斑塊穩(wěn)定性。這提示IL-16在AS疾病中可能發(fā)揮保護性的作用。

IL-16是一種具有多種功能的細胞因子。一般認為IL-16主要發(fā)揮促進炎癥的作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)IL-16具有抵抗炎癥的作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，IL-16可增加FoxP3的表達，并降低T細胞對刺激的反應，具有潛在的免疫調節(jié)作用[9]。MCFADDEN等[7]的研究表明IL-16優(yōu)先吸引調節(jié)性T細胞的遷移，且被IL-16吸引的調節(jié)細胞表達更高水平的FoxP3。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-16干預導致小鼠斑塊局部CD3陽性水平顯著降低，局部炎癥減輕。提示IL-16在小鼠AS模型中可能更多地發(fā)揮抗炎作用，并且可能由此導致AS負荷的降低。

本研究結果表明，IL-16可以減小斑塊面積，減輕斑塊局部炎癥水平，發(fā)揮抵抗AS斑塊形成、增加斑塊穩(wěn)定性的作用，提示IL-16在AS中可能發(fā)揮保護性的作用。AS患者血清和斑塊中IL-16的水平升高可能是由疾病導致的補償性反應。本研究結果提示，IL-16可能作為一種監(jiān)測AS發(fā)展和預后的指標，也是治療AS的新靶點。但本研究還存在一些不足之處，選取研究對象數(shù)量較少，后續(xù)研究會選擇更大量的研究樣本，以期為臨床提供更加可靠的參考。

4 結 論

本研究通過檢測AS患者外周血、AS斑塊組織及AS小鼠動脈斑塊，證實IL-16在AS患者外周血和AS小鼠斑塊中均高表達。通過腹腔注射AS小鼠重組IL-16，發(fā)現(xiàn)IL-16可能具有穩(wěn)定AS斑塊的作用。