張 杰，丁淑梅，邱紅梅，黃 波，吳 芹，蔣青松

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶 400016；2.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州遵義 563003）

糖尿病性心肌病是一種獨立于高血壓、冠心病的特異性心臟病，與糖尿病患者心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)，是糖尿病最常見并發(fā)癥之一。心肌肥厚是糖尿病性心肌病關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)改變。國內(nèi)外對糖尿病心肌肥厚已進行了較多研究，但其病理生理機制仍不清楚，缺乏有效的針對性藥物。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）屬于核受體超家族成員，有α，β（或δ）和γ 3種亞型，參與糖代謝、脂質(zhì)代謝、能量平衡、胰島素敏感性和炎癥等重要生物調(diào)節(jié)過程，作用各有側(cè)重，其調(diào)控異常與一系列代謝綜合征相關(guān)。PPAR已成為代謝相關(guān)疾病防治的重要靶點。故其選擇性激動劑，如PPARα激動劑貝特類和PPARγ激動劑噻唑烷酮類已分別用于血脂異常和糖尿病治療。苯扎貝特（bezafibrate，BEZ）是目前上市藥物中唯一的PPAR泛激動劑，主要用于高脂血癥治療。臨床研究表明，BEZ除了有效改善糖尿病患者的糖脂紊亂，亦能減少糖尿病患者心血管疾病風(fēng)險，降低糖尿病性心肌病的死亡率［1-2］。但BEZ對于心臟保護作用的臨床前研究資料較少，且劑量遠高于其臨床用量［3-4］，而BEZ在糖尿病心肌肥厚中的作用目前未見報道。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸（arachidonic acid，AA）經(jīng)細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）氧化酶途徑代謝產(chǎn)物在代謝紊亂相關(guān)疾病中具有重要作用［5］。環(huán)氧廿碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EET）是AA表氧化酶（epoxygenase）代謝途徑經(jīng)CYP2J（人源為CYP2J2，鼠源為CYP2J3）催化生成的重要代謝產(chǎn)物，對乙醇誘導(dǎo)的心肌功能紊亂和血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導(dǎo)的心肌肥厚有明顯的保護作用［6-7］。已有研究發(fā)現(xiàn)，CYP2J2/EET-PPARα途徑激活在麥冬皂苷D對內(nèi)皮細胞的保護中有重要作用［8］。He等［9］研究表明，心肌細胞過表達CYP2J2或給予EET可激活PPARγ而保護AngⅡ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，柚皮素對糖尿病心肌肥厚的保護作用與其促進EET-PPAR有關(guān)［10］。然而，CYP2J-EET相關(guān)信號通路在BEZ作用中的關(guān)系研究較少，尤其在BEZ對糖尿病心肌肥厚中的作用，目前國內(nèi)外未見報道。

故本研究擬利用鏈尿佐菌素（streptozocin，STZ）聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)小鼠糖尿病心肌肥厚模型，觀察低于臨床劑量和臨床常用劑量BEZ的作用及其與EET的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

BEZ（純度≥98%，白色粉末，批號：BCBK4044V）用0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）制成混懸液。BEZ，CMC-Na和STZ（純度≥98%，白色結(jié)晶，批號：WXBC2544V溶于pH 4.2-4.4枸櫞酸鹽緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用）購自美國Sigma公司。甘油三酯（triglyceride3，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCH）含量測定試劑盒和14，15-EET ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠β肌動蛋白多抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購自美國Proteintech Group，Inc.；兔抗小鼠CYP2J3多抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-Green Supermix和PCR引物購自寶生物工程（大連）有限公司；其余試劑均為分析純。

血糖儀（三諾）；顯微鏡及NIH醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon）；ELX 800酶標(biāo)儀（美國BioTek）；化學(xué)發(fā)光和熒光測定儀、定量PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）；臺式超速低溫離心機（美國Thermo）。

1.2 動物

SPF級雄性健康昆明小鼠，體質(zhì)量17～20 g購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（渝）2017-0023，按實驗動物使用的3 R原則給予人道關(guān)懷。小鼠于室溫22～25℃，12 h明暗交替環(huán)境中進行實驗。

1.3 動物模型的制備和分組

小鼠高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周后，ip給予STZ 40 mg·kg-1，連續(xù)5 d。7 d后，用三諾GA-3型血糖儀及試紙測量小鼠空腹血糖（fast blood glucose，F(xiàn)BG）水平。隨機取FBG≥11.1 mmol·L-1小鼠45只，即糖尿病小鼠，繼續(xù)給予高糖高脂飲食4周（喂養(yǎng)3周內(nèi)死亡3只）。隨機選取10只糖尿病小鼠處死，檢測其左心室肥厚指數(shù)（left ventricle hypertrophy index，LVHI）、左心室質(zhì)量/體質(zhì)量（body mass，BM）（LV/BM）和左心室組織心房肽（atrial natriuretic factor，ANF）mRNA表達水平等心肌肥厚相關(guān)指標(biāo)，并觀察左心室組織病理學(xué)改變，確定糖尿病心肌肥厚形成［11］。將剩余糖尿病心肌肥厚小鼠隨機分為3組：模型組（給予等劑量CMC-Na溶劑）（n=12）；BEZ 25 mg·kg-1組（約為臨床常用劑量1/3）（n=10），BEZ 75 mg·kg-1組（與臨床常用劑量相當(dāng)）（n=10）。小鼠ig給予相應(yīng)藥物，1次/d，持續(xù)4周。另設(shè)正常對照組小鼠（n=10）給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周后，連續(xù)5 d ip給予等劑量枸櫞酸緩沖液，7 d后檢測FBG；繼續(xù)喂養(yǎng)4周后ig給予等劑量CMC-Na，1次/d，持續(xù)4周。每周檢測小鼠FBG和BM。

給藥治療4周后，處死小鼠，摘取心臟，生理鹽水漂洗后濾紙吸干3次，分離左心室（left ventricle，LV）與右心室及室間隔（right ventricle+septum，RV+S），電子分析天平稱重，計算LVHI〔即左心室與右心室及室間隔的質(zhì)量比，LV/（RV+S）〕和LV/BM。部分左心室組織經(jīng)固定做病理分析，剩余組織液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.4 血清中TCH和TG含量的檢測

全血室溫自然凝固30 min，4℃下3000×g離心20 min，收集上清，分裝后凍存于-80℃冰箱備用。按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀檢測510 nm或450 nm波長吸光度值，分別根據(jù)公式計算血清中TCH和TG含量。

1.5 HE和Masson染色觀察左心室組織病理改變

取新鮮左心室組織，4%多聚甲醛固定后，利用不同濃度乙醇和二甲苯逐級脫水透明，石蠟包埋切片后貼于載玻片上，60℃烘箱中烤2 h備用。取切片二甲苯脫蠟，不同濃度乙醇逐級脫水后，進行組織切片HE染色和Masson染色，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、拍照，用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件測量單個細胞表面積和膠原組織所占百分比。即每張HE切片隨機取5個視野，每個視野檢測10～20個細胞，取其平均值為單個細胞表面積；或每張Masson染色切片隨機取5個視野，計算每個視野中膠原組織所占百分比，取平均值代表膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（qRT-PCR）檢測左心室心房肽（atrial natrinretic factor，ANF）mRNA表達

Trizol提取左心室組織總RNA，按說明書操作，以β肌動蛋白為內(nèi)參基因在實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96）上進行擴增反應(yīng)，ANF引物序列：上游，5′-GCAAACATCAGATCGTGCCC-3′和下游，5′-CACCGCACTGTACACAGGAT-3′，122 bp；β肌動蛋白引物序列：上游，5′-CCACCATGTACCCAGGCATT-3′和下游，5′-AGGGTGTAAAACG?CAGCTCA-3′，PCR產(chǎn)生長度為101 bp。反應(yīng)程序如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，循環(huán)閾值（Ct值）作為統(tǒng)計參數(shù)，mRNA的表達水平采用2-ΔΔCt表示。每組重復(fù)3次。

1.7 Western印跡法檢測左心室CYP2J3蛋白表達

用RIPA裂解液提取小鼠左心室組織蛋白，稀釋后BCA法測蛋白濃度。總蛋白加上樣緩沖液混勻煮沸變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，BSA室溫封閉2 h；加入不同一抗：β肌動蛋白（1∶3000），CYP2J3（1∶1000），4℃ 過夜；TBST洗膜，5 min×3次；二抗（1∶4000）室溫孵育2 h，洗膜后加ECL發(fā)光法顯影，凝膠成像儀采集圖像，采用Image Lab軟件分析積分吸光度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值的比值表示蛋白的相對表達量。

1.8 ELISA法檢測血清中14，15-EET含量

應(yīng)用ELISA法，按說明書操作。將50 μL血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品加入包被微孔中；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入HRP標(biāo)記的檢測抗體100 μL，37℃孵育60 min，洗板5次，然后每孔加入底物A、B各50 μL，37℃ 避光孵育15 min后加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出每個樣本中14，15-EET含量。每組重復(fù)6次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 糖尿病心肌肥厚小鼠一般狀況及體質(zhì)量

正常對照小鼠組精神狀態(tài)良好，相對活躍，食量、飲水量和尿量正常，實驗期間無死亡。模型組小鼠給予STZ后，3周內(nèi)死亡3只，其余小鼠精神逐漸萎靡，毛色晦暗，進食量、飲水量增加，尿量明顯多于對照組，墊料潮濕快。給BEZ 25和75 mg·kg-1后，小鼠精神狀態(tài)明顯改善，食量、飲水量及尿量較模型組減少。

各組小鼠BM在實驗初始時無明顯差異。整個實驗過程中，正常對照組小鼠BM隨時間推移而增加，實驗結(jié)束時增加了1.9倍（P＜0.01）。高脂飼養(yǎng)小鼠給予STZ前均隨時間增加而增加，各組間無明顯差異，連續(xù)小劑量給予STZ 5 d，7 d后（STZ 7 d），BM均明顯降低（P＜0.05）；實驗期末，模型組小鼠BM僅為正常對照組的68.1%（P＜0.01）。BEZ 25和75 mg·kg-1組給藥4周，BM分別增加了5.6%和22.1%，與模型組相比，BM分別增加了15.7%和30.7%，達到同期正常對照組的78.9%和89.1%。結(jié)果見圖1。

Fig.1 Changes of body mass in diabetic cardiac hyper?trophy mice.Diabetic model was established by feeding mice a high-energy diet for 4 weeks（4 w）combined with streptozotcin（STZ，40 mg·kg-1，ip）×5 d.After 7 d（STZ 7 d），the fasting blood glucose（FBG）levels of the mice were assayed，and the mice with FBG ≥11.1 mmol·L-1were considered diabetic（DM）.DM mice were continued on the high-energy diet for 4 weeks（4w-DM）.Then，left ventricular hypertrophy was confirmed by left ventricular hypertrophy index（LVHI，ie mass ratio of left ventricle to right ventricle and septum），left ventricular-to-body mass ratio（LV/BM），atrial natriuretic factor（ANF）mRNA expression and histopathological observation in 10 diabetic mice which were randomly selected.The remaining diabetic mice were then randomly divided into three groups：diabetic cardiac hypertrophy（model group）（n=12），bezafibrate（BEZ）at 25 mg·kg-1group（about 1/3 of the clinically used dose）（n=10）and BEZ at 75 mg·kg-1group（the clinically used dose）（n=10）.The mice were given BEZ at the corresponding dose（ig）once a day for 4 weeks（1 w-4 w）.BEZ was replaced by an equal volume of 0.5%carboxymethyl?cellulose sodium（CMC-Na）in normal control group and model group.±s.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group；△△P＜0.01，compared with initial；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，compared with before STZ.

2.2 BEZ對糖尿病心肌肥厚小鼠血糖和血脂的影響

給予STZ 7 d后，模型組小鼠FBG明顯升高，達（20.5±2.6）mmol·L-1（P＜0.01），在整個實驗期間，F(xiàn)BG持續(xù)保持高水平狀態(tài)；與模型組相比，給予BEZ 25和75 mg·kg-14周，F(xiàn)BG明顯改善，分別下降至19.4±2.9和（15.6±2.4）mmol·L-1（P＜0.01），但未能恢復(fù)至正常對照組水平（圖2）。糖尿病心肌肥厚模型組TG和TCH水平亦明顯升高（P＜0.01）；2個劑量BEZ均明顯改善糖尿病心肌肥厚小鼠血脂異常（P＜0.05）（表1）。

Fig.2 Effect of BEZ on fast blood glucose（FBG）in diabetic cardiac hypertrophy mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=10-12.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Tab.1 Effects of BEZ on total cholesterol（TCH）and triglycerides（TG）in diabetic cardiac hypertrophy mice

2.3 BEZ對糖尿病心肌肥厚小鼠LVHI，LV/BM和ANF mRNA表達水平及左心室病理改變的影響

與正常對照組相比，糖尿病形成4周后（4w-DM），糖尿病小鼠LVHI，LV/BM和ANFmRNA表達水平均明顯升高（P＜0.01）（表2）。與4w-DM組相比，持續(xù)高脂飲食4周后，模型組上述指標(biāo)均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，給予BEZ 75 mg·kg-1，可顯著降低LVHI和LV/BM（P＜0.01），并達正常組水平，ANFmRNA水平也顯著降低（P＜0.01），但仍高于正常對照組（P＜0.01）。HE染色顯示，4w-DM小鼠心肌細胞肥大，炎性細胞浸潤，細胞表面積明顯增加（P＜0.01）（圖3A1，A2）；Masson染色顯示，糖尿病小鼠左心室藍染面積增加，膠原纖維明顯增多，肌纖維排列紊亂（P＜0.01）（圖3B1，B2），提示糖尿病小鼠心肌肥厚形成。糖尿病小鼠持續(xù)高能量飲食4周后，模型組心肌細胞表面積和CVF進一步升高（P＜0.05）；給BEZ 25 mg·kg-1對上述變化無明顯影響；但75 mg·kg-1組心肌細胞表面積明顯減?。≒＜0.01），炎癥細胞浸潤減少，CVF明顯下降（P＜0.01）（圖3）。

Tab.2 Effect of BEZ on left ventricular hypertrophy index（LVHI），left ventricular-to-body mass ratio（LV/BM）and atrial natriuretic factor（ANF）mRNA expres?sion in diabetic cardiac hypertrophy mice

Fig.3 Effect of BEZ on myocardial morphological change in diabetic cardiac hypertrophy mice by HE staining（400×）（A）and Masson staining（400×）（B）.See Fig.1 for the mouse treatment.A2 and B2 was the semi-quantitative result of A1 and B1，respectively.CVF：collagen volume fraction.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with 4w-DM group；△△P＜0.01，compared with model group.

2.4 BEZ對糖尿病心肌肥厚小鼠左心室心肌組織CYP2J3蛋白表達和血清14，15-EET含量的影響

與正常對照組相比，糖尿病心肌肥厚模型組左心室CYP2J3的蛋白表達降低了66.7%（P＜0.01），血清 14，15-EET 含量降低了 47.1%（P＜0.01）。BEZ 25 mg·kg-1對CYP2J3蛋白表達和14，15-EET含量無明顯作用，但給予75 mg·kg-1后，CYP2J3蛋白和14，15-EET含量均較模型組明顯升高（P＜0.01）（圖4，表3）。

Fig.4 Effect of BEZ on cytochrome P450 epoxygen?ase2J3（CYP2J3）protein expression in left ventricule of diabetic cardiac hypertrophy mice by Western blotting.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

Tab.3 Effect of BEZ on serum 14，15-epoxyeicosatrie?noic acids（14，15-EET）level in diabetic cardiac hyper?trophy mice

3 討論

本研究結(jié)果顯示，BEZ在1/3臨床常用劑量（25 mg·kg-1）時，對糖尿病小鼠即有降低血糖和血脂作用；但只有在臨床相當(dāng)劑量（75 mg·kg-1）時，對已形成心肌肥厚糖尿病小鼠才有改善作用，同時，使CYP2J3蛋白表達上調(diào)，14，15-EET生成增加。

左心室肥大伴隨心肌重構(gòu)、心肌間充質(zhì)纖維化和心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)是糖尿病性心肌病左室舒張和收縮功能障礙的主要原因之一，與糖尿病患者后期心力衰竭、猝死的發(fā)生密切相關(guān)。心肌肥大在分子水平上表現(xiàn)為核內(nèi)基因表達的改變或重新激活，如胚胎基因ANF的再表達，促使心肌細胞蛋白合成增加并蓄積，最終導(dǎo)致心肌細胞體積增大，在病理結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為左心室室壁明顯增厚，肌纖維紊亂，炎癥細胞浸潤，心肌組織膠原纖維增多等［12］。高糖高脂膳食聯(lián)合多次ip給予小劑量STZ，小鼠FBG持續(xù)≥11.1 mmol·L-1，提示糖尿病形成。繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)4周，糖尿病小鼠LVHI、LV/BW升高；病理檢測顯示心肌細胞排列紊亂、表面積增加、膠原纖維含量增加；同時，心肌肥厚標(biāo)志性基因ANFmRNA表達增加。上述結(jié)果提示，糖尿病小鼠出現(xiàn)心肌肥厚，糖尿病心肌肥厚模型制備成功。

研究已證實，除降血脂作用外，BEZ還具有抗炎、抗糖尿病和心臟保護等作用［13-15］。動物實驗中，BEZ的劑量一般為600～800 mg·kg-1，約為臨床劑量的8～10倍［16-17］。BEZ在大劑量，甚至臨床劑量使用時會出現(xiàn)橫紋肌溶解的嚴重不良反應(yīng)，小劑量BEZ相對較安全。然而，相當(dāng)于臨床及低于臨床劑量的BEZ對糖尿病心肌肥厚作用的臨床前研究較少，相關(guān)數(shù)據(jù)較為缺乏。按成年人BEZ每日用藥量計算，本研究以75 mg·kg-1為相當(dāng)于臨床劑量、25 mg·kg-1為低于臨床劑量給藥。結(jié)果顯示，BEZ兩個劑量均使糖尿病小鼠的血糖和血脂水平明顯降低，一般狀況改善。但BEZ 25 mg·kg-1對心肌肥厚并發(fā)癥沒有明顯作用，75 mg·kg-1則明顯改善糖尿病小鼠心肌肥厚變化。該結(jié)果提示，BEZ在臨床常用劑量時對糖尿病小鼠的心肌肥厚即有改善作用，可避免使用過高劑量出現(xiàn)各種不良反應(yīng)，有利于對BEZ藥理作用進行更可靠、更安全的基礎(chǔ)實驗研究。另外，1/3臨床常用劑量BEZ也能一定程度降低血糖和血脂水平，但對心肌肥厚并發(fā)癥無明顯改善。

EET是重要的脂質(zhì)中介，來源于AA環(huán)氧合酶CYP2J代謝。EET對代謝性疾病，如動脈粥樣硬化、高血壓、心肌肥厚、糖尿病和非酒精性脂肪肝病等具有有益的作用［18］。CYP2J-EET對維持心血管的平衡具有重要的生物學(xué)意義［19］。然而，BEZ的作用與CYP2J-EET的關(guān)系目前未見報道。在小鼠局灶性腦缺血模型，14，15-EET通過PPARγ/p-cAMP-反應(yīng)原件結(jié)合蛋白信號通路，促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)生而保護缺血損傷的神經(jīng)［20］。Li等［21］研究發(fā)現(xiàn)，CYP2J2-EET可激活PPARγ，減輕肝組織炎癥，從而改善糖尿病小鼠的代謝紊亂及胰島素抵抗。這些結(jié)果提示，EET的作用可能與PPAR的激活有一定關(guān)聯(lián)。BEZ是一個PPAR泛激動劑，能同時激動PPARα，PPARβ和PPARγ 3種受體亞型。本研究結(jié)果顯示，糖尿病心肌肥厚模型小鼠左心室組織中CYP2J3蛋白表達下調(diào)，血清中14，15-EET的含量明顯減少，提示CYP2J3-EET功能障礙在小鼠糖尿病心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中可能有重要意義。而相當(dāng)于臨床劑量BEZ在改善糖尿病心肌肥厚的同時，也上調(diào)了CYP2J3的表達，使14，15-EET含量明顯增加，提示BEZ保護糖尿病心肌肥厚的作用可能與其影響CYP2J3-EET信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在相當(dāng)于臨床劑量下，BEZ具有改善糖尿病小鼠心肌肥厚的作用，其機制可能與BEZ上調(diào)CYP2J3表達、增加EET水平有關(guān)。但BEZ的作用是否有其他信號通路或機制參與，需要進行更多深入研究。