段斌，葛永紅,2*，李燦嬰,2，魏美林，陳延儒，唐琦，李雪

1(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013) 2(遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013)

香菜(CoriandrumsativumL.)別名芫荽，富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素、胡蘿卜素、鈣、鈉、鐵、膳食纖維等人體所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微量元素[1-2]，成熟香菜含有豐富的飽和及不飽和脂肪酸[3]，有特殊濃厚的芳香氣味，是最廣泛使用的藥用植物，具有營(yíng)養(yǎng)和藥用的雙重特性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，超臨界CO2萃取的香菜精油對(duì)人的增值癌細(xì)胞具有良好的抵抗作用[5]。

香菜精油中含有多種活性物質(zhì)，隋華嵩等[6]在提取泰國(guó)和我國(guó)云南省香菜的揮發(fā)性成分時(shí)，鑒定出40種和31種化學(xué)成分，主要是醛類(lèi)和醇類(lèi)。DUA等[7]測(cè)定和分析了香菜種子中的精油含有抗壞血酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.287 mg/g)、生育酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.181 mg/g)、總多酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.7 mg/g)、沒(méi)食子酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.173 mg/g)、槲皮素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.608 mg/g)等抗氧化物質(zhì)。MSAADA等[8]研究表明，香菜精油對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基有明顯的清除能力。香菜精油對(duì)微生物也有抑制作用，李煜彬等研究發(fā)現(xiàn)香菜精油對(duì)黑曲霉抑菌圈直徑為30 mm，釀酒酵母抑菌圈直徑為23 mm[9]。粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)可以引起番茄[10]、蘋(píng)果[11]等果蔬的采后病害，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。此外，T.roseum還能分泌單端孢霉烯毒素，屬于一類(lèi)倍半萜環(huán)氧化物[12]，此類(lèi)化合物對(duì)幾乎所有真核生物，包括植物、動(dòng)物及人類(lèi)均具有一定的毒性[13]。

長(zhǎng)時(shí)間使用殺菌劑，尤其是高濃度下，可以引起病原體的抗性，對(duì)環(huán)境有一定的污染[14]。此外，殺菌劑殘留會(huì)對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生危害，用精油替代，可以提高水果的安全性[15]。

本研究以香菜為試材，研究香菜精油黃酮類(lèi)物質(zhì)在波長(zhǎng)510 nm下的吸光度[16]，來(lái)確定其對(duì)溫度、紫外、pH值、氧化劑和還原劑以及常見(jiàn)食品添加劑的穩(wěn)定性，對(duì)T.roseum的抑制效果及對(duì)ABTS自由基的清除作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菜，購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

經(jīng)鑒定并保存于實(shí)驗(yàn)室的粉紅單端孢(T.roseum)，最初從典型霉心病的蘋(píng)果果實(shí)上分離，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)多次分離，使用前進(jìn)行活化和致病性檢驗(yàn)。

乙醇、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、亞硫酸鈉(Na2SO3)、苯甲酸鈉、羧甲基纖維素鈉(CMC)、抗壞血酸、過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)、ABTS等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；HS-1300-U超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；U-LH50HG奧林巴斯CX31熒光顯微鏡，北京同舟同德儀器儀表有限公司； RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 香菜浸出液的制備

取新鮮香菜，去黃葉、洗凈、晾干、切段、液氮速凍，然后用組織研磨儀進(jìn)行研磨，待解凍，用3層無(wú)菌紗布過(guò)濾得香菜浸出液，作為 100%原液。

1.3.2 乙醇和水提取精油的制備

參考李興鳴等[17]方法并修改。將上述研磨的香菜，分別用料液比1∶30(g∶mL)的乙醇和水浸泡12 h，抽濾，在5 000 r/min離心20 min，然后棄去沉淀，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40 ℃，120 r/min)，收集提取液儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 抑菌作用

1.4.1 菌種的活化及孢子懸浮液配制

將PDA高溫滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，按無(wú)菌操作法制成平板。然后將供試菌株用接種環(huán)挑取少量菌種，按照平板畫(huà)線(xiàn)法接種于PDA上，放置在24 ℃的恒溫箱培養(yǎng)5 d進(jìn)行活化。

取上述菌株，加入10 mL無(wú)菌水(含0.01% Tween 20)，用涂布棒刮下菌層轉(zhuǎn)入三角瓶中，振蕩15 s，再用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算并稀釋孢子濃度到1×106個(gè)孢子/mL。

1.4.2 原液及提取液抑菌率測(cè)定

采用濾紙片法測(cè)定抑菌作用。選用1號(hào)定性濾紙，用打孔器制作直徑為0.6 cm的圓片，置平皿內(nèi)高溫滅菌(121 ℃，20 min)。取滅菌濾紙片在原液、水提液和醇提液中浸泡12 h，取1.0 mL菌懸液放置在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌三角涂布棒涂勻，將含浸出汁的濾紙片貼在含菌平板上，1個(gè)平板等距離放置3片，3次重復(fù)。在24 ℃下培養(yǎng)48～96 h后測(cè)量抑菌圈直徑。以浸無(wú)菌水的濾紙片作為對(duì)照。

1.4.3 最小抑菌濃度的測(cè)定

最小抑菌濃度的測(cè)定同1.4.2。準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜精油配制成體積分?jǐn)?shù)為100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5%的濃度。置于24 ℃下培養(yǎng)觀察并測(cè)定抑菌圈直徑。

1.5 穩(wěn)定性研究[18-20]

將水提精油配制成體積分?jǐn)?shù)為20 μL/mL的溶液，每只試管中取5 mL。

溫度的測(cè)定：分別在-20、4、25、40、60、80、100 ℃水浴條件下保溫30 min，冷卻至室溫。

pH的測(cè)定：用0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)成pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的精油樣品，以未調(diào)pH值的精油作為自然對(duì)照管，避光放置30 min。

紫外線(xiàn)的測(cè)定：密閉，在30W×2紫外燈照射下放置，分別照射0、5、10、15、20、25、30 min。

氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3對(duì)香菜精油穩(wěn)定性的影響：分別配制成體積分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的H2O2，振蕩放置5 min。配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的Na2SO3，放置30 min。

將香菜精油配制成體積分?jǐn)?shù)為20 μL/mL的溶液，每只試管中加入5.0 mL，加入抗壞血酸、苯甲酸鈉、CMC、檸檬酸、蔗糖、果糖。最終樣品分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%、0.08%、0.12%抗壞血酸溶液；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.15%、0.2%、0.25%苯甲酸鈉溶液；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、1.5%、2% CMC溶液；質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL檸檬酸溶液，質(zhì)量濃度為2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL蔗糖和果糖溶液，質(zhì)量濃度為2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL NaCl溶液，以添加蒸餾水為對(duì)照。然后分別測(cè)定510 nm吸光值。重復(fù)3次。溶液吸光度較空白或自然對(duì)照樣有明顯變化說(shuō)明溶液中香菜精油發(fā)生了變化，不穩(wěn)定；吸光度保持不變或者略有降低，說(shuō)明穩(wěn)定性良好[21]。

1.6 清除ABTS自由基

參照DELGADO-ANDRADE等方法[22]。配制2.0 mmol/L ABTS溶液，吸取50 mL上述溶液與200 mL K2S2O8溶液(70 mmol/L)混合，暗處放置12～16 h，得到ABTS自由基溶液。用磷酸緩沖液(pH 7.4)將ABTS自由基溶液稀釋至在734 nm下吸光度為0.70±0.02。用95%乙醇將香菜精油稀釋為4個(gè)梯度濃度溶液(質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL)，取0.1 mL溶液，加入1.9 mL ABTS自由基溶液，在734 nm測(cè)其吸光度。按公式(1)計(jì)算清除率：

(1)

其中:A0,ABTS自由基溶液的吸光度;A,加香菜精油溶液后的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007計(jì)算平均值并作圖，采用SPSS 19.0進(jìn)行LSD和Duncan’s分析，做標(biāo)準(zhǔn)誤差分析，圖中以誤差棒的長(zhǎng)短表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菜精油原液對(duì)T. roseum菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

由圖1可知，香菜原汁、香菜水提物和香菜醇提物對(duì)于T.roseum菌絲生長(zhǎng)都有顯著抑制效果。且抑制效果為水提精油>醇提精油>香菜原汁，其抑制率分別為53.25%、47.83%、39.35%。因此，選擇水提精油進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同香菜提取液對(duì)T. roseum菌絲生長(zhǎng)的影響

Fig.1 Effects of different coriander extracts on mycelia growth of T. roseum注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 水提精油的最小抑菌濃度

由圖2可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，水提精油對(duì)T.roseum菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，其中體積分?jǐn)?shù)為3.125%精油的抑菌效果不顯著，1.5%無(wú)抑菌效果，最小抑菌濃度為6.25%。

圖2 水提香菜精油的最小抑菌濃度測(cè)定

Fig.2 The minimum inhibitory concentration (MIC) of coriander essential oil extracted with water注：圖中濃度(%)以藥品各自狀態(tài)在水中的占比表示，下同。

圖中小寫(xiě)字母表示差異顯著，下同。

2.3 穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度、紫外照射和pH值對(duì)香菜精油穩(wěn)定性的影響

由圖3-A可知，香菜精油在25～80 ℃之間，吸光度隨溫度的變化不大，相對(duì)穩(wěn)定。冷凍(-20 ℃)、冷藏(4 ℃)有微小的影響，超過(guò)80 ℃時(shí)，精油的吸光度顯著增加，可能是由于高溫使得黃酮成分分解，產(chǎn)生酚羥基，使得吸光度明顯增大?？傮w來(lái)說(shuō)香菜精油在80 ℃以下有良好的穩(wěn)定性，要盡量避免高溫、冷藏而應(yīng)該室溫保存。

香菜精油經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的紫外線(xiàn)照射后，吸光度在前15 min沒(méi)有發(fā)生較大的變化。15 min后，吸光度顯著增大(圖3-B)。說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射對(duì)香菜精油有一定的影響。

在pH值5.0～8.0可以保持穩(wěn)定，在其他pH值下，香菜精油的吸光度具有顯著性地變化(圖3-C)。由此可見(jiàn)，在儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)酸強(qiáng)堿，在pH值5.0～8.0范圍內(nèi)儲(chǔ)存。

圖3 溫度(A)、紫外照射(B)和pH值(C)對(duì)香菜精油穩(wěn)定性的影響

Fig.3 Effect of temperature (A)， UV radiation (B) and pH (C) on the stability of coriander essential oil

2.3.2 還原劑Na2SO3和氧化劑H2O2對(duì)香菜提取液穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，隨著氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3濃度的增大，香菜精油的吸光度略有減小，并且氧化劑比還原劑對(duì)溶液影響明顯。還原劑濃度達(dá)到食品最大安全使用量才與體積分?jǐn)?shù)0.5%的氧化劑作用相當(dāng)，表明還原劑Na2SO3對(duì)香菜精油穩(wěn)定性影響比氧化劑小。香菜精油具有一定的抗還原性，但仍然需要避免接觸此類(lèi)氧化還原物質(zhì)。

2.3.3 抗壞血酸、檸檬酸、蔗糖、果糖、NaCl、苯甲酸鈉、CMC對(duì)香菜精油穩(wěn)定性的影響

由圖5-A可知，隨抗壞血酸濃度增大，香菜精油水溶液吸光度值顯著增大，表明抗壞血酸對(duì)香菜精油有明顯的促進(jìn)作用?？箟难崾且环N常用的食品抗氧化劑，因其具有很強(qiáng)的還原性，一定程度上可以減慢香菜精油自動(dòng)氧化反應(yīng)速度。檸檬酸對(duì)香菜精油穩(wěn)定性有較大的影響，使得吸光度降低了50%以上(圖5-B)。添加NaCl的香菜精油吸光度隨著濃度增大而增大，這與大多數(shù)其他植物黃酮類(lèi)精油有著相反的結(jié)果(圖5-C)。蔗糖和果糖對(duì)香菜精油有增效作用，在0.25%～0.75%之間，效果有所起伏，但是達(dá)到1%，2種糖的效果一致(圖5-D)。加入苯甲酸鈉和CMC有較小幅度的下降，下降程度不顯著，只降低了10.1%，證明香菜精油對(duì)苯甲酸鈉和羧甲基纖維素鈉液穩(wěn)定(圖5-E，F(xiàn))。

圖4 H2O2(A)和Na2SO3(B)對(duì)香菜精油穩(wěn)定性的影響

Fig.4 Effect of H2O2(A) and Na2SO3(B) on the stability of coriander essential oil

圖5 抗壞血酸(A)、檸檬酸(B)、NaCl(C)、蔗糖和果糖(D)、苯甲酸鈉(E)、羧甲基纖維素鈉(F)對(duì)香菜精油穩(wěn)定性的影響

Fig.5 Effect of ascorbic acid (A)， citric acid (B)， NaCl (C), sucrose and fructose (D), sodium benzoate (E)and CMC (F) on the stability of coriander essential oil

2.4 香菜精油對(duì)ABTS自由基的清除作用

由圖6可知，香菜精油對(duì)ABTS自由基有一定的清除作用，水提物的清除能力最好，且清除率大小為水提物>醇提物>香菜原汁。隨著水提精油濃度的增大，清除率依次增加。

圖6 不同提取液的香菜精油(A)和不同濃度的水提香菜精油(B)對(duì)ABTS自由基的清除作用

Fig.6 Scavenging effects of different types of coriander essential oil (A) and different concentrations of coriander essential oil extracted with water (B) on ABTS free radicals

3 結(jié)論與討論

香菜精油中含有大量的黃酮類(lèi)化合物，天然黃酮類(lèi)化合物以C6-C3-C6為基本碳架，常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基，使該類(lèi)化合物多顯黃色。本實(shí)驗(yàn)提取的香菜水提物為深黃色，而醇提物為綠色。

不同植物的精油，其各種組分的含量以及成分各不相同，不同的外界條件對(duì)精油的影響也各有差別。ZEKOVI等[23]通過(guò)亞臨界提取法在100和150℃下獲得以芳樟醇為主要化合物的香菜精油。PIRBALOUTI等[24]研究了日光、陰涼、機(jī)械烘箱、微波爐及冷凍干燥方法對(duì)芫荽精油的影響，結(jié)果表明冷凍干燥提取的精油含量最高，其次是陰涼干燥的樣品。此外，精油提取后的環(huán)境pH值、溫度、食品添加劑等也會(huì)影響其功能。黑豆花青素(pH值2.5，4 ℃)和紫玉米花青素(pH 2～6，22 ℃貯藏12周)在酸性和中低溫條件下穩(wěn)定[25-26]，用超聲波提取法提取的竹葉黃酮有很好的熱穩(wěn)定性，光照、H2O2和Na2SO3對(duì)竹葉黃酮的穩(wěn)定性影響較大[27]。本研究表明香菜精油在80 ℃以下都表現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性，而冷藏或者高溫會(huì)導(dǎo)致香菜精油不穩(wěn)定，在pH值5.0～8.0時(shí)表現(xiàn)穩(wěn)定。

植物精油對(duì)微生物有一定的抑制作用，也具有一定的抗氧化性。ZARE-SHEHNEH等[28]研究表明，香菜葉精油對(duì)青霉和黑曲霉具有殺菌活性，殺菌質(zhì)量濃度分別為67.8和62.1 mg/mL，陳志紅等[29]研究表明香菜乙醇提取液對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基均有清除作用。而精油的抑菌和抗氧化性質(zhì)也會(huì)受到其他因素的影響，如溫度、紫外[17]、Ca2+，F(xiàn)e3+等金屬離子。紫皮紫心薯肉中多酚、黃酮和ORAC值與未經(jīng)加熱的生薯肉相比，100 ℃下加熱30 min能使其提取精油中黃酮和ORAC值分別提高2.6倍及5.7倍，表明熱加工有利于提高番薯中多酚類(lèi)物質(zhì)的釋放，提高其抗氧化活性[30]。

食品添加劑檸檬酸對(duì)許多植物黃酮表現(xiàn)為破壞作用，香菜精油也有同樣的研究結(jié)果，在食品加工過(guò)程中應(yīng)避免這些物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還研究苯甲酸鈉和羧甲基纖維素鈉(CMC)對(duì)香菜精油的影響較小。NaCl、抗壞血酸對(duì)其穩(wěn)定性具有促進(jìn)作用，在氧化劑實(shí)驗(yàn)中，精油的吸光度只是有輕微減小，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，香菜精油可作為一種效果良好的天然抗氧化劑。在還原劑實(shí)驗(yàn)中，香菜黃酮對(duì)還原性較強(qiáng)的Na2SO3抗性較弱，因此，香菜精油在生產(chǎn)、貯存及研究使用過(guò)程中應(yīng)注意避免與亞硫酸鹽或二氧化硫等還原劑接觸。

總之，香菜精油無(wú)論是熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性，還是對(duì)食品添加劑的穩(wěn)定性范圍都比較寬，是一種較穩(wěn)定的食品和保健品添加劑。未來(lái)要研究新的方法來(lái)分析香菜精油中的有效成分，在保持其有效成分的前提下開(kāi)發(fā)果蔬保鮮劑。