江虹,吳小燕,胡金來(lái)

(長(zhǎng)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 408100)

卡馬西平是一種神經(jīng)系統(tǒng)類藥物，具有抗驚厥、抗外周神經(jīng)痛、抗利尿、抗心律失常等作用，臨床上廣泛應(yīng)用。但卡馬西平副作用很大，如：胃部不適反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、頭暈嗜睡、發(fā)熱、惡心、嘔吐、乏力、再生障礙性貧血和中毒性肝炎等。當(dāng)用藥過(guò)量時(shí)，卡馬西平還可透過(guò)胎盤屏障，通過(guò)乳汁分泌，對(duì)孕婦和哺乳人體造成不良影響，對(duì)老年人，則可引起精神錯(cuò)亂、焦慮、激動(dòng)不安、房室傳導(dǎo)阻滯或心動(dòng)過(guò)緩等。可見合理使用卡馬西平對(duì)人體健康有著重要意義。

畜牧業(yè)中，為了預(yù)防和治療畜禽疫病，促進(jìn)畜禽快速增重、催肥，有的甚至為了達(dá)到謀取更多經(jīng)濟(jì)利益的目的，廣泛使用各種藥物，其中包括使用大量的抗生素、磺胺類及鎮(zhèn)靜、抗驚厥藥物等。這些藥物使用后，部分藥物被分解或直接排出體外，另一部分將殘留在畜禽體內(nèi)，殘留的藥物將對(duì)食用者造成不良影響，若長(zhǎng)時(shí)間食用含這些殘留藥物的食品，這些藥物會(huì)在體內(nèi)蓄積，當(dāng)達(dá)到一定濃度，則會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用；使某些細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，當(dāng)發(fā)生疾病時(shí)，再用藥物治療則會(huì)相當(dāng)困難；過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重者可造成休克；造成菌群平衡失調(diào)，導(dǎo)致長(zhǎng)期腹瀉或引起維生素缺乏；有的殘留藥物還具致癌作用等。我國(guó)農(nóng)業(yè)部176 號(hào)公告規(guī)定，嚴(yán)禁在動(dòng)物飼料和飲用水中添加鎮(zhèn)靜、抗驚厥藥物，在動(dòng)物源食品中也不得檢出此類藥物。鑒于此，研究動(dòng)物源性食品中殘留的鎮(zhèn)靜、抗驚厥藥物——卡馬西平具有一定意義。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)卡馬西平的方法主要有：高效液相色譜法[1-9]、液質(zhì)聯(lián)用[10-13]、熒光法[14]、分光光度法[15]、電化學(xué)法[16-19]等。已報(bào)道的分光光度法中，文獻(xiàn)[15] 的表觀摩爾吸光系數(shù)只有1.9×103L/(mol·cm)，靈敏度較低。本工作以固綠FCF作探針，采用多波長(zhǎng)可見吸收光譜法(表觀摩爾吸光系數(shù)為5.13×104～1.76×105L/(mol·cm))來(lái)研究畜禽肉中殘留卡馬西平的含量，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三羥甲基氨基甲烷(Tris)：99.9%，齊一生物科技(上海)有限公司；卡馬西平對(duì)照品：99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100142-201105；固綠FCF：99%，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；鹽酸：AR級(jí)，重慶川東(化工)集團(tuán)有限公司；豬肉(1#)、兔肉(2#)、鴨肉(3#)：市售。

Tris-HCl溶液：pH值3.0～9.5(用0.20 mol/L Tris與0.10 mol/L HCl混合，酸度計(jì)測(cè)定)；卡馬西平(carbamazepine，簡(jiǎn)寫為CAM)標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取適量卡馬西平對(duì)照品，加少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容，即配成質(zhì)量濃度為236.3 mg/L的溶液，冰箱4℃ 保存，臨用時(shí)稀釋10倍；固綠FCF(fast green FCF，簡(jiǎn)寫為FCF)溶液：準(zhǔn)確稱取適量固綠FCF，用水溶解后配成1.00×10-3mol/L；二次蒸餾水；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

精密酸度計(jì)：pHS-3C型，上海虹益儀器儀表有限公司；紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)：U-4100型，日本日立公司。

1.3 樣品處理

取市場(chǎng)采購(gòu)的豬(1#)、兔(2#)、鴨(3#)生鮮肉樣品洗凈、去皮、切條、攪碎成肉末。分別準(zhǔn)確稱取樣品1# 15.000 6 g，2# 15.000 2 g，3# 15.000 5 g于離心試管中，加入10 mL甲醇，攪拌均勻后超聲提取40 min(使卡馬西平充分溶出),再以4 000 r/min離心20 min，取上清液，再重復(fù)提取1次，2次上清液合并，加甲醇20 mL，超聲提取30 min，以4 000 r/min離心30 min(使蛋白質(zhì)變性沉淀)，上清液轉(zhuǎn)入100 mL燒杯中，在通風(fēng)櫥內(nèi)100 ℃恒溫水浴中濃縮至3 mL左右，即為待測(cè)樣品溶液。各平行處理5份。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取10 mL具塞比色管，準(zhǔn)確加入0.50 mL pH 3.59 Tris-HCl溶液、適量23.63 mg/L CAM標(biāo)準(zhǔn)溶液及2.00 mL 1.00×10-3mol/L FCF溶液，用水定容，搖勻，靜置10 min后，以試劑空白作參比，在分光光度計(jì)上掃描吸收光譜，記錄可見光區(qū)3個(gè)明顯負(fù)吸收峰處的吸光度A424、A558及A660,用單波長(zhǎng)、雙波長(zhǎng)或三波長(zhǎng)法作顯色條件及樣品分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二元締合物的吸收光譜特征

由圖1可見，CAM基本無(wú)吸收；FCF的酸性溶液有強(qiáng)吸收，λmax=625 nm，A=2.33；FCF在pH值3.59 的溶液中加入不同濃度的CAM標(biāo)準(zhǔn)溶液后，體系溶液顏色變淺，發(fā)生褪色現(xiàn)象，光譜曲線上出現(xiàn)3個(gè)明顯的負(fù)吸收峰，最大、次大和相對(duì)最小的負(fù)吸收峰分別位于660 nm(紅移35 nm)、558 nm(藍(lán)移67 nm)和424 nm(紫移201 nm)。波移表明，CAM和FCF在酸性Tris-HCl介質(zhì)中確實(shí)生成了新物質(zhì)；再?gòu)腃AM和FCF的結(jié)構(gòu)看，F(xiàn)CF是1種三苯甲烷類的酸性染料，結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)磺酸根離子，CAM結(jié)構(gòu)中有含孤對(duì)電子的氮原子，可以接受質(zhì)子形成陽(yáng)離子，因此，這二者間可以靜電引力結(jié)合，這進(jìn)一步表明CAM和FCF之間確實(shí)可以反應(yīng)生成新物質(zhì)。從曲線3～10 可知，隨著CAM質(zhì)量濃度的增加，3個(gè)負(fù)吸收波長(zhǎng)處的負(fù)吸光強(qiáng)度呈線性增大，即一定質(zhì)量濃度范圍的CAM與新物質(zhì)的吸光度絕對(duì)值(│A│)在424 nm、558 nm及660 nm處呈線性關(guān)系，服從朗伯-比爾定律。由于吸光度具有加和性，可用雙波長(zhǎng)(558 nm+660 nm)或三波長(zhǎng)(424 nm+558 nm+660 nm)疊加法測(cè)定CAM，并服從朗伯-比爾定律，其靈敏度以可見光(visible light, VIS)區(qū)單波長(zhǎng)法(single wavelengh method, SWO)、雙波長(zhǎng)法(double wavelength method, DWO)到三波長(zhǎng)法(three wavelength method, TWO)依次增大。故單波長(zhǎng)、雙波長(zhǎng)及三波長(zhǎng)法均可用于CAM的定量測(cè)定。

1-CAM(2.36 mg/L), 水作參比;2-FCF (2.00×10-5 mol/L), 水作參比; 3～10-CAM(0.473, 0.945, 1.42, 1.89, 2.36, 2.84, 3.31, 3.78 mg/L)-FCF(2.00×10-4 mol/L), 試劑空白作參比;pH 3.59

圖1 CAM-FCF的吸收光譜

Fig.1 The absorption spectra of CAM-FCF

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 反應(yīng)介質(zhì)及pH值的選擇

室溫下，按實(shí)驗(yàn)方法考察了HAc-NaAc、Tris-HCl、HCl、NaOH溶液對(duì)體系在可見光區(qū)424、558及660 nm 3個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度絕對(duì)值(│A│)，結(jié)果表明，體系在Tris-HCl溶液中，│A│較大且重現(xiàn)性較好，故實(shí)驗(yàn)用Tris-HCl作介質(zhì)。繼而考察了不同pH值的Tris-HCl溶液在3個(gè)負(fù)吸收波長(zhǎng)處的│A│，如圖2所示。結(jié)果表明，pH 3.59時(shí)，│A│最大，體系有高靈敏度。實(shí)驗(yàn)選用pH值3.59 Tris-HCl溶液，最佳用量為0.50 mL。圖2表明，TWO-VIS法的靈敏度最高，DWO-VIS次之。

1-424 nm; 2-558 nm; 3-660 nm; 4-(558+660) nm;5-(424+558+660) nm

圖2 pH值對(duì)│A│的影響

Fig.2 Effect of buffer pH on │A│

2.2.2 FCF溶液濃度的選擇

室溫下，按實(shí)驗(yàn)方法考察了1.00×10-3mol/L FCF溶液在不同用量時(shí)對(duì)可見光區(qū)424、558及660 nm 3個(gè)負(fù)吸收波長(zhǎng)處的│A│，圖3所示。

1-424 nm; 2-558 nm; 3-660 nm; 4-(558+660) nm;5-(424+558+660) nm

圖3 固綠FCF 溶液濃度對(duì)│A│的影響

Fig.3 Effect of fast green FCF concentration on │A│

結(jié)果表明，F(xiàn)CF溶液用量為2.00 mL時(shí)，│A│最大，靈敏度最高，即FCF溶液濃度為2.00×10-4mol/L時(shí)，體系│A│最大。故實(shí)驗(yàn)用2.00 mL 1.0×10-3mol/L FCF溶液。圖3表明，TWO-VIS法的靈敏度最高，DWO-VIS次之。

2.2.3 試劑加入順序的選擇

按實(shí)驗(yàn)方法考察了試劑加入順序?qū)梢姽鈪^(qū)3個(gè)負(fù)吸收波長(zhǎng)處的│A│。結(jié)果表明，加入順序?yàn)門ris-HCl、CAM、FCF時(shí)，體系│A│相對(duì)最大，靈敏度最高。故實(shí)驗(yàn)按試劑最佳加入順序進(jìn)行。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的選擇

在最優(yōu)條件下，考察了時(shí)間對(duì)體系在可見光區(qū)3個(gè)負(fù)吸收波長(zhǎng)處的│A│。結(jié)果表明，10 min內(nèi)，反應(yīng)即可進(jìn)行完全。反應(yīng)開始至10 min前，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，可見光區(qū)3個(gè)負(fù)吸收波長(zhǎng)處的│A│逐漸增大，│A│-t曲線為一條斜線，說(shuō)明此段時(shí)間內(nèi)反應(yīng)并未完全。10 min后，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，│A│不再增大，│A│-t曲線處于平穩(wěn)狀態(tài)，這說(shuō)明10 min后反應(yīng)即已完全，穩(wěn)定時(shí)間至少1.0 h。故實(shí)驗(yàn)選在10 min后進(jìn)行測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最優(yōu)條件下，按實(shí)驗(yàn)方法配制CAM標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并掃描吸收光譜，作A-ρ標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)見表1。

圖4 卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.4 Standard curve of carbamazepine

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)

Table 1 Related parameters of standard curves

方法波長(zhǎng)λ/nm回歸方程ρ/(mg·L-1)相關(guān)系數(shù)/r線性范圍ρ/(mg·L-1)表觀摩爾吸光系數(shù)κ/(L·(mol·cm)-1)檢出限ρ/(mg·L-1)定量限ρ/(mg·kg-1)SWO-VIS424A=0.002 21-0.219 4 ρ 0.999 60.05～3.85.13×1040.0500.11SWO-VIS558A=0.002 04-0.245 2 ρ0.999 70.05～3.85.71×1040.0480.11SWO-VIS660A=0.003 01-0.288 0 ρ0.999 80.05～3.86.74×1040.0460.10DWO-VIS558+660A=0.005 05-0.533 2 ρ0.999 00.05～3.81.25×1050.0240.053TWO-VIS424+558+660A=0.007 26-0.752 6 ρ0.999 90.05～3.81.76×105 0.0160.036

2.4 干擾試驗(yàn)

2.5 樣品分析

取1#～3# 待測(cè)液(代替1.4 節(jié)中的CAM標(biāo)準(zhǔn)溶液)，分別用三波長(zhǎng)疊加法(靈敏度相對(duì)最高)按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析，求待測(cè)樣液中卡馬西平的含量，并與高靈敏的共振瑞利散射(resonance rayleigh scattering, RRS)法測(cè)定結(jié)果相比較。同時(shí)以空白豬肉樣、兔肉樣及鴨肉樣為樣品，分別進(jìn)行3個(gè)不同加標(biāo)水平的回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定5份，分別計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，并以此判斷方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果及回收試驗(yàn)(n=5)

注：ND為未檢出

如表2所示，三波長(zhǎng)法測(cè)定結(jié)果與RRS一致，其準(zhǔn)確度(98.4%～102%)和精密度(2.4%～3.2%)較高，符合定量分析要求。

3 結(jié)論

以FCF作探針的SWO-VIS、DWO-VIS及TWO-VIS法均可用于肉食品中殘留卡馬西平含量的測(cè)定，方法有較高的靈敏度和選擇性，準(zhǔn)確度和精密度滿足定量分析要求，操作簡(jiǎn)便、快速，所用儀器價(jià)廉易于普及。方法適于批量畜禽肉中殘留卡馬西平的測(cè)定。