薛文達(dá)，聶瑞芳，周 童，陳 剛，王福順，王 薇,,4＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究中心/中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)心理學(xué)院 南京 210023；4.南通大學(xué)神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心 南通 226001）

抑郁癥是一種以抑郁為主要癥狀的心境障礙或情感性障礙，常伴有自殺傾向而導(dǎo)致高死亡率和致殘率，不利于個(gè)人的健康和社會(huì)的穩(wěn)定[1，2]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多元，具體的病因現(xiàn)在仍然不是十分清楚。

目前臨床上用于治療抑郁癥的藥物大多起效緩慢、作用有限并且長期服用有毒副作用。近年來，氯胺酮以其快速持久抗抑郁作用成為抑郁癥研究中的熱點(diǎn)[3，4]。但是氯胺酮具有成癮性、肝毒性、神經(jīng)毒性等副作用，從而限制了其臨床應(yīng)用。中醫(yī)藥治療抑郁癥經(jīng)驗(yàn)豐富，方藥眾多，且副作用小。其中，越鞠丸出自《丹溪心法·六郁》，由香附、川芎、梔子、蒼術(shù)、神曲五味藥組成，是治療郁證的經(jīng)典方。由于抑郁癥與郁證具有相似性，因而越鞠丸也被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代抑郁癥的治療[5]。我們前期研究結(jié)果表明越鞠丸具有快速抗抑郁作用，并且越鞠丸的這種快速解郁與氯胺酮作用效果相似[6，7]。

在越鞠丸抗抑郁研究中發(fā)現(xiàn)，不同品系的小鼠對于越鞠丸易感性反應(yīng)不同[8]。對于人體各類疾病包括神經(jīng)精神疾病而言，小鼠是重要的模式動(dòng)物，特別在疾病遺傳物質(zhì)研究方面，小鼠具有多方面的優(yōu)勢。在以小鼠作為模式動(dòng)物研究抑郁相關(guān)行為時(shí)，不同的品系，如近交系與遠(yuǎn)交系之間存在巨大的差異，不同的近交系小鼠之間也有明顯的差異性。近交系小鼠Balb/c、C57BL/6J、DBA/2J和遠(yuǎn)交系小鼠Swiss Webster在抗壓方面的基底敏感性上有很大差異，這顯示出遺傳背景的影響作用[9]；對于慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型來說，Balb/c小鼠比Swiss小鼠更敏感[10]；而在產(chǎn)后母嬰分離模型中，8種近交系小鼠（分別是129S1/SvImJ、129P3/J、A/J、Balb/cJ、Balb/cByJ、C57BL/6J、DBA/2J、FVB/NJ）在焦慮和抑郁表型上也表現(xiàn)出明顯不同[11]。這些結(jié)果也表明不同品系小鼠由于遺傳變異性不同，導(dǎo)致其對抑郁樣反應(yīng)易感性存在差異。

前額皮層是重要的加工整合中樞，更是情感回路中的核心結(jié)構(gòu)[12]。近年來，人們越來越多地關(guān)注前額皮層相關(guān)通路是如何促進(jìn)認(rèn)知功能和情緒調(diào)節(jié)的[13-15]。研究認(rèn)為前額皮層的病理生理學(xué)與多種精神疾病有關(guān)，包括精神分裂癥和抑郁癥[16，17]。目前已經(jīng)證明，前額皮層相關(guān)通路暴露于急性或慢性應(yīng)激源后，神經(jīng)可塑性受損，并已確定抗抑郁藥物和抗精神病藥物可以恢復(fù)應(yīng)激動(dòng)物的神經(jīng)可塑性[18]?？紤]到有報(bào)道稱氯胺酮對神經(jīng)可塑性的早期影響可能與氯胺酮的抗精神病作用以及長期抗抑郁作用有關(guān)[19]，因而我們研究越鞠丸對于抑郁樣小鼠前額皮層通路的場電位及長時(shí)程增強(qiáng)的影響。

本研究針對近交系Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠，擬采用行為學(xué)測試和離體腦片電生理檢測，來分析越鞠丸在這兩個(gè)品系小鼠中的抗抑郁作用差異以及對小鼠前額皮層突觸傳遞的影響，以探討越鞠丸在不同品系小鼠中作用差異的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，為臨床用藥提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠，雄性，7-8周齡，各30只，體質(zhì)量20-24 g，購自南京市江寧青龍山動(dòng)物繁殖場（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2014-0002）。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周，屏障間環(huán)境溫度20-24℃，濕度40%-60%，晝夜交替時(shí)間12 h，小鼠可自由攝食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)中所用中藥材購自南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部藥房。越鞠丸由香附100 g、梔子100 g、川芎100 g、蒼術(shù)100 g、神曲100 g組成，將藥材打粉后過100目篩混勻?；旌虾髮⑺幏劢萦?5%乙醇（6倍體積）中48 h，期間不停攬拌，靜置后收集上清液，重復(fù)2次，收集3次獲取的上清液，過濾，于55℃減壓濃縮至無乙醇，獲得醇提越鞠丸。藥物制備好后于-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前用生理鹽水配制成所需濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

人工腦脊液（ACSF）（NaCl 119 mmol·L-1，KCl 2.5 mmol·L-1，NaH2PO41 mmol·L-1，NaHCO326.2 mmol·L-1，MgCl21.3 mmol·L-1，D-glucose 11 mmol·L-1，CaCl22.5 mmol·L-1，pH=7.4-7.5）；切片準(zhǔn)備液（cutting solution）（Sucrose 194 mmol·L-1，NaCl 29.95 mmol·L-1，KCl 4.56 mmol·L-1，NaH2PO41.17 mmol·L-1，NaHCO325.96 mmol·L-1，MgCl20.1 mmol· L-1，D-glucose 9.99 mmol· L-1，CaCl21 mmol·L-1），實(shí)驗(yàn)所用試劑均購自中國國藥公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（南京金正教學(xué)儀器有限公司，RE-852）；超聲清洗機(jī)（上海 Branson公司，SB5200-型）；臺(tái)式離心機(jī)（德國Hermle公司，Z-32）；電子天平（METTLER公司，AE100）；振動(dòng)切片機(jī)（德國leika公司，VT1200S型）；電極拉制儀（德國DMZ公司）；顯微操縱儀（美國Sutter公司，ROE-200）；記錄分析軟件（美國Axon公司，PClamp10.1）；放大器（美國Axon公司，MultiClamp700B）；可編程刺激器（以色列A.M.P.I公司，Master-8）；隔離器（以色列A.M.P.I公司）；蠕動(dòng)泵（中國潤澤公司）。

1.4 強(qiáng)迫游泳測試

將Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠，分別隨機(jī)分為空白對照組（Con）與越鞠丸給藥組（YJ）?？瞻讓φ战M：小鼠腹腔注射生理鹽水；越鞠丸給藥組：小鼠灌胃給予越鞠丸。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥30 min后進(jìn)行行為學(xué)測試。強(qiáng)迫游泳測試如下：將小鼠放入高30 cm、直徑18 cm的圓柱形玻璃缸中，缸中水深10 cm，水溫（25±2）℃ ，觀察小鼠在缸中游泳6 min，記錄后4 min內(nèi)小鼠的累積不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間是指小鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)，或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面的時(shí)間。行為分析采用ANY-maze軟件。

1.5 腦片制備

圖1 越鞠丸在Balb/c小鼠與C57BL/6J小鼠上的抗抑郁作用

小鼠灌胃給予越鞠丸，給藥30 min后經(jīng)吸入異氟烷麻醉后斷頭取腦，從斷頭至腦組織取出時(shí)間應(yīng)小于1 min，完整取出腦組織修形后用少量502膠將其與切片機(jī)標(biāo)本托垂直粘合后置于切片槽中，隨后置于蔗糖冰水混合溶液中冷卻，在同樣的溶液中用振動(dòng)切片機(jī)將包含前額葉的前腦冠狀位切片，厚度為300 μm。將腦片轉(zhuǎn)至32℃的人工腦脊液中孵育1 h，然后室溫下孵育30 min。所有溶液均持續(xù)給予95%O2和5%CO2的混合氣體，并維持pH值7.4-7.5。

1.6 電生理細(xì)胞外場電位和長時(shí)程增強(qiáng)作用的記錄

腦片孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)移至灌流槽的載玻片上，用蓋網(wǎng)固定，以1-2 mL·min-1持續(xù)灌流腦片，持續(xù)給予95%O2和5%CO2的混合氣體，刺激電極置于前額葉皮層第ⅴ層，玻璃記錄電極充灌人工腦脊液作為電極內(nèi)液并置于前額葉皮層第Ⅱ-Ⅲ層。連接MultiClamp700B放大器，在電流鉗（Current-clamp mode）模式下，用0.03 Hz的刺激頻率誘發(fā)場電位，并記錄波形。相同刺激頻率誘發(fā)場電位后記錄20 min。當(dāng)場電位記錄基線穩(wěn)定記錄10 min后，給予4×100 HZ的高頻theta波刺激（high frequency stimulation，HFS）來誘發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)，引起場電位幅度大于50%的變化并持續(xù)記錄60 min為誘發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)成功。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)均采用xˉ±s表示。組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 越鞠丸在Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠上抗抑郁作用比較

強(qiáng)迫游泳測試結(jié)果顯示，與對照組相比，單次給予越鞠丸，能夠顯著減少Balb/c小鼠的不動(dòng)時(shí)間（P＜0.001）（圖1A），表現(xiàn)出抗抑郁作用；而與對照組相比，單次給予越鞠丸，C57BL/6J小鼠的不動(dòng)時(shí)間則無顯著性變化（P＞0.05）（圖1B）。

2.2 Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠PFC區(qū)的fEPSP比較

小鼠腦片PFC區(qū)電生理實(shí)驗(yàn)記錄（圖2），結(jié)果顯示Balb/c小鼠的越鞠丸組與對照組相比，fEPSP斜率百分比顯著升高（P ＜ 0.01）（圖2A）；而C57BL/6J小鼠的越鞠丸組和對照組相比，fEPSP斜率百分比則無顯著性差異（P＞0.05）（圖2B）。

2.3 Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠PFC區(qū)的LTP比較

fEPSP記錄后給予HFS來誘發(fā)LTP，結(jié)果顯示Balb/c小鼠與C57BL/6J小鼠的對照組和越鞠丸組的斜率都顯著增加，表明給予HFS后能夠成功誘發(fā)出穩(wěn)定的LTP，提示給予HFS后均能在Balb/c小鼠與C57BL/6J小鼠中誘發(fā)前額皮層神經(jīng)元突觸傳遞的明顯增強(qiáng)（圖3）。其中，Balb/c小鼠的越鞠丸組與對照組相比，fEPSP斜率百分比顯著升高（P ＜0.01）（圖3A）；而C57BL/6J小鼠越鞠丸組和對照組相比，fEPSP斜率百分比則無顯著性差異（P＞0.05）（圖3B）。

3 討論

本研究比較分析了越鞠丸在Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠中的抗抑郁作用，結(jié)果顯示越鞠丸能夠改善Balb/c小鼠的抑郁樣表型；進(jìn)一步檢測兩個(gè)品系小鼠腦片前額皮層區(qū)的場電位和長時(shí)程增強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)越鞠丸能夠增加Balb/c小鼠前額皮層的場電位及長時(shí)程增強(qiáng)，提示越鞠丸通過提高突觸傳遞效能，從而產(chǎn)生抗抑郁作用。

圖2 Balb/c小鼠與C57BL/6J小鼠腦片PFC區(qū)fEPSP的比較 數(shù)字橫縱坐標(biāo)向內(nèi)

圖3 Balb/c小鼠與C57BL/6J小鼠腦片PFC區(qū)LTP的比較 數(shù)字橫縱坐標(biāo)向內(nèi)

越鞠丸，功用行氣解郁，是治療郁證的經(jīng)典方，然而其作用特點(diǎn)和分子機(jī)制的研究相對較少。我們前期研究結(jié)果支持越鞠丸的抗抑郁作用具有快速性的特點(diǎn)：運(yùn)用動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)越鞠丸醇提物單次灌胃一天后即可檢測到對獲得性無助抑郁行為的緩解作用[6]，而常規(guī)單胺類藥物在此模型上至少需要七天以上處理時(shí)間才能起作用[7]，并且越鞠丸的快速抗抑郁作用效果與氯胺酮相似；另外，應(yīng)用模擬臨床慢性抑郁的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)單次給予越鞠丸兩小時(shí)后，可產(chǎn)生與氯胺酮類似的緩解快感缺失的癥狀，與之相比，5-HT重?cái)z取抑制劑（SSRIs）類代表性藥物氟西汀就不能起效。本研究選用強(qiáng)迫游泳測試來檢測越鞠丸在兩種近交品系小鼠中的抗抑郁作用。而小鼠強(qiáng)迫游泳測試在行為藥理實(shí)驗(yàn)中，對于抗抑郁藥物的快速篩選至關(guān)重要，在行為學(xué)測試中強(qiáng)迫游泳應(yīng)激可以使小鼠出現(xiàn)行為絕望狀態(tài)。而在本研究中，單次給予越鞠丸，能夠顯著降低Balb/c小鼠在強(qiáng)迫游泳測試中的不動(dòng)時(shí)間，有效改善Balb/c小鼠的抑郁樣狀態(tài)。

就抑郁癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制來說，目前更廣泛認(rèn)同的是神經(jīng)可塑性假說，該假說認(rèn)為抑郁癥主要是由情感相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)可塑性在應(yīng)對不良適應(yīng)比如應(yīng)激時(shí)所引起的，而抗抑郁藥物則是在抗抑郁治療中所引起的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)特定基因和蛋白質(zhì)、神經(jīng)系統(tǒng)可塑性等方面的變化是抗抑郁作用的微觀基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)，越鞠丸醇提物具有快速起效的抗抑郁作用，這種作用可以迅速增強(qiáng)海馬腦區(qū)腦源性神經(jīng)生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)[6]，并持久激活環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）信號(hào)，提示CREB及其相關(guān)的突觸可塑性信號(hào)通過調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)參與了越鞠丸的快速抗抑郁作用[8]。后續(xù)研究中我們發(fā)現(xiàn)越鞠丸的快速抗抑郁作用與激活PKA-CREB-BDNF信號(hào)通路相關(guān)。cAMP依賴蛋白激酶（cAMP-dependent protein kinase，PKA）可以磷酸化并激活CREB，而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）則是PKA-CREB信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)蛋白，因而PKA-ERK-CREB信號(hào)通路在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和抗抑郁機(jī)制中起著重要作用。任荔等[7]研究顯示與抑郁模型小鼠相比，越鞠丸給藥小鼠的海馬中PKA、CREB信號(hào)顯著上調(diào)，這說明越鞠丸特異性地作用于該信號(hào)通路。有研究表明，蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamcycin，mTOR）參與了氯胺酮的快速抗抑郁過程。而我們的研究顯示，越鞠丸也可快速激活A(yù)kt、mTOR，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)可塑性變化，從而在動(dòng)物模型上表現(xiàn)出明顯的抗抑郁作用。mTOR與神經(jīng)元的長時(shí)程增強(qiáng)和長時(shí)程抑制的誘導(dǎo)和維持有關(guān)，進(jìn)而影響突觸傳遞。突觸傳遞是調(diào)控突觸可塑性穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制之一，而fEPSP和LTP則是突觸傳遞重要的表現(xiàn)形式[20，21]。很多研究證明LTP的增加與AMPA受體在膜上的增加有關(guān)，從而增加了谷氨酸能的傳遞[22]，這與我們前期驗(yàn)證越鞠丸改變了前額皮層上NMDAR與AMPAR的比例關(guān)系結(jié)果相一致[23]。本研究的電生理實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，在Balb/c小鼠中，越鞠丸組較對照組的fEPSP斜率百分比顯著升高，且在給予HFS誘發(fā)LTP后越鞠丸組的fEPSP斜率百分比明顯上升，表明越鞠丸增強(qiáng)了Balb/c小鼠前額皮層突觸傳遞。

本研究中C57BL/6J小鼠與Balb/c小鼠在同等條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但是C57BL/6J小鼠在行為學(xué)測試與電生理測試中結(jié)果顯示均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明不同品系的小鼠對于越鞠丸易感性反應(yīng)不同，這種品系易感性差異可能與動(dòng)物的遺傳背景密切相關(guān)[24]。Bearss等研究發(fā)現(xiàn)Balb/c和C57BL/6的免疫應(yīng)答包括細(xì)胞募集動(dòng)力學(xué)和下游細(xì)胞功能不同[25]。Tarantino等研究顯示與C57BL/6小鼠相比，Balb/c小鼠在焦慮和抑郁的行為模型中被認(rèn)為是更適合的研究對象[26]。通過不同品系小鼠的行為、細(xì)胞、分子多層次研究來分析抑郁癥的病因病機(jī)，可提供更適合的抑郁癥研究模型和更科學(xué)的抗抑郁藥效測試[27]。在遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)上對不同品系小鼠進(jìn)行辨證論治，也是中醫(yī)證候模型的一大研究方向。

本研究通過行為學(xué)測試來分析越鞠丸在近交系Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠中的抗抑郁作用差異，并利用電生理學(xué)方法來研究越鞠丸對小鼠前額皮層基礎(chǔ)場電位及長時(shí)程增強(qiáng)的影響，探討越鞠丸在兩個(gè)品系小鼠中突觸傳遞效能作用差異的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。下一步應(yīng)繼續(xù)研究越鞠丸對于基礎(chǔ)場電位及長時(shí)程增強(qiáng)的影響是如何產(chǎn)生作用的，進(jìn)一步深入分析越鞠丸發(fā)揮持久抗抑郁作用的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。