孫科，葉亮，劉細(xì)平，徐紹忠，李志東，祁江

0 引言

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，主要治療方法包括手術(shù)、放療和化療等，但總體療效不滿意，有必要探索新的治療策略。免疫治療旨在重新激活免疫系統(tǒng)，以消除癌細(xì)胞，是目前新的治療方案。有文獻(xiàn)報(bào)道多種惡性腫瘤細(xì)胞表面攜帶有促吞噬作用的鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin,CRT），其可發(fā)送信號(hào)招募巨噬細(xì)胞吞噬并消化癌細(xì)胞[1]；惡性腫瘤細(xì)胞還表達(dá)另外一種分子CD47，產(chǎn)生抑制性作用，能抵消CRT信號(hào)。本研究通過檢測(cè)胃癌組織中CRT和CD47的表達(dá)，分析兩者的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年6月—2015年5月在株洲市中心醫(yī)院普外一科行胃癌根治術(shù)的患者病理標(biāo)本50例，術(shù)前未接受放化療，所有資料均經(jīng)病理證實(shí)為胃癌；同時(shí)選取相對(duì)應(yīng)癌旁正常組織（安全界外1 cm）病理標(biāo)本作為對(duì)照。本組50例中，男28例、女22例，年齡45～81歲，平均年齡（60.5±14.2）歲。胃竇癌36例、胃體癌14例，均是胃腺癌。其中高分化14例、中分化16例、低分化20例。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer, AJCC）公布的胃癌TNM分期，T1期3例，T2期12例，T3期19例，T4期16例。術(shù)后隨訪36～57月。

1.2 檢測(cè)CRT、CD47蛋白的表達(dá)水平

胃癌及癌旁組織石蠟包埋標(biāo)本，均由我院兩位高年資病理醫(yī)師對(duì)標(biāo)本觀察，確認(rèn)并圈出組織芯的代表區(qū)域，對(duì)標(biāo)記部位蠟塊上取材、打孔，孔徑為2 mm，將胃癌組織、癌旁組織芯放入蠟塊孔內(nèi)，將每個(gè)蠟塊制作組織芯，50℃將蠟塊融合，行4 μm厚連續(xù)切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶法檢測(cè)胃癌組織中CRT、CD47蛋白的表達(dá)水平，CRT及CD47單克隆抗體均是美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，配制CRT抗體濃度1：1 400、CD47抗體濃度1：300。按說明書操作，蠟塊切片，脫蠟至水，將切片浸于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.0）中加熱煮沸2.5 min修復(fù)，冷卻，滴入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，15 min后水洗，置入磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡，分別滴入一抗（CRT、CD47抗體），滴入CD47抗體，-4℃孵育過夜，滴入CRT抗體不過夜，標(biāo)本用PBS浸泡，再滴二抗（酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聯(lián)合物，購自美國(guó)DAKO公司），放入37℃恒溫箱中孵育，經(jīng)DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。結(jié)果判斷：由本院兩位高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片、并評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400）下計(jì)數(shù)，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度劃分等級(jí)。（1）陽性細(xì)胞數(shù)＜1%為0分，1%～10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%為3分；（2）染色強(qiáng)度：陰性為0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強(qiáng)陽性3分。得分為（1）+（2），總分為0～6分，0分（-），1～2分（+），3～4分（++），5～6分（+++）。（-）～（+）是低表達(dá)，（++）～（+++）是高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有資料采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料率的比較用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存曲線分析CRT、CD47不同表達(dá)的胃癌患者術(shù)后3年生存率，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CRT、CD47在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)

CRT、CD47在胃癌組織及癌旁組織中均有陽性表達(dá)，CRT的陽性表達(dá)主要位于胞質(zhì)中，見圖1，細(xì)胞核及細(xì)胞膜中未見表達(dá)，鏡下陽性細(xì)胞呈棕黃色；CD47的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核、胞質(zhì)，見圖2，鏡下陽性細(xì)胞呈深黃色。

胃癌組織中CRT、CD47高表達(dá)率分別為68.0%（34/50）、56.0%（28/50）；癌旁組織中CRT、CD47高表達(dá)率分別為26.0%（13/50）、28.0%（14/50）。CRT、CD47在胃癌組織中的高表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001、0.005），見表1。

2.2 CRT、CD47在胃癌組織中的表達(dá)及與臨床參數(shù)關(guān)系

結(jié)果顯示CRT、CD47高表達(dá)者與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移及腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），見表2。

2.3 CRT、CD47不同表達(dá)組胃癌患者根治術(shù)后3年生存情況

圖1 CRT在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá) (SP ×400)Figure1 CRT expression in gastric cancer and adjacent normal tissues (SP ×400)

圖2 CD47在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá) (SP ×400)Figure2 CD47 expression in gastric cancer and adjacent normal tissues (SP ×400)

表1 CRT和CD47在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá)Table1 Expressions of CRT and CD47 in gastric cancer and adjacent normal tissues

表2 CRT、CD47在胃癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)關(guān)系 (例(%))Table2 Correlation between CRT, CD47 expression and clinicopathologic parameters of gastric cancer patients(n(%))

采用Kaplan-Meier繪制胃癌根治術(shù)后3年生存率曲線，顯示CRT、CD47高表達(dá)組較低表達(dá)組的生存時(shí)間短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039、0.043），見圖3。

圖3 不同CRT(A)、CD47(B)表達(dá)水平組胃癌根治術(shù)后3年生存率曲線Figure3 Three-year survival curves of gastric cancer patients with different expression levels of CRT(A) and CD47(B)

3 討論

鈣網(wǎng)蛋白（CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)中主要的Ca2+結(jié)合蛋白[1]，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。在腫瘤免疫監(jiān)視中，細(xì)胞膜表面CRT分子增多、聚集成簇，遞呈腫瘤抗原，表達(dá)一種“來吃我”的信號(hào)，招募巨噬細(xì)胞，啟動(dòng)吞噬、清除細(xì)胞[2]，是腫瘤免疫原性死亡的標(biāo)志[3]。CD47又稱整聯(lián)蛋白（integrin-associated protein），是表達(dá)在細(xì)胞膜表面的免疫球蛋白樣蛋白質(zhì)[4]，CD47與其配體信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α鏈結(jié)合后產(chǎn)生抑制抗性信號(hào)[5]，下調(diào)巨噬細(xì)胞吞噬作用，對(duì)固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，使腫瘤細(xì)胞逃避巨噬細(xì)胞的吞噬，表達(dá)“別吃我”信號(hào)[6]，抵抗CRT信號(hào)。CRT和CD47參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在胃癌細(xì)胞的凋亡和免疫逃逸中扮演重要角色。

CRT在胃癌中的表達(dá)及與胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚有爭(zhēng)議，多項(xiàng)研究報(bào)道胃癌中CRT呈高表達(dá)，曲晶磊等[7]報(bào)道胃癌組織中CRT陽性表達(dá)率為84.3%；王妍等[8]報(bào)道胃癌組織中CRT基因的表達(dá)量比癌旁組織上調(diào)3.70倍。腫瘤組織惡性程度越高，更多的CRT聚集，CRT蛋白表達(dá)上調(diào)，因此檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)往往CRT高表達(dá)的胃癌細(xì)胞，侵襲力更強(qiáng)，且與生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期呈正相關(guān)[9-10]。本研究胃癌組織中CRT高表達(dá)率為68%，高于癌旁組織的26%（P＜0.05），CRT高表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度正相關(guān)，顯示CRT高表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

與上述研究結(jié)論不同的是，黃紅麗等[11-12]報(bào)道CRT在胃腺癌細(xì)胞株中mRNA及蛋白質(zhì)水平均較正常胃黏膜上皮細(xì)胞下調(diào)，胃癌組織中CRT陽性表達(dá)率明顯低于正常胃組織。猜測(cè)可能的原因是CRT在胃癌免疫中仍有較多的機(jī)制不詳，如CRT主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞膜CRT蛋白聚集時(shí)才發(fā)出“來吃我”信號(hào)，CRT低表達(dá)水平是否受CRT胞內(nèi)釋放、膜轉(zhuǎn)移、重新分布等影響，細(xì)胞膜CRT蛋白聚集對(duì)CRT基因是否有負(fù)反饋調(diào)節(jié)，這些機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

腫瘤細(xì)胞膜表面出現(xiàn)大量CRT，如果伴隨CD47表達(dá)量明顯下降，可增強(qiáng)細(xì)胞被吞噬的效率[13]。而如果不伴有CD47表達(dá)下降，腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)CD47逃避巨噬細(xì)胞吞噬及細(xì)胞毒性作用[14]，腫瘤呈進(jìn)展態(tài)勢(shì)、惡性程度增高。甘波等[15]報(bào)道CD47在胃癌組織中表達(dá)率為51.85%，高于癌旁組織的36.84%（P＜0.05），CD47表達(dá)強(qiáng)度在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)更深的患者中表達(dá)更高。Sudo等[16]報(bào)道胃癌組織中CD47蛋白表達(dá)升高。Yoshida等[17]報(bào)道49.5%的胃癌細(xì)胞中CD47呈高表達(dá)；將胃癌細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CD47高表達(dá)的胃癌細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)的時(shí)間更長(zhǎng)，且形成的瘤體更大，具有較強(qiáng)的增殖能力。本研究檢測(cè)胃癌組織中CD47高表達(dá)率為56.0%，高于癌旁組織的28%（P＜0.05）。CD47高表達(dá)的胃癌分化程度低、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加，證實(shí)CD47在胃癌組織中呈高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

CRT、CD47在胃癌細(xì)胞凋亡和免疫逃逸中扮演重要角色，機(jī)體維持兩者的平衡，當(dāng)不平衡時(shí)，免疫監(jiān)視缺乏，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、發(fā)展。多數(shù)腫瘤細(xì)胞中CD47、CRT的表達(dá)常相伴進(jìn)行，以防護(hù)CRT介導(dǎo)的吞噬作用[18]，因此當(dāng)CD47高水平表達(dá)時(shí)，能抵抗CRT的促吞噬及免疫激活功能，從而允許雖有CRT表達(dá)的細(xì)胞不被吞噬并獲得額外的突變，最后轉(zhuǎn)化成惡性細(xì)胞。通過對(duì)CRT、CD47不同表達(dá)患者3年生存率曲線的分析，CRT、CD47高表達(dá)的胃癌病例相對(duì)于CRT、CD47低表達(dá)的病例生存時(shí)間更短，證實(shí)了CRT、CD47高表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)而降低生存率。

CRT、CD47在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨著以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的腫瘤免疫治療臨床研究迅速發(fā)展[19]，腫瘤免疫治療引領(lǐng)了腫瘤治療的新方向，胃癌的免疫治療是一個(gè)治療熱點(diǎn)，CD47、CRT是有潛在價(jià)值的標(biāo)志物[20]，可能為胃癌的早期診斷與免疫治療提供潛在靶點(diǎn)，是胃癌治療的新途徑。