蔡可，王太康，王君，董自星，田康明，金鵬，劉曉光，王正祥,

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)

低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)是由0～6個(gè)半乳糖連接到乳糖分子的半乳糖基一側(cè)形成的一種雜低聚糖，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n為0～6)。在自然界中，GOS主要存在于動(dòng)物乳汁中，人類母乳中的GOS含量較多[1]。因其具有熱值低,促進(jìn)雙歧桿菌增殖,低齲齒性,防止便秘,改善脂質(zhì)代謝以及提高免疫力等生理功能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。GOS的制備方法主要有：從天然原料中提取、化學(xué)合成法、直接發(fā)酵法和酶法合成等[2]。其中，酶法合成具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單和效率高等優(yōu)點(diǎn)，是目前工業(yè)生產(chǎn)上最常用的方法[3]。它主要是以乳清或乳糖為底物，利用β-半乳糖苷酶催化合成GOS。然而，由于β-半乳糖苷酶同時(shí)具有水解活性和轉(zhuǎn)苷活性，反應(yīng)后期隨著底物濃度的降低，酶的水解活性更加突出，從而將合成的GOS二次水解，導(dǎo)致GOS的收率較低，這是GOS酶法制備中面臨的主要問題[4]。

內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase，EC 3.2.1.89)屬于糖苷水解酶第53(GH53)家族，可以特異性地水解β-1,4-半乳聚糖和鼠李半乳糖醛酸聚糖I(簡稱RGI，來源于非木本植物細(xì)胞壁中的果膠)中的β-1,4糖苷鍵產(chǎn)生低聚半乳糖[5-6]。此外，它在木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化[6]、果汁和葡萄酒加工、動(dòng)物飼料的改良、洗滌劑、紡織和造紙等行業(yè)也有廣泛的應(yīng)用[7-8]。目前，國外學(xué)者對(duì)內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶做了大量研究，包括分離純化、異源表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)研究、三維結(jié)構(gòu)解析和分子改造等，國內(nèi)目前尚未見相關(guān)研究。已報(bào)道的內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶主要來源于細(xì)菌和絲狀真菌，其中大部分屬于青霉和曲霉屬[9]。

該研究擬采用分子克隆技術(shù)，將黑曲霉CICIM F0510中的內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行克隆表達(dá)，進(jìn)行初步純化后，系統(tǒng)解析其生化特征，并初步探討其水解土豆?jié){制備低聚半乳糖的可行性，為該酶在低聚半乳糖制備行業(yè)中的應(yīng)用提供材料和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

黑曲霉CICIM F0510[10]和大腸桿菌JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。畢赤酵母GS115及表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K購自Invitrogen公司。重組畢赤酵母GS115 (pPIC-aghA)研究中構(gòu)建、篩選和保藏。黑曲霉和大腸桿菌分別采用PDA和LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；畢赤酵母所用培養(yǎng)基MD、YPD、BMGY和BMMY等按照Invitrogen公司的Pichia Expression Kit進(jìn)行配制。

1.1.2 主要試劑

PyrobestTMDNA聚合酶和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，美國Thermo公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit)和cDNA合成試劑盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit)，Roche公司產(chǎn)品；無氨基酵母氮源、胰蛋白胨和酵母抽提物，英國OXOID公司提供；半乳聚糖(galactan(potato)),愛爾蘭Megazyme公司；色譜純乙腈和薄層層析硅膠板分別由生工生物工程(上海)股份有限公司和煙臺(tái)德信生物科技有限公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組畢赤酵母的構(gòu)建

1.2.2 內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶的異源表達(dá)及分離純化

將重組畢赤酵母GS115(pPIC-aghA)的單菌落接種到25 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值為2.0～6.0(約16～18 h)。然后按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接入25 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。再離心(4 ℃，5 000 r/min)5 min回收酵母細(xì)胞，并將其重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基中，使其OD600值為1.0，于30 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24 h補(bǔ)加無水甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，以維持誘導(dǎo)，并同時(shí)取樣進(jìn)行酶活測定，直至酶活不再增加。發(fā)酵結(jié)束后，12 000 r/min離心10 min收集發(fā)酵液，即為粗酶液。

將粗酶液用飽和度分別為30%和90%的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀，再通過PD-10脫鹽柱去除鹽離子。最后，采用凝膠柱Superdex 75 10/300 GL對(duì)其進(jìn)行純化，并通過酶活測定和SDS-PAGE分析重組酶的純化情況。其中，SDS-PAGE按照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和12%。

1.2.3 重組β-1,4-半乳聚糖酶的酶學(xué)特征解析

1.2.3.1 重組β-1,4-半乳聚糖酶的酶活測定

按照文獻(xiàn)方法[6]，在反應(yīng)體系中加入用100 mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)配制的5 mg/mL半乳聚糖溶液和0.1 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液(對(duì)照組為沸水滅活的酶液)。振蕩混勻后，于45 ℃下反應(yīng)10 min。然后加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，100 ℃下煮沸10 min。最后，測定反應(yīng)液在540 nm下的吸光值，并根據(jù)半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。在上述條件下，1 min內(nèi)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于1 mgD-半乳糖的還原力所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

采用BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白V部分為標(biāo)準(zhǔn)參照。

1.2.3.2 重組酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測定

將純化后的酶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70和80 ℃下進(jìn)行反應(yīng)。再按照1.2.3.1的方法進(jìn)行酶活測定，以酶活最高者為100%，計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力，以確定重組酶的最適反應(yīng)溫度。將純化后的酶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，分別在30、40、50、60、70和80 ℃下保溫2 h，每隔30 min取樣，在冰上放置10 min后測定酶活力，以未進(jìn)行熱處理酶液的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定重組β-1,4-半乳聚糖酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.3.3 酶的最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性測定

在不同pH值(pH 3.0～8.0)，以溶于相應(yīng)pH值的緩沖液的0.5 mg/mL半乳聚糖為底物進(jìn)行反應(yīng)，然后按照1.2.3.1的方法測定酶活。以酶活最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，從而確定重組半乳聚糖酶的最適作用pH值。將純化后的酶液分別用不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)的緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，再于相應(yīng)pH值的緩沖液中孵育(溫度為40 ℃)1 h后測定酶活。以酶活最高者為100%，計(jì)算殘余酶活力，確定酶的pH穩(wěn)定性。所用緩沖液為0.1 mol/L醋酸和0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液。

1.2.3.4 金屬離子或化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

在重組酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中加入金屬離子Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Hg2+和Fe3+，使其終濃度為1 mmol/L，在最適作用溫度和pH值下測定重組酶的酶活，以未加金屬離子的反應(yīng)體系的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.3.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定

分別以0.02、0.025、0.03、0.035、0.04和0.05 mg/mL的半乳聚糖為底物，在重組半乳聚糖酶的最適反應(yīng)溫度和pH值條件下進(jìn)行反應(yīng)，按照1.2.3.1的方法測定酶活。然后以1/V對(duì)1/S作圖，根據(jù)雙倒數(shù)法計(jì)算米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax。

1.2.4 重組酶水解土豆的產(chǎn)物分析

利用打漿機(jī)將土豆打碎，成為糊狀。再利用G3砂芯漏斗對(duì)處理后的土豆?jié){進(jìn)行反復(fù)清洗，并采用DNS法檢測濾出液中的殘?zhí)?，直至濾出液中無殘?zhí)谴嬖冢逑赐戤叀Ｔ? mL酶促反應(yīng)體系中加入300 g/L上述預(yù)處理的土豆?jié){和10 U/mL酶液。在45 ℃、pH值4.5下反應(yīng)2 h后，沸水浴10 min滅酶。再于13 000 r/min離心10 min，取上清。適當(dāng)稀釋后，用0.22 μm濾膜過濾，再利用高效液相色譜檢測過濾液中的產(chǎn)物組成。

在1 mL酶促反應(yīng)體系中，加入300 g/L預(yù)處理的土豆?jié){和10 U/mL酶液，于pH值4.5和45 ℃進(jìn)行反應(yīng)。分別在反應(yīng)15、30、60、120和180 min時(shí)取樣，于100 ℃煮沸10 min滅酶。離心取上清后，采用高效液相色譜法分析每種組分含量隨著時(shí)間的變化情況。

色譜條件：色譜柱為GRACE Prevail Carbohydrate ES 5u (250 mm×4.6 mm；5 μm)；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=60∶40；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL，柱溫：30 ℃。檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器；檢測條件：漂移管溫度90 ℃，空氣載氣流速2.2 L/min，增益為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-1,4-半乳聚糖酶基因的克隆表達(dá)與分離純化

2.1.1 內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶基因的異源表達(dá)

以黑曲霉CICIM F0510的cDNA為模板，利用引物AghA1和AghA2對(duì)其內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶基因aghA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaⅠ酶切后，與經(jīng)過SnaB Ⅰ和AvrⅡ酶切的質(zhì)粒pPIC9K連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-aghA。DNA測序的結(jié)果表明，所克隆的aghA基因具有完整的開放閱讀框，且其序列與A.nigerCBS 513.88基因組公布的序列完全一致。其大小為1 065 bp，編碼354個(gè)氨基酸殘基。進(jìn)一步將重組質(zhì)粒用SacI線性化后，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，獲得重組菌GS115 (pPIC-aghA)。在250 mL三角瓶培養(yǎng)條件下，發(fā)酵進(jìn)行到120 h時(shí)，重組菌的內(nèi)切半乳聚糖酶活性達(dá)到最大，為130 U/mL。

2.1.2 重組β-1,4-半乳聚糖酶的分離純化

進(jìn)一步采用鹽析、脫鹽和凝膠過濾層析法將重組β-1,4-半乳聚糖酶進(jìn)行純化，各步驟的純化倍數(shù)和回收率如表1所示。

表1 重組半乳聚糖酶AghA的分離純化

純化后，AghA的比酶活為14 881.09 U/mg，是純化前的49.4倍，回收率約為16.79%。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，重組酶AghA的分子質(zhì)量約為42.0 ku(圖1)，略高于其理論分子質(zhì)量(37.0 ku)，可能是該酶已經(jīng)被糖基化修飾了。通過在線軟件ISOGlyP(http://isoglyp.utep.edu/)預(yù)測可知，AghA含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)。此外，重組酶的純度基本滿足生化特征分析的要求。

2.2 重組β-1,4-半乳聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的解析

1-粗酶液；2-鹽析和脫鹽后的AghA；3-凝膠過濾層析后的AghA；M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)

圖1 SDS-PAGE分析重組酶AghA的純化情況

Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purification of recombinant enzyme AghA

2.2.1 最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性

分別在不同pH(3.0～8.0)條件下測定重組酶AghA的酶活，結(jié)果如圖2-a所示。重組酶AghA的最適作用pH值為4.5，它在較寬泛的pH值范圍內(nèi)(3.0～5.5)的相對(duì)酶活保持在80%以上。AghA還具有良好的pH值穩(wěn)定性，在pH 4.0～6.0的緩沖液和40 ℃孵育1 h后，殘余酶活力仍能保持80%以上(圖2-b)。

a-最適反應(yīng)pH;b-pH穩(wěn)定性

圖2 重組半乳聚糖酶AghA的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

Fig.2 The pH optimum and pH stability of recombinant galactanase AghA

2.2.2 最適作用溫度和熱穩(wěn)定性

分別將重組酶AghA在不同溫度(30～80 ℃)和pH 4.5條件下進(jìn)行反應(yīng)，然后按照1.2.3.1的方法測定酶活，結(jié)果如圖3-a所示。

a-最適作用溫度;b-熱穩(wěn)定性

圖3 重組半乳聚糖酶AghA的最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

Fig.3 The temperature optimum and thermostability of recombinant galactanase AghA

由圖3可知，重組酶AghA的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，在35～50 ℃范圍內(nèi)，其相對(duì)酶活在80%以上；而當(dāng)反應(yīng)溫度超過60 ℃以后，酶活力顯著下降。熱穩(wěn)定性的研究表明，重組酶AghA在30～50 ℃的穩(wěn)定性較好，孵育2 h后，其殘留酶活仍在60%左右(圖3-b)；在60 ℃和70 ℃保溫1 h后，該酶的殘余酶活力分別為40%和20%左右；而在這2個(gè)溫度下孵育2 h后，重組酶AghA只能保持20%和10%左右的相對(duì)酶活。

2.2.3 金屬離子或化學(xué)試劑對(duì)AghA酶活的影響

分別在AghA與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中添加不同的金屬離子或化學(xué)試劑，使其終濃度為1 mmol/L，以研究它們對(duì)AghA酶活的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，大部分金屬離子對(duì)內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的酶活沒有顯著影響，這使其更適用于工業(yè)應(yīng)用過程中[13]。此外，EDTA也對(duì)該半乳聚糖酶的酶活沒有顯著影響，這與其他報(bào)道一致[6, 14]。Zn2+和Co2+對(duì)該酶的活性有輕微的抑制作用；Fe3+對(duì)AghA有強(qiáng)烈的抑制作用；而Hg2+可使AghA幾乎完全失去活性。

表2 金屬離子或化學(xué)試劑對(duì)AghA酶活的影響

2.2.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定

以不同質(zhì)量濃度(0.02～0.05 mg/mL)的半乳聚糖為底物，在重組酶AghA的最適作用pH值和溫度下反應(yīng)，然后按照1.2.3.1的方法測定酶活。采用雙倒數(shù)作圖法，繪制重組酶AghA水解半乳聚糖的動(dòng)力學(xué)曲線，求得該酶對(duì)半乳聚糖的最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km分別為400 mg/(mL·min)和0.08 mg/mL。該Km值遠(yuǎn)小于Bacilluslicheniformis[6]、Emericellanidulans[13]以及Penicilliumcitrinum[15]來源內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶的Km值(分別為2.3 mg/mL、0.51 mg/mL和0.055%)?？梢?，重組酶AghA對(duì)半乳聚糖具有較強(qiáng)的親和性。

2.3 重組酶對(duì)土豆中半乳聚糖的水解作用

2.3.1 土豆?jié){酶解產(chǎn)物的HPLC分析

以300 g/L預(yù)處理后的土豆?jié){為底物，在45 ℃、pH值4.5下準(zhǔn)確反應(yīng)2 h后取樣，采用HPLC對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。重組半乳聚糖酶AghA將土豆水解后，其產(chǎn)物主要是半乳糖、半乳二糖和半乳三糖，還有極少量的半乳四糖。

G1-半乳糖；G2-半乳二糖；G3-半乳三糖

圖4 半乳聚糖酶AghA作用于土豆?jié){的產(chǎn)物分析

Fig.4 HPLC profiles of potato pulp hydrolyzed by recombinant galactanase AghA

2.3.2 重組酶AghA水解土豆?jié){的反應(yīng)進(jìn)程

將重組酶AghA與300 g/L預(yù)處理的土豆?jié){在pH值4.5和45 ℃下進(jìn)行反應(yīng)。并于不同的時(shí)間取樣，采用HPLC測定每種組分含量隨著時(shí)間的變化情況。以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，每種組分的含量為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖5所示。反應(yīng)初始階段，內(nèi)切-β-1,4-半乳聚糖酶AghA水解土豆?jié){生成半乳三糖、半乳二糖和半乳糖；反應(yīng)15 min后，半乳三糖的含量不斷減少，而半乳二糖和半乳糖的含量則不斷地增加。而反應(yīng)進(jìn)行到180 min時(shí)，半乳三糖的相對(duì)含量僅為0.38 mg/mL，反應(yīng)的最終產(chǎn)物主要是半乳糖和半乳二糖，二者的質(zhì)量濃度分別為5.94和4.03 mg/mL。

圖5 重組酶AghA水解土豆?jié){的反應(yīng)進(jìn)程

Fig.5 Hydrolysis of potato pulp by recombinant enzyme AghA

3 討論

該研究采用分子克隆與遺傳重組技術(shù)成功將黑曲霉CICIM F0510來源的內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)。搖瓶培養(yǎng)條件下，重組酶AghA的總酶活和比酶活分別為130 U/mL和301.23 U/mg(表1)，高于大多數(shù)已報(bào)道的內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶的酶活，比如B.licheniformis[6]、E.nidulans[13]、P.chrysogenum[16]、P.citrinum[15]和Thermotogamaritima[17]來源內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶的酶活分別為127 U/mg、109 U/mL、0.127 U/mL、48.96 U/mg和21.8 U/mg，具有潛在的工業(yè)化前景。

酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，重組內(nèi)切半乳聚糖酶AghA的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為45 ℃和4.5，且在30～50 ℃或pH值4.0～6.0具有較好的穩(wěn)定性(圖2和圖3)，這與低聚半乳糖的制備條件(30～50 ℃；pH 5.6～7.0)[2]比較吻合，適用于GOS的制備過程。此外，它與B.licheniformis[6]、E.nidulans[13]、P.chrysogenum[16]、A.aculeatus[18]以及Talaromycesstipitatus[19]等來源內(nèi)切半乳聚糖酶的最適反應(yīng)溫度和pH值相似。但其最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性卻低于嗜熱微生物來源的內(nèi)切β-1,4-半乳聚糖酶[17, 20]。后續(xù)可以進(jìn)一步通過分子改造來提高其熱穩(wěn)定性，以適應(yīng)不同的工業(yè)需求[19]。

土豆?jié){是土豆淀粉生產(chǎn)行業(yè)的副產(chǎn)物，具有價(jià)格低、產(chǎn)量大等特點(diǎn)。它主要是由土豆的細(xì)胞壁組成，含有大量的果膠，特別是鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)和同型半乳糖醛酸聚糖(HG)[21]。其中，RGI的側(cè)鏈主要含有以β-1,4糖苷鍵連接的半乳聚糖。該研究利用重組酶AghA水解土豆?jié){，可以釋放半乳二糖、半乳三糖和半乳四糖等低分子量的半乳聚糖(圖4)；且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，半乳三糖被不斷水解成半乳二糖和半乳糖(圖5)，這與其他真菌內(nèi)切β-1,4半乳聚糖酶的作用特征相似。而細(xì)菌來源的半乳聚糖酶則優(yōu)先作用于高分子量半乳聚糖，且水解產(chǎn)生的低聚半乳糖的聚合度≥4[22-23]，這是由于它們的底物結(jié)合凹槽的結(jié)構(gòu)不同造成的[5, 24]。此外，由于內(nèi)切β-1,4半乳聚糖酶只具有水解作用，通過條件控制應(yīng)該不會(huì)產(chǎn)生GOS的二次水解，有望解決產(chǎn)品回收率低的問題。

綜上所述，該研究成功將黑曲霉CICIM F0510來源的內(nèi)切β-1,4半乳聚糖酶在畢赤酵母中進(jìn)行了克隆表達(dá)和酶學(xué)特征解析。重組半乳聚糖酶AghA較高的表達(dá)量、良好的酶學(xué)性質(zhì)以及對(duì)土豆?jié){的水解作用，為其工業(yè)化生產(chǎn)以及在低聚半乳糖制備中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。