沈曉玲，楊志宏

（中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193）

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）常發(fā)生在腫瘤、局灶性癲癇和乙型肝炎等疾病治療過程中，是指細胞長期接觸一種藥物后不僅對該藥物產生耐藥性，也對結構和功能不同的多種治療藥產生交叉耐藥性［1-3］。MDR的出現(xiàn)使得藥物治療效果不佳，患者生存期縮短，死亡率升高，因此開發(fā)MDR逆轉劑十分必要。

ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白表達和功能的異常是造成MDR的重要因素。ABC轉運蛋白是一個轉運蛋白超家族，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)48個基因編碼ABC轉運蛋白，根據基因同源性及結構相似性分為7個亞家族，分別為ABC轉運蛋白A~G［4］。其廣泛分布于人體中，依靠水解ATP釋放的能量逆濃度梯度進行物質轉運，介導人體眾多重要的生理過程，如營養(yǎng)吸收、信號轉導和脂質代謝等，起到維持機體穩(wěn)態(tài)的重要作用［5］。在MDR中，ABC轉運蛋白過表達可導致細胞對藥物攝取減少同時增加藥物泵出量，使得細胞內藥物濃度降低，無法達到預期治療效果。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）和MDR相關蛋白（MDR-associated protein，MRP）為ABC轉運蛋白成員，其表達上調是造成MDR的重要原因。下調這3種轉運蛋白表達是逆轉MDR的關鍵。

目前MDR逆轉劑的臨床試驗結果并不盡如人意，其研發(fā)難點在于如何選擇合適作用位點，在達到逆轉MDR的同時減少對ABC轉運蛋白正常生理功能的影響。若其結合位點不具有特異性，可能導致藥物毒性或不良反應；若其作用位點單一，由于不同轉運蛋白存在代償現(xiàn)象且有多條信號通路調控同一轉運蛋白，會使作用效果不佳。因此研究上述3種轉運蛋白的信號轉導通路，可更好了解其作用機制，尋找新的作用靶點以開發(fā)高效MDR逆轉劑。研究發(fā)現(xiàn)，多種內源性和外源性刺激因子，可激活NF-κB信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）級聯(lián)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號通路和音猬因子（sonic hedgehog，Shh）信號通路等多條信號轉導通路，從而調節(jié)上述3種蛋白的表達。

1 多藥耐藥相關ABC轉運蛋白基本結構和功能

1.1 P-糖蛋白

人P-gp由Mdr1基因編碼，在Mdr1啟動子及其鄰近區(qū)域存在著多個轉錄因子識別位點，包括反向CCAAT盒、激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）結合位點、GC豐富區(qū)、轉錄因子NF-κB結合域和孕烷X受體反應元件等。Mdr1基因含29個外顯子，編號為-1～28，上游啟動子位于外顯子-1的起始位置，下游啟動子位于外顯子1內，存在28個內含子，其中26個可中斷蛋白質編碼序列［6-7］。P-gp是典型的ABC類載體，由2個同源區(qū)段組成，每個區(qū)段含6個α螺旋構成的疏水跨膜區(qū)和1個ATP結合域?？缒^(qū)可形成藥物結合位點和藥物輸運通道，底物與跨膜區(qū)結合后，2個ATP結合域相互靠近并與ATP結合，形成“三明治”結構，中間形成孔道，將底物泵出細胞外［8］。在人體中，P-gp主要表達于腸、腎、肝、腦血管、睪丸和胎盤等，成為血腦屏障、血睪屏障和胎盤屏障的重要部分。P-gp特異性較差，外排底物廣泛，可外排分子結構差異較大的親脂性或兩親性藥物［9］。

1.2 乳腺癌耐藥蛋白

BCRP由655個氨基酸組成，是半ABC轉運蛋白，相對分子質量為72.6 ku［10］。其基因定位在4號染色體長2區(qū)2帶（4q22）上，基因長度為66 kb，含16個外顯子和15個內含子，缺乏標準的TATA盒，但在CpG島的下游含5個激活轉錄因子1結合位點和若干AP-1結合位點，同時還包括若干雌激素、孕激素結合元件和低氧反應元件，提示激素和低氧可能調控BCRP的表達［11-13］。BCRP在結構上與一般ABC轉運蛋白不同，僅有1個由6條肽鏈組成的跨膜區(qū)和1個ATP結合域，常以二聚體或多聚體形式發(fā)揮作用［14］。BCRP在胎盤、腦、前列腺、小腸、睪丸、卵巢、結腸和肝中高度表達，是血腦屏障、血睪屏障和胎盤屏障的重要組成部分。BCRP對米托蒽醌、拓撲替康和多柔比星等產生交叉耐藥性，會影響乳腺癌、非小細胞肺癌和白血病等疾病的化療效果［15-16］。

1.3 多藥耐藥相關蛋白

MRP是ABC轉運蛋白的C亞族，目前發(fā)現(xiàn)9種具有轉運功能的 MRP，分別為 MRP1～MRP9［17］。其結構與P-gp類似，具有2個跨膜區(qū)和2個ATP結合域。MRP家族成員根據其跨膜區(qū)結構分為2類，MRP1，MRP2，MRP3，MRP6和MRP7除有2個由5～6個α螺旋構成的跨膜區(qū)外，其-NH2端還有5個跨膜螺旋。而MRP4，MRP5，MRP8和MRP9的-NH2端只有約200個氨基酸，保守性低。MRP家族廣泛分布于肺、腎、睪丸和心等臟器中，各亞型的結構、分布和轉運底物都存在較大差異。MRP介導的MDR機制可能為抗癌藥物與谷胱甘肽結合后，從細胞核移至細胞質囊泡中，由MRP排出細胞［18］。

2 多藥耐藥相關信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

MDR相關蛋白表達與功能主要由NF-κB信號通路、MAPK級聯(lián)信號通路、PI3K/AKT信號通路和Shh信號通路等調控，許多內源性或外源性刺激都可激活這些通路（圖1），且不同信號通路間存在相互影響和交疊作用。

2.1 NF-κB信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

NF-κB常以p50/p65二聚體的形式存在，在機體正常生理狀態(tài)和疾病模式下都起著重要的調節(jié)作用。通常NF-κB及其抑制蛋白（inhibitor of κappaB，IκB）在細胞質中結合，不具有生物活性，當細胞受到刺激時，IκB發(fā)生磷酸化繼而被降解，NF-κB釋放，進入細胞核，與靶基因結合，調控多種基因表達，因此與腫瘤MDR發(fā)生有密切關系［19］。

2.1.1對P-糖蛋白的調控作用

NF-κB可在內源性和外源性刺激下激活，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、MAPK以及內毒素、致癌物輻射和化學治療劑等［20］。NF-κB進入細胞核后可與Mdr1基因第1個內含子中NF-κB位點結合，啟動Mdr1基因的表達，通常情況下可上調Mdr1mRNA和P-gp的表達［21］。

TNF-α和白細胞介素17（interleukin 17，IL-17）等內源性刺激通過不同途徑激活NF-κB信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可誘導外周血單個核細胞P-gp的表達與功能增強，在加入NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨后，TNF-α對P-gp的誘導作用減弱，推測TNF-α可能通過激活NF-κB信號通路上調P-gp表達與功能［22］。而IL-17可能通過激活信號傳導轉錄啟動因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）/NF-κB通路誘導P-gp的表達上調［23］。當人體穩(wěn)態(tài)失調，出現(xiàn)腫瘤病變時，這些內源性因子釋放量會增加，由于其能上調部分ABC轉運蛋白表達，導致MDR加重，削弱化療效果，在治療過程中值得注意。腫瘤細胞在自身分裂增殖過程中也可激活NF-κB信號通路，誘導P-gp表達增加，G2/M期阻滯引起檢測點激酶2的激活，隨后增加p53并促進細胞核中的p65積聚，最終上調P-gp表達［24］。

氯離子通道（chloride channel，ClC）3是電壓門控ClC蛋白家族的成員，在多種腫瘤細胞中高表達，與癌細胞的增殖、凋亡和轉移相關。ClC-3在人胃癌組織中過表達，敲除其基因后可在體外抑制細胞增殖和遷移［25-26］。已有研究表明，ClC-3參與腫瘤MDR形成，減弱化療藥治療效果。ClC-3過表達可減弱順鉑對人膠質瘤U251細胞的抑制作用［27］。ClC-3可加速囊泡酸化，降低藥物在細胞內濃度，此外其也可對P-gp產生影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ClC-3可通過激活NF-κB信號通路上調MDR1 mRNA和P-gp的表達。在乳腺癌耐細胞株MCF-7/DOX 中，IκB激酶α（IκB kinase α，IKKα），IKKβ和NF-кB/P65蛋白的表達顯著高于MCF-7細胞。通過轉染pcDNA3.1/ClC-3載體，MCF-7細胞中ClC-3的表達顯著上調，并且增加了IKKα，IKKβ，NF-кB/P65以及磷酸化IкBα/Ser32的表達。此外，MCF-7細胞中ClC-3表達的上調導致p65從細胞質轉移至細胞核，啟動P-gp表達［28］。在IL-1β或TNF-α激活NF-κB信號通路過程中，ClC-3也起著必不可少的作用。IL-1β或TNF-α可激活細胞內還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinu?cleotide phosphate，NADPH）氧化酶1進而產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS是細胞內信號傳導重要介質，可激活NF-κB，但這一過程需要ClC-3來中和NADPH氧化酶1在信號傳導內膜上產生的電子流［29］。ClC-3是一個非常重要的信號調控節(jié)點，有成為MDR逆轉劑靶點的潛在可能，抑制ClC-3一方面可降低腫瘤細胞增殖和遷移，另一方面可降低P-gp表達，增強化療藥療效，同時還可在一定程度上降低NF-κB對IL-1β或TNF-α刺激的響應，達到逆轉MDR，治療腫瘤的目的。

除內源性物質外，外源性藥物也可影響該信號通路。近期研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可逆轉卵巢癌耐藥性，作用機制可能為減少細胞核內p65含量，抑制IκBα磷酸化，從而抑制NF-κB的激活，最終下調P-gp的表達［30］。這一發(fā)現(xiàn)提示我們可從已有藥物入手，對已有藥物進行二次開發(fā)，挖掘藥物新的藥理作用以逆轉MDR。

但也有研究表明，NF-κB活化，p65核轉位增加可減少P-gp mRNA和蛋白的表達。在人結直腸腺癌細胞LS-174T細胞中，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的特異性激動劑佛波酯可顯著降低細胞中P-gp mRNA和蛋白的表達，其作用機制可能為佛波酯活化PKC，進而磷酸化IKKα/β和IκBα，使得NF-κB被激活，引起p65核轉位增加。細胞核內的p65與孕烷X受體/維A酸X受體復合物結合，阻礙該復合物與Mdr1基因上調控序列結合從而下調P-gp的mRNA和蛋白質表達［31］。

圖1多藥耐藥相關ATP結合盒轉運蛋白信號轉導通路.Nrf-2：核因子E2相關因子2；Keap1：胞質接頭蛋白；ARE：抗氧化反應元件；STAT3：信號傳導轉錄啟動因子3；RPTK：受體蛋白酪氨酸激酶；Ras：大鼠肉瘤蛋白；Raf：絲裂原活化蛋白激酶激酶；Smo：抑制跨膜蛋白；AP-1：激活蛋白1；ERK：細胞外信號調節(jié)蛋白激酶；GFR：生長因子受體；PIP2：二磷酸肌醇；P38：相對分子質量為38 ku絲裂原活化蛋白激酶；IL-17：白細胞介素17；IκB：NF-κB抑制蛋白；NF-κB：活化B細胞核因子κ-輕鏈增強子；Nox-1：NADPH氧化酶1；ROS：活性氧；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶；PDK：磷酸肌醇依賴蛋白激酶；PIP3：三磷酸肌醇；MEK：絲裂原活化蛋白激酶激酶；PTCH1：跨膜受體蛋白1；AKT：蛋白激酶B；JNK：c-Jun氨基端激酶（應激活化蛋白激酶）；ClC-3：氯離子通道3.

2.1.2對乳腺癌耐藥蛋白和多藥耐藥相關蛋白的調控作用

在耐多柔比星乳腺癌細胞株MCR-7/ADR中，人第10號染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）可抑制NF-κB信號通路活化，miR-132/-212通過抑制PTEN從而激活NF-κB信號通路，上調BCRP表達，導致腫瘤細胞對多柔比星敏感性降低，還發(fā)現(xiàn)miR-132和miR-212過表達至少部分歸因于NF-κB轉錄因子的反式激活［32-33］。NF-κB 還可與雌激素協(xié)同作用，調控BCRP基因的表達。雌激素受體（estrogen receptor，ER）和雌激素應答元件（estrogen response element，ERE）在BCRP表達調控中發(fā)揮作用。促炎因子以NF-κB依賴方式增強ER活性。ER允許NF-κB家族成員p65訪問位于ERE附近的潛在NF-κB應答元件。NF-κB的募集反過來穩(wěn)定雌激素與ER和ERE的結合率。ER和p65在相鄰反應元件上的這種協(xié)同結合的結果導致Abcg2mRNA和蛋白質表達的顯著增加［34］。以MDR相關ABC轉運蛋白信號通路上的相關目的基因元件為靶點設計基因藥物，可以恢復耐藥性細胞對化療藥物敏感性。

機體內部環(huán)境的改變有可能影響ABC轉運蛋白的表達與功能，造成MDR。在高氨血癥中，血氨水平異常升高可在體內外激活NF-κB信號通路，增加MRP2mRNA和蛋白表達，這種作用可被NF-κB抑制劑改變［35］。共濟失調毛細血管擴張突變（ataxia telangiectasia-mutated，ATM）基因參與DNA雙鏈斷裂修復，在化療藥物誘導的MDR形成中起重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，喜樹堿和順鉑在治療小細胞肺癌時可激活ATM基因，其編碼的蛋白磷酸化后可刺激IκBα和P65的磷酸化，增加P65的核轉位，從而上調MRP2和ABCG2的表達，導致MDR［36］。

NF-κB信號通路可被多種因素激活，激活后可上調P-gp，BCRP和MRP在細胞內的表達，NF-κB活化是整個信號通路的關鍵點，可開發(fā)其抑制劑，以達到改善MDR的目的，但仍需注意其可能帶來的毒性及副作用。

2.2 MAPK級聯(lián)信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在接受細胞外信號刺激后可通過三級激酶級聯(lián)反應傳遞信號。炎癥反應、氧化應激以及一些細胞外信號刺激先后激活MAPK激酶激酶（MAPK kinase kinase，MKKK/Raf）和 MAPK 激酶（MAPK kinase，MKK/MEK），然后通過絲氨酸和蘇氨酸雙位點磷酸化激活MAPK，活化的MAPK進入細胞核內，磷酸化轉錄因子，調節(jié)多種結構蛋白及酶類，維持細胞正常生理狀態(tài)［37］。

MAPK主要有4個亞族，分別是細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、P38和ERK5，分別介導4條不同的信號通路［38］。其中ERK，JNK和P38介導的通路在MDR機制中研究較多。

2.2.1 ERK信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

Raf/MEK/ERK級聯(lián)信號通路是參與調節(jié)正常哺乳動物細胞增殖、存活和分化的關鍵信號傳導途徑。它將來自細胞表面受體的信號通過磷酸化方式逐級傳遞至細胞核調節(jié)眾多基因表達。大鼠肉瘤蛋白（rat sarcoma protein，Ras）是該條信號通路的關鍵上游激活劑。生長因子與其受體結合后激活酪氨酸激酶，通過銜接蛋白將信號傳遞至Ras蛋白，使其活化，活化的Ras使Raf絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化而激活MEK1/2雙特異性蛋白激酶，然后磷酸化并激活ERK1/2?；罨腅RK是信號傳導模塊的下游組分，可易位至細胞核，磷酸化和調節(jié)各種轉錄因子，包括AP-1，最終導致基因表達的變化［39-40］。

近期研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）可參與腫瘤微環(huán)境形成，調節(jié)免疫系統(tǒng)以促進腫瘤生長，其外泌體可在體內外增強胃癌細胞的化學抗性。雖MSC外泌體攜帶P-gp蛋白，但這并不是其發(fā)揮抗藥性的主要機制。MSC外泌體主要依靠鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CaM-Ks）/Raf/MEK/ERK軸的激活上調MDR1，MRP和LRP基因表達從而產生MDR。MSC外泌體可能通過受體與胃癌細胞相互作用，導致鈣通道的激活和細胞內鈣的流入，形成鈣/鈣調蛋白復合物激活CaM-Ks。CaM-Ks激活后，Raf1，MEK1/2和ERK1/2活化增加，從而上調相關基因表達，表明Raf/MEK/ERK激酶級聯(lián)反應是CaM-Ks的下游之一。且CaM-Ks特異性抑制劑KN-93阻斷了MSC外泌體對Raf/MEK/ERK激酶的活化［41］。MSC外泌體可能是MDR逆轉劑的潛在作用靶點，開發(fā)其抑制劑不僅可改善腫瘤細胞微環(huán)境也可通過阻斷信號通路下調MDR相關基因表達。

另有研究表明，Ras-Raf-ERK信號通路下游的效應因子不同，對BCRP的調控作用不同。激活MEK-ERK-RSK途徑可使BCRP轉錄下調，而激活MEK-ERK-non-RSK途徑后BCRP轉錄上調。雖ERK的直接下游效應因子仍有待闡明，但這些研究提供了BCRP表達調節(jié)機制的新見解，有助于BCRP特異性調節(jié)劑的研發(fā)［42］。

2.2.2 JNK信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

JNK信號通路可被多種細胞因子激活，激活后參與多種生理活動，包括細胞的增殖分化、細胞凋亡、應激反應等。MDR的產生也與該通路有著密切的關系。研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路影響人肝癌耐藥細胞株Bel-7402/FUMDR1基因和P-gp的表達。耐藥細胞中JNK蛋白含量并不增加，但p-JNK蛋白增加，抑制JNK信號通路后，MDR1 mRNA和P-gp表達均下降［43］。研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路被激活后，c-Jun和c-Fos蛋白表達增加，由二者組成的異二聚體AP-1含量增加，與Mdr1上AP-1結合位點的結合增強，從而上調MDR1表達［44］。JNK信號通路也可調節(jié)MRP表達，龍葵堿可通過抑制JNK信號通路下調MRP1表達使得抗性人髓系白血病細胞系K562/ADM對注射用鹽酸多柔比星恢復敏感［45］。

JNK信號通路對MDR相關蛋白表達和功能的調控除與基因結合的轉錄因子類型相關外，還受腫瘤細胞所處環(huán)境影響。在常氧狀態(tài)下，JNK信號通路激活可誘導人非小細胞肺癌細胞HOP-62中MDR1表達下調，其機制是增加c-Jun與MDR啟動子中AP-1位點的結合，這一過程需要組蛋白去乙?；?來共同作用。但在細胞低氧狀態(tài)下JNK通路誘導MDR1上調是通過增加低氧誘導因子1與MDR1啟動子中低氧應答元件的結合實現(xiàn)，同時需要轉錄共激活因子P300/CBP參與［46］。由于腫瘤生長過程中普遍存在由于供血不足和癌細胞增殖能量消耗導致的組織低氧，故而激活JNK信號通路往往可使腫瘤細胞的Mdr1基因表達上調，誘導腫瘤MDR現(xiàn)象。因此，在開發(fā)MDR逆轉劑時也可從改善腫瘤內部環(huán)境著手。

2.2.3 P38MAPK信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

P38蛋白由360個氨基酸組成，分子質量為38 ku。在其一級結構上存在含蘇氨酸和酪氨酸“T環(huán)結構”，是決定P38MAPK活性的關鍵區(qū)域。生理應激、細胞炎性因子如TNF-α、IL-1、藥物等因素均可經過三級激酶級聯(lián)反應使“T環(huán)結構”上蘇氨酸和酪氨酸雙磷酸化，激活P38MAPK，活化的P38信號通路可調控多種基因轉錄活性，如NF-κB、熱休克轉錄因子等［47］。Mdr1基因作為其下游基因亦受P38信號通路調節(jié)，P38過度活化可上調P-gp表達，導致MDR。從藤黃木材中分離出的3種化合物藤黃酮K（guttiferone K）、嶺南山竹子素C（oblongi?folin C）和異巴西紅厚殼素（isojacareubin）可在轉錄水平上調控P-gp表達，使用P38MAPK特異性抑制劑SB202190可逆轉上述3種化合物對P-gp表達的上調，表明P38MAPK信號通路確實參與P-gp表達調控［48］。積雪草酸可增加抗順鉑肺癌細胞A549/DDP細胞株對順鉑敏感性，其機制可能為抑制P38磷酸化，進而抑制Y-盒結合蛋白1核轉位，從而下調P-gp表達［49］。P38MAPK信號通路的激活也可增加難治性癲癇大鼠腦內MRP1的表達，與P-gp產生外排抗癲癇藥物的協(xié)同效應［50］?！癟環(huán)結構”上蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點可考慮作為MDR逆轉劑作用靶點，可從天然藥物篩選合適結構母體。

細胞在氧化應激時產生過量ROS，ROS也參與MDR形成。ROS可同時激活ERK，JNK和P38MAPK信號通路，上調K562/ADR細胞中P-gp表達，使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸后可顯著抑制P-gp表達水平，且效果優(yōu)于MAPK抑制劑［51］。這一發(fā)現(xiàn)提示可開發(fā)抗氧化劑從而達到逆轉MDR的目的。

2.3 PI3K/AKT信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

PI3K/AKT通路參與調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能。生長因子與細胞膜上相應受體結合，活化PI3K，活化的PI3K將二磷酸肌醇轉化成三磷酸肌醇，作用于磷酸肌醇依賴蛋白激酶（phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK）使其具有活性，活化的PDK通過PH結構區(qū)使與細胞膜上三磷酸肌醇緊密結合的AKT磷酸化，活化的AKT轉移至細胞核內調控基因表達［52-53］。

研究發(fā)現(xiàn)，IκB作為PI3K/AKT信號通路的下游蛋白，在該信號通路激活后磷酸化增加，導致進入細胞核內的NF-κB增多，繼而激活轉錄，P-gp表達增加［54］。HOX基因家族（homeotic gene）的成員HOXB4與人白血病的發(fā)生、發(fā)展、不良預后和耐藥性有關，HOXB4的高表達可激活PI3K/AKT信號通路，上調P-gp、MRP1和BCRP蛋白表達，增加抗癌藥物的外排作用［55］。在耐藥人慢性髓系白血病細胞株K562/ADR中，細胞PI3K/AKT途徑被激活，P-gp含量增加，導致化療藥物作用不佳，白藜蘆醇可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，減少AKT磷酸化從而下調P-gp表達，且作用效果與特異性抑制劑LY294002相似［56］。PI3K/AKT途徑除可在基因水平調控MDR相關蛋白外，還可影響其在細胞膜上定位。BCRP在細胞表面的相對表達受到PI3K/AKT信號通路調節(jié)且在極化細胞中呈正相關，AKT活性的改變可能通過影響B(tài)CRP在細胞膜上定位而影響B(tài)CRP底物的外排［57］。

2.4 Shh信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

Shh是機體發(fā)育過程中重要的分泌蛋白，其在腦和脊髓發(fā)育以及下丘腦的神經發(fā)生中起著很好的作用［58］。Shh信號通路已被證明與癌細胞對化療藥物抵抗有關［59］。跨膜受體蛋白-碎片蛋白（patched，PTCH）在無Shh配體的情況下抑制跨膜信號蛋白-潤滑蛋白（Smoothened，Smo）的活性，作為該途徑的效應子起作用的轉錄因子Gli被蛋白水解加工成Gli阻遏物形式，使得Shh靶基因關閉。當Shh配體與PTCH-1結合后，PTCH-1從細胞表面移出，Smo蛋白磷酸化激活Shh信號傳導途徑，Gli阻遏物加工被阻斷，轉錄因子Gli活化，激活靶基因的表達［60-61］。在抗多柔比星人乳腺癌MCF-7細胞中，Shh信號通路被激活，P-gp和BCRP蛋白表達上調，表明Mdr1和ABCG2基因可能為該通路的下游靶基因［62］。在多發(fā)性骨髓瘤抗性細胞系RPMI 8226/R細胞中，Shh，Smo和Gli2的表達顯著增強，在使用Gli2轉錄抑制劑GANT61后，Gli2的表達顯著下降，細胞對多柔比星敏感性增強，耐藥指數(shù)由5.51降至1.69［63］。在該通路中Smo和Gli有成為MDR逆轉劑作用位點的可能，開發(fā)這2個位點的單一或雙位點抑制劑可下調Shh信號通路對MDR相關ABC轉運蛋白調控作用。

2.5 其他信號通路對相關ABC轉運蛋白的調控作用

在細胞增殖分化、細胞損傷/應激反應中發(fā)揮關鍵作用的Notch信號通路也參與了腫瘤MDR形成。在哺乳動物細胞中該信號通路由Notch基因、Notch受體、Notch配體和C啟動結合因子1（C promoter binding factor 1，CBF1）組成。當Notch受體與配體結合后，notch胞內域（notch intracellular domain，NICD）被激活，經Notch活化/解聚素金屬蛋白酶 17（a disintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）剪切，從細胞膜解離并轉移到細胞核內，與CBF1結合形成NICD-CBF1復合體，NICD與CBF1蛋白的結合使CBF1蛋白由轉錄抑制物轉變?yōu)檗D錄激活物，激活靶基因的轉錄［64-65］。異常Notch表達有助于各種惡性腫瘤的發(fā)展，降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。在原發(fā)性肝癌中，Notch信號的激活使得細胞對化療藥物索拉非尼、依托泊苷和紫杉醇敏感性降低，在使用Notch活化/裂解酶ADAM17抑制劑后，增強了索拉非尼在荷瘤裸鼠模型中抑制腫瘤生長作用［66］。新近研究發(fā)現(xiàn)，Notch1參與了肺腺癌MDR產生，其作用機制可能是通過Notch1/AP-1/miR-451/MDR1信號軸影響肺腺癌細胞對化療藥物敏感性［67］。綜上，在Notch信號通路中，ADAM17可作為抑制劑開發(fā)的潛在作用靶點。

MRP2受核因子E2相關因子2（nuclear erythroid-2 related factor-2，Nrf-2）和抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）調控。在正常生理狀態(tài)下Nrf2在細胞質中與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）結合處于非活性狀態(tài)，以維持在生理狀態(tài)下Nrf2的低表達與轉錄活性。在低氧刺激下，多種蛋白激酶（如p38和p53）可直接誘導Nrf2磷酸化或修飾Keap1的半胱氨酸殘基使其構象發(fā)生改變，導致Nrf2與Keap1解離而活化?；罨腘rf2進入細胞核與ARE結合，啟動ARE下游的MRP2的基因轉錄和表達。在小鼠MRP2基因5’端發(fā)現(xiàn)2個ARE結合區(qū)域，即ARE-1（-95～-85）和ARE-2（-1391～-1381），凝膠遷移和超遷移測定表明Nrf2蛋白復合物優(yōu)先結合ARE-1序列［68-69］。而腫瘤細胞中通常存在微低氧環(huán)境，在一定程度上可激活Nrf2信號通路，誘導MDR發(fā)生。

在人胎盤細胞中，環(huán)加氧酶2/前列腺素E2/E-前列腺素受體信號通路的激活可改變ABCB1和ABCG2基因的表達。前列腺素E2是環(huán)加氧酶2的主要產物，可通過位于胎盤的前列腺受體1和3上調BCRP的表達。有趣的是前列腺素E2可上調MDR1轉錄，但對P-gp的表達和功能并無影響［70］。

3 結語與展望

成功的MDR逆轉劑應具有良好的體內藥物代謝動力學性質，較小的毒副作用，并可同時阻斷多條信號通路以達到下調多種ABC轉運體的目的。同時阻斷多條信號通路有2種策略，一是找到各信號通路相互之間的調控節(jié)點，如NF-κB，AP-1，c-Jun和AKT等，開發(fā)對應的抑制劑。二是開發(fā)多位點抑制劑，同時抑制多個位點，阻斷各位點介導的信號通路。

P-gp，BCRP和MRP的表達均受到多條信號通路調節(jié)，且不同信號通路之間存在相互影響。程序性細胞死亡配體1是在腫瘤細胞上表達的免疫抑制分子，通過與T細胞上的程序性細胞死亡受體1結合，同時激活PI3K/AKT和MAPK/ERK途徑，上調P-gp表達［71］。血管生成素樣蛋白4不僅可同時激活PI3K/AKT，NF-κB和MEK/ERK途徑上的關鍵信號轉導介質從而上調P-gp，BCRP和MRP基因表達，還可提高處于上皮-間充質轉化期癌細胞中ATP供應以增強ABC轉運蛋白外排能力［72］。IL-6和TNF-α等多種細胞因子都可激活MDR相關ABC轉運蛋白的信號通路，往往可上調上述3種轉運蛋白表達，而轉運蛋白表達增加后又可促進某些炎癥因子分泌，如MRP1通過谷胱甘肽化修飾IL-1β增加其分泌，形成正反饋調節(jié)，加重疾病的發(fā)展［73］?？筛鶕@一特點開發(fā)上游刺激因子抑制劑，阻斷信號通路激活，從而下調相關基因表達，達到逆轉MDR的目的。除此之外，NF-κB，AP-1，c-Jun和AKT等是多條信號通路的調控節(jié)點，可開發(fā)下游響應因子抑制劑，阻斷其與目的基因結合。兩者均可通過單一位點抑制達到阻斷多條信號通路效果，從而降低MDR逆轉劑的開發(fā)難度。

近年來，中藥成分對ABC轉運蛋白的抑制作用成為研究熱點。原花青素是一種類黃酮類化合物，可能通過抑制JNK，p38，ERK1/2和NF-κB多條信號通路下調P-gp的表達［74］。黃芩素可能通過抑制P38 MAPK和NF-κB信號通路來逆轉BCRP介導的MCF-7/MX細胞的MDR［75］。半枝蓮的乙醇提取物可能通過抑制PI3K/AKT通路從而逆轉結腸直腸癌的化療耐藥性［76］。中藥多成分、多靶點等特點與MDR機制的復雜性相契合，因此，對中藥成分進行深入研究有助于開發(fā)多效抑制劑。

研究MDR相關ABC轉運蛋白的信號轉導機制有助于研發(fā)更加高效的調節(jié)劑，以達到增加藥物在病變細胞中分布與累積，增強藥物療效逆轉MDR的目的。但ABC轉運蛋白在正常生理狀態(tài)下具有維持機體穩(wěn)態(tài)，保護機體免受內源性或外源性有毒物質損害的作用，如何在增強調節(jié)劑逆轉MDR的同時，降低其對機體穩(wěn)態(tài)造成的影響，找到兩者的平衡點，尚需深入研究。