楊晗杰，劉各亮，劉波

0 引言

膀胱癌是泌尿生殖道惡性腫瘤，它對人類泌尿生殖系統(tǒng)的危害僅次于前列腺癌，是全球最常見的九大癌癥之一，每年因膀胱癌死亡的人數(shù)不斷上升，引起了人們的廣泛關(guān)注[1-2]。膀胱癌的大部分病例為非肌層浸潤性膀胱癌，其中大部分患者預(yù)后較好，但容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后甚至可能進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌[3-4]；而其余部分預(yù)后不良的病例中死亡率約占50%[5]。對于浸潤性膀胱癌的治療，標(biāo)準(zhǔn)的方法仍以根治手術(shù)切除膀胱為主，同時聯(lián)合化療[6]。對于不能耐受或不愿意接受根治手術(shù)的患者，可采用膀胱部分切除（電切至腫瘤周圍正常組織1.0 cm）聯(lián)合輔助化療的方法，它的優(yōu)點(diǎn)是膀胱的保留率較高，同時還避免了根治性膀胱切除術(shù)后的并發(fā)癥及對生活質(zhì)量的影響，但臨床分期、病理分級是決定預(yù)后的重要因素[7]。目前對于膀胱癌的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展與染色體異常、表觀遺傳學(xué)改變和遺傳多態(tài)性密切相關(guān)，其遺傳學(xué)改變與其治療及預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。大量研究已經(jīng)證明癌基因和腫瘤抑制因子的表達(dá)在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，在膀胱癌的早期檢測和預(yù)后中發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物[10-11]。

叉頭框O類（FoxO）轉(zhuǎn)錄因子屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的叉頭家族，其特征在于由4個成員即FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6組成的稱為“叉頭框”的保守DNA結(jié)構(gòu)域[12]。研究人員發(fā)現(xiàn)它們參與了細(xì)胞周期的調(diào)控、凋亡和對活性氧的抗性等多種細(xì)胞過程[13-15]。同時，也揭示了這些轉(zhuǎn)錄因子起到腫瘤抑制因子的作用，有利于干細(xì)胞的維持和壽命延長[16]。最新研究報道指出，在癌細(xì)胞凋亡過程中，circ-FoxO3被發(fā)現(xiàn)顯著增加，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[17]。有研究表明FoxO3在許多癌癥如乳腺癌和前列腺癌的發(fā)展中起著非常重要的作用[18-19]。因此，本研究旨在探討FoxO3表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

收集湘雅二醫(yī)院2011年1月—2013年1月期間，術(shù)后病理證實(shí)為膀胱癌患者的臨床資料及其癌組織及癌旁組織標(biāo)本111例，男79例，女32例。年齡36～79歲，平均年齡55.23±8.72歲。根據(jù)第7版AJCC癌癥TNM分期[20]，Tis～T1淺表性膀胱癌共63例，T2～T3非淺表性膀胱癌共48例。根據(jù)WHO2004分級法[21]，組織學(xué)分型低級別77例，高級別34例。局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，無淋巴結(jié)局部轉(zhuǎn)移者78例。全部111例膀胱癌組織作為實(shí)驗組，在患者術(shù)后，依據(jù)患者的病情及實(shí)際情況進(jìn)行相應(yīng)的輔助治療，分為根治性膀胱切除術(shù)8例，根治性膀胱切除術(shù)+GC方案（吉西他濱+順鉑）23例，電切手術(shù)+吉西他濱膀胱灌注63例，電切手術(shù)+MVAC方案（甲氨蝶呤+長春花堿+阿霉素+順鉑）10例，電切手術(shù)+CMV方案（順鉑、甲氨蝶呤和長春新堿）7例。同時取距腫瘤邊緣1～2 cm以上，經(jīng)病理證實(shí)為正常膀胱組織的111例癌旁正常組織作為對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)明確診斷為膀胱癌；（2）具有充分的影像學(xué)檢查和臨床檢查支持診斷；（3）出院后患者至少接受過一次隨訪或檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有其他腫瘤疾??；（2）接受治療前膀胱癌已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。本研究通過湘雅二醫(yī)院臨床試驗倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均對研究知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測FoxO3 mRNA含量

提取腫瘤及癌旁正常組織中總RNA?？俁NA提取試劑盒購買于北京天恩澤基因科技公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自杭州博日科技有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明。使用紫外分光光度計檢測提取后的各RNA樣本的OD260/280值，并計算RNA濃度，置-80℃保存?zhèn)溆?。?shí)時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）方法測定樣品中FoxO3 mRNA的含量。根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫公開的基因及miR BASE數(shù)據(jù)庫中的基因序列，使用Primer5.0引物設(shè)計軟件，通過上海生工公司合成引物。引物序列見表1。PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司，RT-qPCR儀器使用德國ABI公司7500型定量PCR儀。RT-qPCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30 s，然后按以下條件循環(huán)40次：變性95℃ 5 s，退火/延伸30 s。檢測結(jié)果以β-actin為內(nèi)參照，將目標(biāo)基因的Ct值與β-actin的Ct值作對比，計算各目的基因mRNA的相對表達(dá)量，ΔCt目標(biāo)=Ct目標(biāo)-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗組-ΔCt對照組，以2-ΔΔCt表示兩組目標(biāo)基因表達(dá)量的比值[22]。

表1 RT-qPCR引物序列Table1 Primer sequence of RT-qPCR

1.3 Western blot檢測FoxO3蛋白的相對含量

使用石蠟標(biāo)本提取蠟塊切片總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取50 μg總蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE恒壓電泳，半干法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，4℃封閉2 h，滴加一抗（兔FoxO3多克隆抗體購于Abcam公司），4℃條件下保存10 h，TBST洗4次，每次10 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG，Santa Cruz公司），37℃條件下孵育2 h，TBST洗10 min，4次，ECL試劑盒進(jìn)行顯色，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)自動成像并以β-actin為內(nèi)參分析FoxO3蛋白的相對含量。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

采用SP法檢測膀胱癌組織及癌旁正常組織中FoxO3蛋白的表達(dá)情況。選用已知正常膀胱組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，HistostainTMSP-9000免疫組織化學(xué)染色試劑盒（Zymed公司）染色。常規(guī)脫蠟至水的樣本石蠟切片，微波加熱修復(fù)抗原，至沸騰后停止加熱5 min，然后重復(fù)加熱一次，冷卻至常溫。切片經(jīng)過PBS沖洗后滴加正常山羊血清。滴加一抗（兔FoxO3多克隆抗體購于Abcam公司），4℃過夜。復(fù)溫并用PBS沖洗后，滴加二抗工作液（生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG），37℃下30 min。PBS沖洗后滴加辣根標(biāo)記工作液孵育，DAB顯色5～10 min，鏡下調(diào)整染色時間，蘇木精對比染色1 min后樹膠封片，拷片后拍照保存。鏡下隨機(jī)取10個視野，根據(jù)每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)，陽性染色細(xì)胞≤10%為陰性表達(dá)；＞10%為陽性表達(dá)。

1.5 隨訪

首先對所有患者采用電話隨訪的方式了解其存活情況，隨后對于仍存活的患者再采用門診隨訪。隨訪截至2017年10月。統(tǒng)計5年總生存期和無瘤生存時間?？偵嫫跒槭中g(shù)到死亡或最后隨訪時間，無瘤生存時間為手術(shù)至腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。根據(jù)隨訪結(jié)果繪制Kaplan-Meier（K-M）生存曲線，比較總生存率和無瘤生存率。所有患者均完成隨訪。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。服從正態(tài)分布的計量資料兩組之間的比較采用t檢驗和配對t檢驗。使用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較；方差不齊時則行使Welch法，通過Dunnetts’T3檢驗進(jìn)行組間多重比較。計數(shù)資料用χ2檢驗。預(yù)后的單因素分析采用Kaplan-Meier法，采用Log rank檢驗；預(yù)后的多因素分析采用Cox模型；相關(guān)分析采用Spearman等級法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

FoxO3蛋白主要集中表達(dá)于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)弱表達(dá)，呈棕黃色或棕褐色顆粒的陽性反應(yīng)，見圖1。FoxO3蛋白陽性表達(dá)率在膀胱癌組織中為32.4%，低于癌旁正常組織的72.1%（P＜0.05），見表2。

2.2 FoxO3基因的表達(dá)結(jié)果

與癌旁正常組織相比，膀胱癌組織中的FoxO3 mRNA及其蛋白的表達(dá)顯著下降（P＜0.0001），見圖2。

2.3 膀胱癌中FoxO3蛋白與臨床特征的相關(guān)性

圖1 免疫組織化學(xué)檢測癌旁正常(A)及膀胱癌組織(B)中FoxO3的表達(dá) (×200)Figure1 FoxO3 expression in adjacent normal tissues(A) and bladder cancer tissues(B) detected by immunohistochemical method (×200)

表2 膀胱癌和癌旁正常組織中FoxO3蛋白表達(dá)情況Table1 FoxO3 expression in bladder cancer tissues and adjacent tissues

圖2 RT-qPCR(A)及Western blot(B,C)檢測膀胱癌及癌旁組織中Foxo3表達(dá)結(jié)果Figure2 FoxO3 expression in bladder cancer tissues and adjacent tissues was detected by RT-qPCR(A) and Western blot(B,C) analysis

膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的FoxO3蛋白陽性率均顯著低于無轉(zhuǎn)移組（P=0.03）。TNM分期中，T2～T3浸潤性膀胱癌組的FoxO3蛋白陽性率均顯著低于Tis～T1淺表性膀胱癌組（P=0.0014）。WHO2004分級中，高級別組的FoxO3蛋白陽性率均顯著低于低級別組（P=0.0018）。不同性別、年齡的膀胱癌患者FoxO3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 膀胱癌中FoxO3表達(dá)與術(shù)后生存率的相關(guān)性

表3 膀胱癌中FoxO3蛋白與臨床特征的相關(guān)性Table3 Correlation of FoxO3 protein with clinical characteristics of bladder cancer patients

本組111例患者隨訪時間60月，失訪12例，死亡59例，總生存率為46.9%。局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移70例，總體無瘤生存率為36.9%。對FoxO3在膀胱癌中的表達(dá)進(jìn)行K-M分析顯示，膀胱癌組織中FoxO3陽性者總體生存率（P=0.005）和總體無瘤生存率（P＜0.001）均顯著高于FoxO3陰性者，見圖3。

圖3 FoxO3表達(dá)與術(shù)后總體生存率(A)和無瘤生存率(B)的關(guān)系Figure3 Correlation of FoxO3 expression with postoperative overall survival ratio(A) and tumor-free survival ratio(B)

2.5 膀胱癌預(yù)后的多因素分析

將患者性別、年齡、FoxO3表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、WHO分級、治療方法與預(yù)后的關(guān)系分別進(jìn)行比較，治療方法以手術(shù)治療和手術(shù)結(jié)合輔助治療分類，采用多因素Cox比例風(fēng)險模型分析后，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO3陰性表達(dá)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和WHO分期是患者預(yù)后不良的影響因素（均P＜0.05）。而年齡、性別、治療方法則與預(yù)后無關(guān)（均P＞0.05），見表4。

表4 膀胱癌患者的Cox比例回歸風(fēng)險模型 (n=111)Table4 Cox proportional regression risk model of patients with bladder cancer (n=111)

3 討論

在過去30年里，轉(zhuǎn)移性膀胱癌的治療并沒有取得重大的進(jìn)展。盡管膀胱切除術(shù)聯(lián)合新輔助化療與膀胱癌患者預(yù)后的改善相關(guān)，但后期患者的生存率依然較差[23]。因此，從分子水平的角度來解決這一疾病至關(guān)重要。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與鄰近的正常組織相比，膀胱癌組織中FoxO3的表達(dá)下降。眾所周知，F(xiàn)oxO家族受多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控，最重要的是PI3KPKB/c-Akt信號通路[24]。該途徑的直接磷酸化導(dǎo)致FoxO失活，膀胱癌也隨著通路的逐漸磷酸化而發(fā)展[25]。這可能是FoxO3基因在膀胱癌組織減少的一種方式。同時也有人指出，所有FoxO家族成員的廣泛體細(xì)胞缺失造成了進(jìn)行性癌癥傾向并且以血管瘤和胸腺淋巴瘤為特征的病癥，表明FoxO是腫瘤抑制劑[26]，這進(jìn)一步支持了我們的結(jié)果。

早期研究表明，F(xiàn)oxO3a陽性表達(dá)與乳腺癌臨床分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[27]。在結(jié)直腸癌中，研究人員發(fā)現(xiàn)FoxO3表達(dá)可能與腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和組織學(xué)分類有關(guān)，且FoxO3可能成為判定結(jié)直腸癌嚴(yán)重程度及預(yù)后效果的預(yù)測因子[28]。本研究也發(fā)現(xiàn)，浸潤性膀胱癌患者的FoxO3蛋白陽性率低于淺表性膀胱癌患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者FoxO3蛋白陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。所有原發(fā)性膀胱腫瘤中約90%來源于膀胱黏膜的移行細(xì)胞癌，然后逐漸侵入固有層，并轉(zhuǎn)移到固有肌層，周圍脂肪和鄰近的盆腔結(jié)構(gòu)中，并且發(fā)展伴隨著淋巴瘤發(fā)病率的增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨著腫瘤惡化入侵和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期，膀胱癌細(xì)胞中持續(xù)的Akt激活，通過下調(diào)大量的轉(zhuǎn)錄因子FoxO3促進(jìn)細(xì)胞分化和存活[25]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)FoxO3在膀胱癌組織中的陽性表達(dá)與患者中較高的OS率相關(guān)。通過誘導(dǎo)Fas配體，Bcl-2家族成員和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體等死亡受體配體的表達(dá)，活化的FoxO3蛋白很有可能增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，因此阻止膀胱癌的進(jìn)展[17]。

綜上所述，我們推測FoxO3的表達(dá)可能與膀胱癌的臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)。因此，F(xiàn)oxO3的表達(dá)可以作為膀胱癌的預(yù)后指標(biāo)。同時我們收集了來自根治性膀胱切除術(shù)、電子切除術(shù)以及根治性膀胱切除術(shù)、電子切除術(shù)與輔助化療相結(jié)合的幾種方法來源的病例樣本，經(jīng)Cox回歸分析后表明手術(shù)與手術(shù)結(jié)合輔助治療對患者的預(yù)后無明顯差異，猜測原因可能與樣本量較少、患者個體差異較大有關(guān)，因此這幾種治療方式對本研究患者的生存率分析影響無統(tǒng)計學(xué)意義，針對治療方法與預(yù)后的相關(guān)性，仍需要我們后期會進(jìn)一步研究更大的樣本數(shù)據(jù)，以期重點(diǎn)研究不同的治療方法對患者生存率的影響，同時結(jié)合FoxO3等相關(guān)蛋白分子的表達(dá)水平探討它們共同作用下對患者生成率的影響。