孫振威，倉寶成，寧 群，趙敬湘，李鵬龍

(1.解放軍第153中心醫(yī)院臨檢中心,河南鄭州 450042；2.解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南鄭州 450042；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所,北京 100850)

研究表明，富血小板血漿(PRP)因含有多種生長因子，如血小板源生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等，在參與止血的同時(shí)，具有調(diào)控細(xì)胞增殖與分化，刺激血管和周圍神經(jīng)再生，促進(jìn)傷口愈合等功能[1-3]。人們開展了大量的動物實(shí)驗(yàn)探索PRP在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用前景。然而，由于PRP的制備方法各不相同，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，研究者在相似的實(shí)驗(yàn)中往往得到不同甚至相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4-5]，嚴(yán)重影響了血小板相關(guān)研究的可靠性。

大、小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物在PRP的研究中具有很多優(yōu)點(diǎn)，如與人的基因同源性高，便于基因修飾，適于分子機(jī)制研究；有大量的鼠源抗體，便于進(jìn)行免疫學(xué)研究；藥品用量少，適于體內(nèi)輸注實(shí)驗(yàn)等[6-8]。大、小鼠血小板的提取方法也有很多種，既有白膜法，也有富血小板血漿法；既有二次離心法，也有一次離心法[9-15]。研究表明，小動物血小板提取過程中，由于血量較少，采用白膜法第一次離心后形成的血小板堆積層很薄，手工分離難度較大，故推薦采用富血小板血漿法[16]。同時(shí)，一次離心法的血小板提取率雖不及二次離心法，但其獲得的血小板活性明顯高于二次離心法，更適于血小板功能試驗(yàn)[17]。本研究旨在優(yōu)化一次離心法制備大、小鼠PRP的實(shí)驗(yàn)條件，篩選出一種穩(wěn)定可靠的血小板提取方法，為血小板相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性Wistar大鼠(270～340 g)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[動物合格證號：SCXK(京)2012-0001]；SPF級雄性BALB/C小鼠(11～13周齡，24～28 g)購自軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院動物中心[動物合格證號：SCXK-(軍)]。常規(guī)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從動物房取出。

1.2實(shí)驗(yàn)器材 小動物呼吸機(jī)(D79232 March，德國HSE)，無紡布濾器(X30，江蘇東潤)，高速離心機(jī)(Z-16PK，德國SIGMA)，動物血液分析儀(950FS，英國HEMAVET)，F(xiàn)S-PAK鞘液(英國Drew Scientific，批號：570265249)，戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司，化學(xué)純)，肝素鈉(國藥集團(tuán)，批號：20131016)，CPDA-1血液保養(yǎng)液(美國SIGMA-ALDRICH，貨號：C4431)，0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1麻醉 配制2.5%(g/mL)戊巴比妥鈉溶液，分別腹腔注射0.23%、0.35%(容積/大、小鼠的體質(zhì)量)的戊巴比妥鈉溶液麻醉大、小鼠。

1.3.2取血 配制0.3%(g/mL)肝素鈉溶液，濕潤管壁后進(jìn)行大鼠左側(cè)股動脈插管放血，每只大鼠放血10 mL，加入14% CPDA-1抗凝，實(shí)驗(yàn)一次取血30 mL。對小鼠行氣管插管通氣，以吸入0.14 mL CPDA-1的注射器心臟穿刺取血1 mL，實(shí)驗(yàn)一次取血18 mL，貼壁緩慢注入50 mL離心管中，混勻[18]。

1.3.3濾白 超凈工作臺中，取出無菌濾器(濾過直徑5～10 μm)，上端連接拔除針頭和內(nèi)芯的10 mL注射器，下端緊貼另一離心管管壁，將全血緩慢注入上端注射器管內(nèi)，依靠重力作用使血液自然濾過。

1.3.4離心 將濾除白細(xì)胞的血樣每份1.5 mL分裝入無菌的5 mL EP管中，封口膜封口，22 ℃條件下離心。血樣分成兩層，上層為PRP層，下層為紅細(xì)胞層。超凈工作臺中用移液器轉(zhuǎn)移上層PRP于另一無菌EP管中。離心過程中以離心力和離心時(shí)間為考察因素，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。大鼠血樣離心過程中離心力分別取300×g、400×g、500×g、600×g 4個(gè)水平，小鼠血樣離心過程中離心力分別取300×g、400×g 2個(gè)水平，離心時(shí)間均取4、6、8、10、12 min 5個(gè)水平，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，見圖1。

注：A為14%CPDA-1抗凝全血；B為白細(xì)胞濾除過程；C為濾白全血離心后血液分層

圖1 PRP提取過程

1.3.5計(jì)數(shù) 測定抗凝全血、濾除白細(xì)胞后的血樣和離心后的上層PRP體積，各自混勻后取100 μL用動物血液分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算白細(xì)胞濾除率和不同離心方法的血小板回收率。白細(xì)胞濾除率=1-(濾除白細(xì)胞后血樣體積×血樣中白細(xì)胞計(jì)數(shù))/(抗凝全血體積×全血中白細(xì)胞計(jì)數(shù))；血小板回收率=(富血小板血漿體積×富血小板血漿中血小板計(jì)數(shù))/(濾除白細(xì)胞后血樣體積×血樣中血小板計(jì)數(shù))。

2 結(jié) 果

2.1白細(xì)胞濾除率 大、小鼠抗凝全血白細(xì)胞濾除率分別為(88.32±4.18)%和(85.16±6.06)%，濾除白細(xì)胞前后血樣中紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2大鼠血小板回收率 在4～12 min的時(shí)間段內(nèi)，隨著離心時(shí)間的延長，300×g離心力條件下，血小板回收率逐漸升高；400×g離心力條件下，血小板回收率先升高再降低，并在離心8 min時(shí)達(dá)到峰值；500×g和600×g離心力條件下，血小板回收率逐漸降低。見表1。

表1 不同離心條件下大鼠血小板回收率(%)

2.3小鼠血小板回收率 在4～12 min時(shí)間段內(nèi)，隨著離心時(shí)間的延長，300×g離心力條件下，血小板回收率先升高再降低，并在離心8 min時(shí)達(dá)到峰值；400×g離心力條件下，血小板回收率逐漸降低。見表2。

表2 不同離心條件下小鼠血小板回收率(%)

3 討 論

全血中各組分的密度不同是離心法提取血小板的基礎(chǔ)。在離心過程中，紅細(xì)胞由于密度最大最先沉降于底部，血漿由于密度最小而形成上清層，白細(xì)胞和血小板的密度介于紅細(xì)胞和血漿之間，隨著離心過程的深入逐漸堆積于兩者之間形成白膜層。本研究選用的無紡布濾器可有效濾除直徑10 μm以上的白細(xì)胞，且對直徑5 μm以下的血小板有良好的透過性[19]，提高了一次離心法制備PRP的純度。一次離心法制備PRP實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的意義在于尋找到形成白膜層前的臨界狀態(tài)，以盡可能簡單并最大量獲取上層血漿中的血小板。

離心法提取血小板過程中影響血小板回收率的因素有很多，如采血過程、抗凝方法、樣本量、離心力、離心加速度、離心時(shí)間、離心溫度、離心機(jī)類型等，其中以離心力和離心時(shí)間影響最為顯著[16]，本研究在固定其余參數(shù)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。Kü?üK等[10]、MAMMOTO等[11]和HOSHI等[13]采用一次離心法提取大、小鼠血小板時(shí)多把離心力設(shè)定在100×g～700×g，離心時(shí)間設(shè)定在5～15 min。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以300×g～600×g的離心力和4～12 min的離心時(shí)間為考察因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，綜合考察了二者對血小板回收率的交互影響作用。

研究表明，離心力相同的情況下，隨著離心時(shí)間的延長，PRP的體積逐漸增大，PRP中血小板的計(jì)數(shù)值逐漸減少。隨著離心力的增加，PRP體積增大的速度和PRP中血小板計(jì)數(shù)減少速度加快。探尋最佳離心條件的過程即是在PRP體積與PRP血小板計(jì)數(shù)值此消彼長的過程中獲取二者最大乘積時(shí)的離心力和離心時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大、小鼠抗凝全血濾除白細(xì)胞后分別以400×g和300×g的離心力離心8 min時(shí)，血小板回收率最高。離心力和離心時(shí)間應(yīng)該保持在一定范圍內(nèi)，不宜過大或過小。如果離心力過小或離心時(shí)間過短，則離心后分離出來的PRP體積有限，血小板回收率較低。相反，如果離心力過大或者離心時(shí)間過長，則血液中的血小板大部分進(jìn)入白膜層，PRP中血小板計(jì)數(shù)值很低，血小板回收率同樣不高。

4 結(jié) 論

選擇合適的離心力和離心時(shí)間，達(dá)到白膜形成前的臨界狀態(tài)，是一次離心法制備PRP的關(guān)鍵。本次實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，大、小鼠抗凝全血濾除白細(xì)胞后分別以400×g和300×g的離心力離心8 min時(shí)，血小板回收率最高。