杜曉鸝，馬 嵐，王 敏，格根塔娜，劉曉平，郭麗穎，那生桑

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 呼和浩特 010110）

藜蘆（學(xué)名：Erratum Grumman L.）是百合科植物藜蘆的干燥根及根莖，多年生草本植物；蒙藥名阿格西日嘎，別名都日吉德、黑藜蘆。味苦且辛，性平。效銳、糙、重、浮、稀，有毒。具有催吐，瀉下、祛痰、殺蟲的功效。主治中風(fēng)痰壅、癲癇、喉痹等；外用治疥癬、惡瘡、殺蟲蛆[1]。藜蘆整顆皆有毒性，尤其根和根莖的毒性最強(qiáng)。藜蘆的毒素主要為其所含有的生物堿類，總稱為藜蘆總堿。其中原藜蘆堿毒性最強(qiáng)，介藜蘆胺次之[2，3]。藜蘆生于海拔1200-3300米的山坡林下或草叢中。主產(chǎn)于中國東北、河北、山東、河南、山西、陜西、內(nèi)蒙古、甘肅、湖北、四川和貴州等地。同時亞洲北部和歐洲中部也有其分布?！督鸸庾⑨尲穂4]中提及采收季節(jié)不同，導(dǎo)致其功效差異：“都日吉德的氣味隨季節(jié)變化，氣味在催吐或?yàn)a下功效上起到主導(dǎo)的作用，用于催吐則于嫩苗時采集，用于瀉下則于8-9月份果期采集”。

藜蘆為蒙古族習(xí)用藥材，是藏醫(yī)藥古籍中“都日吉德”的蒙古地區(qū)替代品。近代蒙醫(yī)大師羅布桑教授在其學(xué)術(shù)著作《蒙藥學(xué)羅布桑學(xué)術(shù)著作大成》㈦中記載有：“杜日吉德和京大戟相近，具有瀉下和催吐功能”，并對其進(jìn)行原植物考證，認(rèn)為都日吉德的原植物為大戟科植物中尼大戟（黑.都日吉德，上品）和喜馬拉雅大戟（白.都日吉德，下品）。羅布桑教授在藜蘆藥材描述中記載道：“藜蘆為百合科多年草本黑藜蘆及同屬植物的根和根莖，5-6月抽花莖前采收，除去莖葉，曬干。蒙醫(yī)臨床上用藜蘆替代都日吉德”。吳香杰教授主編的《蒙藥炮制學(xué)》陌中介紹“都日吉德的原植物中尼大戟，產(chǎn)于西藏，來源稀少，尚無商品藥材，內(nèi)蒙地區(qū)將藜蘆用作都日吉德”。

蒙藥藜蘆炮制方法的記載有“用于催吐，則無需炮制直接入藥；用于瀉下則同大麥共炒后入藥”。蒙醫(yī)催吐法用應(yīng)用范圍較廣，用于食積不化、食痞、中毒癥、痧癥等。臨床上用腎葉橐吾、刺參、藜蘆為主藥，與菖蒲、光明鹽、蓽拔各等量配伍，并根據(jù)病癥辯證加味治療，急催用丸劑，緩催用湯劑，服用時間以黎明為宜。蒙藥中藜蘆屬瀉下藥，《晶珠本草》[5]中記載有：“都日吉德是寒熱癥總瀉藥”；藜蘆在蒙醫(yī)臨床中用于瀉下、脈瀉、鼻瀉、導(dǎo)瀉和催吐療法。藜蘆多載于蒙藥復(fù)方，經(jīng)炮制后入藥，用于治療各種“希拉”病、蟲癥、不消化癥、黃水癥等。近年來，對藜蘆屬植物中的甾體生物堿類研究較多，目前從國產(chǎn)藜蘆中已分離出70余種甾體生物堿。最新的化學(xué)和藥理研究表明，藜蘆甾體生物堿也是合成環(huán)巴胺（cyclopedia）類抗腫瘤藥物的有效先導(dǎo)物[6]。藜蘆藥材在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥材標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》中載有藜蘆十二味丸[7]，其中藜蘆藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未完善，因此藜蘆為部頒倒掛品種，亟待制定藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本品作為中藥材收載于湖南、山東、江西、貴州、吉林、新疆、四川省（自治區(qū)）中藥材標(biāo)準(zhǔn)中，載有性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、薄層鑒別、水分檢測項(xiàng)，未有含量測定項(xiàng)；其TLC鑒別項(xiàng)中對照品有原藜蘆堿A（《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)2002》）和白藜蘆醇（《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)2009》）。本品主含甾體生物堿，生物堿是其有效成分也是其毒性成分。我國有二十余種藜蘆屬植物，經(jīng)研究比較發(fā)現(xiàn)，不同品種的藜蘆屬植物其生物堿的種類和含量差異較大[8，9]，因此，對生物堿成分制定含量限度，對藜蘆藥材合理應(yīng)用具有重要意義。

表1 供試品水份含量試驗(yàn)測定結(jié)果

1 薄層鑒別

1.1 藜蘆中介芬胺、藜蘆胺、白藜蘆醇的薄層鑒別

1.1.1 試劑及藥材

丙酮（分析純）、冰乙酸（分析純）、藜蘆胺標(biāo)準(zhǔn)品由成都瑞芬思生物科技有限公司提供（批號：L-100-170622）、介芬胺標(biāo)準(zhǔn)品由成都瑞芬思生物科技有限公司提供（批號：S-143-170926）、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品由國家食品藥品研究院提供（批號：111535-201703）藜蘆藥材分別為安徽亳州河北安國四川成都（所有藥材均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥教研室渠弼教授鑒定為百合科植物藜蘆的干燥根及根莖）

1.1.2 對照品溶液的制備

取介芬胺，藜蘆胺，白藜蘆醇對照品，加甲醇制成1 mg·L-1的溶液，作為對照品溶液。

1.1.3 供試品溶液的制備

分別取不同產(chǎn)地7批次藜蘆樣品粉末2 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘留物加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

1.1.4 展開

吸取對照品溶液5 μL、供試品溶液10 μL，分別點(diǎn)于三塊硅膠G薄層板上，以石油醚（60-90℃）—乙酸乙酯—甲酸（4∶3∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果供試品與介芬胺、藜蘆胺、白藜蘆醇對照品溶液在薄層板相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2 一般檢查項(xiàng)研究

2.1 水分測定

照《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄IXH水分測定法第一法（烘干法）測定七批樣品水分。

步驟：精密稱取供試品2 g，研細(xì)，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，疏松供試品不得超過1 mm，精密稱定，打開瓶蓋在100-l05℃干燥5小時，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量（%）在（0.0133%-0.1800%）范圍之內(nèi)，未發(fā)生霉變。（2010年版《藥典》（一部）規(guī)定中藥根、根莖類用藥含水量在（9.0%-15.0%）為霉變（表1）。

2.2 酸不溶性灰分測定

照（《中國藥典》2010年版一部附錄IXK酸不溶性灰分測定法）測定七批樣品酸不溶性灰分。

步驟：精密稱取藥材3 g于坩堝中，將坩堝放入馬弗爐烘六小時取出，及時放入干燥器待冷卻稱重，再放入馬弗爐1 h，取出于干燥器冷卻稱重，兩次差值小于0.0003恒重完以后。既上相所得灰分，取上項(xiàng)所得灰分，在坩堝中小心加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10分鐘，表面皿用5 mL熱水沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘?jiān)盟从跒V紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓浚?jì)算供試品中酸不溶性灰分的含量（%）在（11.5196%—89.4963%）范圍內(nèi)（表2）。

2.3 浸出物測定

照《中華人民共和國藥典》一部附錄XA醇溶性浸出物熱浸法測定法測定。

步驟：精密稱取供試品2 g，研細(xì)，精密稱定，置100 mL的錐形瓶中，精密加70%乙醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，靜置1小時后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1小時。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器過濾，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105°C干燥3小時，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量。除另有規(guī)定外，以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）在（6.1742%-16.3767%）范圍內(nèi)（表3）。

3 含量測定

3.1 實(shí)驗(yàn)器材設(shè)備、試劑及藥材

儀器：高效液相色譜儀（島津LC-20A）

3.1.1 試劑

色譜乙腈，色譜甲醇，超純水；其他試劑均為分析純。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備

取介芬胺對照品適量，精密稱定，加甲醇制成毎1 mL含0.95 mg的介芬胺溶液，作為對照品溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備

取藜蘆藥材粉末（過篩）約2.0000 g，稱量，至具塞錐形瓶中，加入26%的濃氨試液5 mL，浸潤1小時，加三氯甲烷-甲醇（體積4∶1）混合溶液40 mL，稱重，混勻。在80℃水浴上加熱回流2小時，放冷，再稱量，用三氯甲烷-甲醇（體積4∶1）混合溶劑補(bǔ)減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得供試品溶液。

表2 供試品酸不溶性灰分測定結(jié)果

表3 供試品浸出物測定結(jié)果

3.2.3 色譜條件

色譜柱：sickroom 100-5-C18色譜柱（5 μL，4.6 mm×250 mm）；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%三乙胺水和0.1%甲酸水的混合溶液為流動相B梯度洗脫；流速1 mL?min-1；進(jìn)樣量10微升；檢測波長250 nm；柱溫：18℃（表4）。

表4 梯度洗脫程序

3.3 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL置10 mL量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取上述各濃度對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。結(jié)果峰面積與進(jìn)樣量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=1359280x+3125.4，（Y為峰面積積分值，X為進(jìn)樣量）（圖1）。

圖1 介芬胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，其相對保留時間穩(wěn)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD%為1.77%，結(jié)果表明：儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取藜蘆粉末2.0 g，精密稱定，按樣品制備方法操作制備供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12小時進(jìn)樣，樣品介芬胺峰面積的RSD為2.06%，說明供試品溶液在12小時之內(nèi)較穩(wěn)定（表5）。

表5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次藜蘆粉末6份，精密稱定，每份取樣量約為2.0 g，按照供試品溶液制備項(xiàng)下方法，連續(xù)制備6份供試品溶液，依次測定，記錄峰面積，計(jì)算RSD為2.04%，說明供試品分析的結(jié)果穩(wěn)定，表明該方法的重復(fù)性良好（表6）。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批次藜蘆粉末6份，精密稱定，每份取樣量約為1.0 g，精密加入對照品0.0024 mg，按供試品溶液制備方法制備加樣回收試樣，按上述色譜條件測定，計(jì)算平均加樣回收率為100.6%，RSD為2.00%，說明方法可行（表7）。

表7 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.8 樣品含量測定

分別取7個不同購買產(chǎn)地批次的藜蘆，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下的方法操作并測定其介芬胺的含量（表8）。

4 小結(jié)

本文分別采用介芬胺，藜蘆胺，白藜蘆醇作為對照品，對7批次樣品進(jìn)行薄層鑒別，結(jié)果供試品與介芬胺、藜蘆胺、白藜蘆醇對照品溶液在薄層板相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。相比之下，介芬胺斑點(diǎn)顏色更為清晰，含量較大，可作為藜蘆質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中薄層鑒別項(xiàng)下的檢查項(xiàng)之一。

檢測波長的選擇：參考文獻(xiàn)中對其它植物中介芬胺的提取檢測波長條件，并通過紫外分光光度儀吸光度值來確定藜蘆里介芬胺的含量測定，最佳吸收波長為250 nm。

流動相的選擇：采用乙腈為流動相A，0.1%三乙胺水和0.1%甲酸水的混合溶液為流動相B梯度洗脫，以洗脫時間20-30 min，A-B（30∶70）出峰時間適中，色譜峰峰形理想，分離度較好（圖2）。因此，選此條件作為流動相。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果，可以看出不同地區(qū)所購買的藜蘆中介芬胺含量在5.74-6.98%之間，藜蘆質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文含量測定項(xiàng)暫定為：本品每1克含介芬胺（C27H39N03）的含量不得少于5.74 mg·g-1。

5 討論

薄層色譜圖可見：供試品與白藜蘆醇對照品相應(yīng)的位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)但顏色淺，表明7批藥材里均含有白藜蘆醇，但含量少；供試品與介芬胺對照品相應(yīng)的位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)且明顯，表明7批藥材里均含有介芬胺，且含量多；供試品與藜蘆胺對照品相應(yīng)的位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)但不明顯，表明7批藥材里均含有藜蘆胺，但含量少。含量的多少可能受到藥材生長年限、采集時間等因素的影響。

本實(shí)驗(yàn)所購買的藜蘆，其中亳州和安國據(jù)經(jīng)銷商表述產(chǎn)地為東北，重慶產(chǎn)地四川。對此7批次樣品進(jìn)行介芬胺的薄層鑒別、含量測定及比較，初步證實(shí)東北、四川產(chǎn)地藜蘆中介芬胺含量差異不顯著，但樣品采集、收集量較局限，尚不能就此得出全國其他地區(qū)所產(chǎn)介芬胺含量情況。

表8 樣品測定結(jié)果（n=2）

圖2