江琦，婁在祥*，王正齊，王洪新*，陳孝云

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(國家功能食品工程技術研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.ex Fr) Link]，分類學上屬麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)，又稱北冬蟲夏草，是由子座(草部分)和菌核(蟲的尸體部分)兩部分組成的復合體，是可與冬蟲夏草媲美的我國傳統(tǒng)可食用的藥用真菌[1-2]。蟲草多糖作為蛹蟲草中所含活性物質(zhì)中最豐富、最重要的物質(zhì)，具有內(nèi)在的藥效功能，特別是抗氧化，免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤功能[3-6]。近年，國內(nèi)外的研究較多集中在蟲草多糖提取純化工藝的優(yōu)化和多糖藥理活性的研究方面，對多糖構型分析、多糖組成等方面的報道還比較少見。據(jù)現(xiàn)代科學論證，蟲草等真菌多糖的物理性質(zhì)和藥理作用與多糖的分子質(zhì)量大小、分子量分布、糖苷鍵、支化程度以及構象有著密切的聯(lián)系[7-8]。

采用多角度激光光散射凝膠滲透色譜和示差聯(lián)用技術(gel permeation chromatographymulti-angle laser light scattering-reflective index, GPC-MALLS-RI)可以直接測定聚合物重均分子量，是分析聚合物結(jié)構的有效工具。該技術與傳統(tǒng)GPC相比，無需標準樣品校正，且能夠獨立測定多糖的折光指數(shù)增量(dn/dc)值，保證檢測結(jié)果的可靠性。因此本文著重探究蟲草多糖的結(jié)構，通過GPC-MALLS-RI和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)對柱層析純化的蛹蟲草蟲草多糖(Cordycepsmilitarispolysaccharide，CMP)進行表征，獲取單糖組成、分子量分布和構象信息。通過傅里葉變換紅外光譜探討多糖的分子組成。此外，比較了粗多糖與純化多糖CMP的抗氧化活性。從分子構型、分子量的角度以及抗氧化活性方面評價蛹蟲草多糖，旨在為活性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用蛹蟲草為東北長白山野生蛹蟲草菌種，通過固態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵而來的子實體：含水量4.1%，由遵義鴻霖生物技術有限公司提供；二乙氨基乙基纖維素52(DEAE-52)填料，上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；無水葡萄糖、單糖標準品、DPPH和ABTS，上海Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為分析純或者色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗儀器與設備

FW80高速粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；UV-2100紫外分光光度計，尤尼柯儀器有限公司(上海)；BC-R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海貝凱生物化工設備有限公司；SBS-100自動部分收集器，上海滬西分析儀器有限公司；BT100-1JDG1數(shù)顯恒流泵，重慶科耐普蠕動泵有限公司；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(TSQ8000)，賽默飛世爾科技有限公司；多角度激光光散射凝膠色譜儀(DAWN HELEOS II)，美國懷雅特技術公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛹蟲草蟲草粗多糖的制備

取適量蛹蟲草子實體粉末，在微波條件下輔助提取蟲草多糖，提取液離心后取上清濃縮，加入多糖濃縮液體積1/4的Sevag試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]離心除去蛋白，如此重復多次。用1.5 g/L的活性炭脫色，再加入4倍體積的無水乙醇沉淀多糖，4 ℃下靜置過夜后用分別用95%乙醇、無水乙醇和丙酮洗滌沉淀，最后真空干燥得到粗多糖，備用。用苯酚-硫酸法[9]測定蟲草粗多糖的含量。

1.3.2 蛹蟲草粗多糖的純化

樣品的預處理：準確稱取蟲草多糖粗品，用蒸餾水配制成25 g/L的溶液，待柱層析備用。

DEAE-52柱層析純化蟲草多糖：稱取100 g填料用蒸餾水浸泡出去懸浮雜質(zhì)，而后分別用0.5 mol/L的HCl和NaOH浸泡2 h，每次用蒸餾水洗至中性，最后真空抽干填料用蒸餾水浸泡裝柱(2.6 cm×30 cm)，預先用蒸餾水過夜平衡。用蒸餾水洗脫，流速為4 mL/min，每管收集8 mL。采用苯酚硫酸法檢測每管糖含量，并繪制以管數(shù)為橫坐標，吸光值為縱坐標的洗脫曲線，以洗脫曲線為準收集不同吸收峰段的多糖組分。將收集的多糖組分50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原液的1/5后透析(3000D)48 h，而后冷凍干燥得到中性蟲草多糖粉末(CMP)。采用1.3.1中苯酚硫酸法測定CMP質(zhì)量分數(shù)，并用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。

1.3.3 光譜分析

1.3.3.1 紫外光譜

準確稱取10 mg蟲草多糖，用蒸餾水配制成0.5 g/L樣品溶液，用蒸餾水做空白對照，使用Shimadzu UV-1800光譜記錄CMP的紫外光譜。掃描范圍為190～400 nm，間隔1 nm。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜

按m(CMP)∶m(KBr)約為1∶50，研磨，然后壓制成1 mm薄片。采用Nicole IS10 FT-IR光譜儀(Thermo Electron，DTGS檢測器，美國)以4 000 cm-1分辨率記錄數(shù)據(jù)，掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為16次。

1.3.4 氣相色譜與質(zhì)譜(GC-MS)分析CMP單糖組成

單糖標準品的預處理：分別準確稱取100 mg的阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖溶于100 mL 50%的苯甲酸溶液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

CMP的水解與還原：準確稱取10 mg多糖樣品于安瓿瓶中，加入0.5 mL H2SO4(12 mol/L)溶液后封管，35 ℃水浴1 h后加入2.5 mL超純水，100 ℃水浴1 h后冷卻至室溫得到水解樣品。取單糖標準品和水解樣品各1 mL置于新管，加入2 g/L肌醇為內(nèi)標，氨水調(diào)節(jié)溶液至堿性后再加入含200 g/L硼氫化鈉的氨水溶液0.2 mL，封管后水浴30 min (40 ℃)，加入0.3 mL乙酸漩渦振蕩。

單糖的衍生化：取還原后單糖樣品0.2 mL，加入乙酸酐和1-甲基咪唑混勻，室溫靜置10 min后加入超純水終止反應。待樣品冷卻至室溫后加入二氯甲烷萃取衍生化后的單糖，保留下層有機相并加入無水硫酸鈉除去殘留的水分。離心后取上清液進行GC-MS分析。

色譜分析條件：使用配備氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀、毛細管柱(30 m×0.25 mm，Thermo ScientificTMTrace GOLD TG-5MS)。檢測器溫度：260 ℃，進樣口溫度：280 ℃，高純氦氣為載氣，氣體流速：1 mL/min，分流比40∶1，進樣量1.0 μL。升溫程序如下：50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至150 ℃，再以1 ℃/min升至200 ℃，再以20 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV，傳輸線溫度275 ℃，離子源溫度200 ℃，母離子m/z285，激活電壓1.5 V，質(zhì)量掃描范圍m/z33～550。

1.3.5 多角度激光光散射凝膠色譜聯(lián)用示差(GPC-MALLS-RI)分析蟲草多糖分子構象

1.3.5.1 分析條件

MALLS光源：He-Ne激光源，波長633 nm，凝膠排阻色譜裝置配備示差折光檢測器(RI-2410，Waters，USA)和使用的P100型泵(1525 Binary HPLC Pump)。凝膠柱：UltrahydrogelTM2000 (7.8 mm×300 mm)。流動相為0.3 mol/L NaNO3溶液(用0.2 μm濾膜過濾除塵，并超聲脫氣)，流速0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：500 μL。多糖的折光指數(shù)增量(dn/dc)設定為0.147 cm3/g。光散射儀器的校準采用超純度甲苯。

1.3.5.2 樣品的處理

樣品配制質(zhì)量濃度：2 mg/mL(流動相預溶)并振蕩使其充分溶解后，過0.22 μm濾膜后進行GPC-MALLS-RI分析。

1.4 抗氧化活性的研究

1.4.1 DPPH自由基清除活性的測定

按照BLOIS[10]所述的方法測定CMP的DPPH自由基清除活性。簡單來說，將1.3.1中粗多糖和CMP溶于去離子水中配制成不同質(zhì)量濃度梯度(0.1～2.0 mg/mL)的樣品溶液。取1 mL DPPH無水乙醇溶液(0.125 mol/L)與1 mL樣品在室溫下避光劇烈振蕩30 min。用抗壞血酸(VC)作陽性對照，在517 nm處測定每個樣品的吸光度，按公式(1)計算粗多糖、CMP和VC的DPPH自由基清除率：

(1)

其中：A0，空白對照(無水乙醇代替樣品或者VC)的吸光值；A1，乙醇代替DPPH溶液的樣品或者VC的吸光值；A2，DPPH溶液與樣品或者陽性對照VC的吸光值。每個實驗重復3次。

1.4.2 ABTS自由基(ABTS+)清除活性的測定

按照WANG等[11]報道的方法，測定ABTS自由基的清除活性。將等體積的ABTS溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀(2.45 mmol/L)混合，在暗處儲存靜置16 h后，用無水乙醇稀釋30倍。取0.25 mL樣品溶液(0.1～2 mg/mL)加入到5 mL ABTS自由基體系中，在室溫避光反應30 min后，在734 nm處測定吸光值。無水乙醇為空白對照，VC為陽性對照。按公式(2)計算粗多糖、CMP和VC的的ABTS自由基清除率：

(2)

其中：A0，空白對照(無水乙醇代替樣品或者VC)的吸光值；A1，乙醇代替ABTS溶液的樣品或者VC的吸光值；A2，ABTS溶液與樣品或者陽性對照VC的吸光值。每個實驗重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)除特殊說明外均采用平均值±標準差(mean±SD)的形式表示，采用Astra軟件分析GPC-MALLS-RI數(shù)據(jù)，借助Xcalibur 1.2軟件分析GC-MS數(shù)據(jù)，其余作圖均采用Origin Pro軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草多糖的分離純化與定性分析

利用二乙氨基乙基纖維素52(DEAE-52)的吸附效應，對蟲草多糖進行分離純化，洗脫曲線如圖1所示?？梢钥闯觯聪x草多糖能夠得到2個峰(管28～41和管65～98)，本次實驗收集第2個峰頂部溶液，濃縮透析后進行冷凍干燥，并命名為蛹蟲草蟲草多糖CMP。

圖1 DEAE-52純化蟲草多糖洗脫曲線

Fig.1 The DEAE-cellulose 52 column chromatography elution curve of Cordyceps militaris polysaccharide

按照1.3.1的方法得到葡萄糖的標準曲線，進行線性回歸后回歸方程為y=6.143 2-0.007 4(R2=0.999 3)；CMP質(zhì)量分數(shù)為(76.63±0.12)%。運用BCA試劑盒測定CMP蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為(2.98±0.06)%。相比蟲草粗多糖含量(44.95±0.07)%，DEAE-52柱層析法顯著地提高了多糖的質(zhì)量分數(shù)。

2.2 蟲草中性多糖(CMP)紫外和中紅外圖譜

圖2 蟲草中性多糖(CMP)紫外可見光譜圖

Fig.2 The UV-visible spectra of CMP

圖3 蟲草中性多糖(CMP)傅里葉變換紅外光譜圖

Fig.3 The FT-IR spectra of CMP

2.3 蟲草中性多糖(CMP)單糖組成

采用Xcalibur 1.2軟件對GC-MS單糖組成數(shù)據(jù)進行分析。通過與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST1.6和Wiley 6.0)比對和與文獻中相應化合物的Kovats指數(shù)(KI)比對進行化合物的定性。定量方法采用面積歸一法，以肌醇為內(nèi)標。各種標準單糖、CMP衍生物氣相色譜圖見圖4。根據(jù)它們的保留時間TR，確定組成單糖的種類，根據(jù)峰面積公式(3)計算出其摩爾比。

(3)

其中：i,標準單糖;s,內(nèi)標物;M,質(zhì)量;A,峰面積，求出各單糖相對校正因子fR。各單糖的摩爾比測定條件與校正因子相同，以肌醇為內(nèi)標，得到各個單糖衍生物的峰面積與內(nèi)標衍生物的峰面積比后乘以fR/M(M為相對分子質(zhì)量)，得到值之比即為各單糖摩爾比。

由圖4可知各標準單糖對應的保留時間分別為：鼠李糖(TR=31.30 min)、阿拉伯糖(31.88 min)、巖藻糖(32.21 min)、木糖(33.49 min)、甘露糖(48.74 min)、葡萄糖(49.50 min)、半乳糖(50.59 min)，TR=47.96 min的峰為肌醇。由圖4可知CMP中單糖組成為甘露糖、葡萄糖、半乳糖，摩爾比為1∶3.90∶1.51。

1-鼠李糖；2-阿拉伯糖；3-巖藻糖；4-木糖；5-內(nèi)標-肌醇；6-甘露糖；7-葡萄糖；8-半乳糖)和蟲草多糖(CMP)乙酸酐咪唑衍生后的氣相色譜圖

圖4 單糖標準品

Fig.4 The GC profile of monosaccharide standards

2.4 蟲草多糖(CMP)的分子量分布和構象分析

2.4.1 分子量分布

通過多角度激光散射儀自帶Astra軟件采集數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標，多角度和示差響應值為縱坐標作圖得到圖5。由圖5可知，MALLS圖譜在洗脫時間在15～22 min范圍內(nèi)呈現(xiàn)出尖而瘦的峰，可以推測多糖的分子量相對比較均一。然而，對比RI圖譜發(fā)現(xiàn)，多糖的保留時間有了稍許的延遲，出峰時間段在16～22 min和22～35 min。為了確定多糖峰段，圖6表示了示差檢測蟲草多糖(CMP)分子質(zhì)量與時間的色譜圖。由圖可知22 min后多糖的分子量質(zhì)量趨近0，同時對比多次重復實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RI檢測器均能夠采集22 min后的峰，從中可知22 min后出現(xiàn)的峰為溶劑峰。以上兩種檢測方式均能說明GPC-MALLS-RI能夠很好地檢測CMP的分子特性。

圖5 蟲草多糖(CMP)的90°激光峰色譜圖和示差圖

Fig.5 Chromatogram of CMP by LLS at 90°and differential refraction index

圖6 示差檢測蟲草多糖(CMP)分子質(zhì)量與時間的色譜圖

Fig.6 The chromatograms of the molecular mass vs. time detected by RI

早在1948年，ZIMM等人[14]提出光散射現(xiàn)象與分子量之間關系的理論，而后涌入了一大批科研工作者總結(jié)此理論，得到公式(4)和(5)[15]：

(4)

(5)

其中：K*為一個光學常數(shù)，與分子的折光指數(shù)增量和溶劑的折光指數(shù)相關；n，溶劑的折光指數(shù)；c，溶質(zhì)分子的質(zhì)量濃度(g/mL)；NA，阿佛加德羅常數(shù)；λ0，入射光的波長；dn/dc，溶液折射率與濃度變化的比值，它說明了隨溶質(zhì)濃度變化的溶液折光指數(shù)變化；R(θ)，不同角度光散射強度；Mw，重均分子量；A2為第二維里系數(shù)。而z平方根即為均方根半徑(radii of gyration,Rg)，也稱回轉(zhuǎn)半徑，此數(shù)據(jù)可以用來表征支化聚合物的尺寸。

將K*c/Rθ對sin2(θ/2)作圖，可得到著名的Zimm曲線(圖7)，擬合曲線線性關系式推算結(jié)果見表1，由擬合曲線截距的倒數(shù)得到CMP的重均分子摩爾質(zhì)量Mw為2.432×107g/mol，Mn為1.015×106，計算多糖分布指數(shù)d=Mw/Mn為2.396，處于2-3，屬于中等分布寬度樣品，此結(jié)果與圖7分子質(zhì)量分布范圍相吻合。同時通過擬合曲線的斜率開方得到Rg值為31.0 nm，一般來說，MALLS準確測定樣品均方根旋轉(zhuǎn)半徑Rg范圍為10～500 nm，這說明本次實驗誤差相對較小[16]。

表1 CMP的分子特征參數(shù)

注：表中數(shù)值表示為值(RSD%)，由統(tǒng)計軟件得出。

圖7 蟲草多糖(CMP)在0.3 mol/L NaNO3水溶液中(K*c/Rθ)c=0對角度的依賴關系圖

Fig.7 Angular dependence of (K*c/Rθ)c=0for the CMP in 0.3 mol/L NaNO3 aqueous solution

2.4.2 蟲草多糖(CMP)構象

運用Astra軟件進一步得到均方根旋轉(zhuǎn)半徑Rg分布圖(圖8)?？梢钥闯?，分子量的大小與均方根半徑(Rg)呈現(xiàn)正相關，也就是說隨著洗脫體積的增加，Rg有逐漸減小的趨勢，說明分子的形狀也在逐漸減小。

高分子聚合物的分子的形狀可以幫助我們更好地理解多糖的構象信息，不論是多峰分布或者分布較寬的樣品，皆可以采用GPC-MALLS聯(lián)用系統(tǒng)測定分子量及分子回轉(zhuǎn)半徑得到分子的形狀。通過擬合曲線的斜率可以獲知分子的形狀。一般來說，斜率為0.33時，分子為球型，斜率為0.5～0.6時，分子為無規(guī)線團形狀，斜率為1時，分子為棒狀[17]。由圖8構型判斷可知，兩者的線性關系較差，類似U型曲線，因此可以判斷其CMP在流動相溶液中為典型的高枝化度結(jié)構。

圖8 蟲草多糖(CMP)分子旋轉(zhuǎn)半徑分布圖

Fig.8 The distribution diagram of molecular rotation radium

2.5 蟲草多糖(CMP)的抗氧化活性

目前DPPH自由基和ABTS自由基清除實驗已被廣泛用于評價功能成分的抗氧化作用。圖9和圖10繪制了CMP和VC對DPPH和ABTS自由基的清除活性的結(jié)果。從中可以看出CMP均表現(xiàn)明顯的DPPH和ABTS自由基清除活性，且清除能力呈現(xiàn)濃度依賴型趨勢。此外，CMP對DPPH自由基的清除效果略低于ABTS自由基，但是兩種評價方法的曲線顯著相似。

圖9 粗多糖、CMP和Vc的DPPH自由基清除率

Fig.9 The scavenging activity of crude polysaccharides,CMP and VC on DPPH radical

從圖9可以看出，當質(zhì)量濃度為1 g/L時，粗多糖、CMP和VC的DPPH自由基清除率分別為39.81%、52.53%和95.81%。相比蟲草粗多糖，CMP的DPPH自由基清除率IC50值小于1 g/L，而粗多糖清除率的IC50大于2 g/L。圖10中ABTS自由基清除實驗也得到類似的結(jié)果。因此，CMP的抗氧化活性遠大于蟲草粗多糖。

圖10 粗多糖、CMP和Vc的ABTS自由基清除率

Fig.10 The scavenging activity of crude polysaccharides,CMP and VC on ABTS radical

3 結(jié)論

本研究首次采用GPC-MALLS-RI聯(lián)用技術，對經(jīng)DEAE-52分離純化得到的蟲草多糖分子量分布及均方根旋轉(zhuǎn)半徑等進行了探究，研究發(fā)現(xiàn)CMP質(zhì)量分數(shù)為76.63%，比粗多糖質(zhì)量分數(shù)提高70.48%。CMP的重均分子質(zhì)量為2.432×107g/mol，均方根半徑為31 nm，單糖組成甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩爾比為1∶3.90∶1.51，且CMP的抗氧化活性大于粗多糖。本次研究可為進一步了解CMP的構效關系提供理論支持和必要數(shù)據(jù)。當然，本實驗缺少蟲草多糖分枝狀況和糖苷鍵構型的分析，這部分內(nèi)容有待繼續(xù)研究。