孫科，葉亮，劉細平，徐紹忠，李志東，祁江

0 引言

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，主要治療方法包括手術(shù)、放療和化療等，但總體療效不滿意，有必要探索新的治療策略。免疫治療旨在重新激活免疫系統(tǒng)，以消除癌細胞，是目前新的治療方案。有文獻報道多種惡性腫瘤細胞表面攜帶有促吞噬作用的鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin,CRT），其可發(fā)送信號招募巨噬細胞吞噬并消化癌細胞[1]；惡性腫瘤細胞還表達另外一種分子CD47，產(chǎn)生抑制性作用，能抵消CRT信號。本研究通過檢測胃癌組織中CRT和CD47的表達，分析兩者的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年6月—2015年5月在株洲市中心醫(yī)院普外一科行胃癌根治術(shù)的患者病理標本50例，術(shù)前未接受放化療，所有資料均經(jīng)病理證實為胃癌；同時選取相對應癌旁正常組織（安全界外1 cm）病理標本作為對照。本組50例中，男28例、女22例，年齡45～81歲，平均年齡（60.5±14.2）歲。胃竇癌36例、胃體癌14例，均是胃腺癌。其中高分化14例、中分化16例、低分化20例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer, AJCC）公布的胃癌TNM分期，T1期3例，T2期12例，T3期19例，T4期16例。術(shù)后隨訪36～57月。

1.2 檢測CRT、CD47蛋白的表達水平

胃癌及癌旁組織石蠟包埋標本，均由我院兩位高年資病理醫(yī)師對標本觀察，確認并圈出組織芯的代表區(qū)域，對標記部位蠟塊上取材、打孔，孔徑為2 mm，將胃癌組織、癌旁組織芯放入蠟塊孔內(nèi)，將每個蠟塊制作組織芯，50℃將蠟塊融合，行4 μm厚連續(xù)切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶法檢測胃癌組織中CRT、CD47蛋白的表達水平，CRT及CD47單克隆抗體均是美國Abcam公司產(chǎn)品，根據(jù)預實驗情況，配制CRT抗體濃度1：1 400、CD47抗體濃度1：300。按說明書操作，蠟塊切片，脫蠟至水，將切片浸于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.0）中加熱煮沸2.5 min修復，冷卻，滴入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，15 min后水洗，置入磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡，分別滴入一抗（CRT、CD47抗體），滴入CD47抗體，-4℃孵育過夜，滴入CRT抗體不過夜，標本用PBS浸泡，再滴二抗（酶標羊抗鼠/兔IgG聯(lián)合物，購自美國DAKO公司），放入37℃恒溫箱中孵育，經(jīng)DAB顯色，蘇木精對比染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。結(jié)果判斷：由本院兩位高年資病理科醫(yī)師進行雙盲閱片、并評分，標準如下：每張切片隨機選取10個高倍視野（×400）下計數(shù)，根據(jù)陽性細胞數(shù)及染色強度劃分等級。（1）陽性細胞數(shù)＜1%為0分，1%～10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%為3分；（2）染色強度：陰性為0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強陽性3分。得分為（1）+（2），總分為0～6分，0分（-），1～2分（+），3～4分（++），5～6分（+++）。（-）～（+）是低表達，（++）～（+++）是高表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有資料采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料率的比較用χ2檢驗，Kaplan-Meier生存曲線分析CRT、CD47不同表達的胃癌患者術(shù)后3年生存率，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CRT、CD47在胃癌及癌旁組織中的表達

CRT、CD47在胃癌組織及癌旁組織中均有陽性表達，CRT的陽性表達主要位于胞質(zhì)中，見圖1，細胞核及細胞膜中未見表達，鏡下陽性細胞呈棕黃色；CD47的陽性表達主要位于細胞核、胞質(zhì)，見圖2，鏡下陽性細胞呈深黃色。

胃癌組織中CRT、CD47高表達率分別為68.0%（34/50）、56.0%（28/50）；癌旁組織中CRT、CD47高表達率分別為26.0%（13/50）、28.0%（14/50）。CRT、CD47在胃癌組織中的高表達率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001、0.005），見表1。

2.2 CRT、CD47在胃癌組織中的表達及與臨床參數(shù)關(guān)系

結(jié)果顯示CRT、CD47高表達者與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移及腫瘤浸潤深度有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），見表2。

2.3 CRT、CD47不同表達組胃癌患者根治術(shù)后3年生存情況

圖1 CRT在胃癌組織和癌旁組織中的表達 (SP ×400)Figure1 CRT expression in gastric cancer and adjacent normal tissues (SP ×400)

圖2 CD47在胃癌組織和癌旁組織中的表達 (SP ×400)Figure2 CD47 expression in gastric cancer and adjacent normal tissues (SP ×400)

表1 CRT和CD47在胃癌組織與癌旁組織中的表達Table1 Expressions of CRT and CD47 in gastric cancer and adjacent normal tissues

表2 CRT、CD47在胃癌組織中的表達及與臨床病理參數(shù)關(guān)系 (例(%))Table2 Correlation between CRT, CD47 expression and clinicopathologic parameters of gastric cancer patients(n(%))

采用Kaplan-Meier繪制胃癌根治術(shù)后3年生存率曲線，顯示CRT、CD47高表達組較低表達組的生存時間短，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.039、0.043），見圖3。

圖3 不同CRT(A)、CD47(B)表達水平組胃癌根治術(shù)后3年生存率曲線Figure3 Three-year survival curves of gastric cancer patients with different expression levels of CRT(A) and CD47(B)

3 討論

鈣網(wǎng)蛋白（CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)中主要的Ca2+結(jié)合蛋白[1]，廣泛存在于哺乳動物細胞中。在腫瘤免疫監(jiān)視中，細胞膜表面CRT分子增多、聚集成簇，遞呈腫瘤抗原，表達一種“來吃我”的信號，招募巨噬細胞，啟動吞噬、清除細胞[2]，是腫瘤免疫原性死亡的標志[3]。CD47又稱整聯(lián)蛋白（integrin-associated protein），是表達在細胞膜表面的免疫球蛋白樣蛋白質(zhì)[4]，CD47與其配體信號調(diào)節(jié)蛋白α鏈結(jié)合后產(chǎn)生抑制抗性信號[5]，下調(diào)巨噬細胞吞噬作用，對固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，使腫瘤細胞逃避巨噬細胞的吞噬，表達“別吃我”信號[6]，抵抗CRT信號。CRT和CD47參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在胃癌細胞的凋亡和免疫逃逸中扮演重要角色。

CRT在胃癌中的表達及與胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚有爭議，多項研究報道胃癌中CRT呈高表達，曲晶磊等[7]報道胃癌組織中CRT陽性表達率為84.3%；王妍等[8]報道胃癌組織中CRT基因的表達量比癌旁組織上調(diào)3.70倍。腫瘤組織惡性程度越高，更多的CRT聚集，CRT蛋白表達上調(diào)，因此檢驗發(fā)現(xiàn)往往CRT高表達的胃癌細胞，侵襲力更強，且與生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期呈正相關(guān)[9-10]。本研究胃癌組織中CRT高表達率為68%，高于癌旁組織的26%（P＜0.05），CRT高表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度正相關(guān)，顯示CRT高表達與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

與上述研究結(jié)論不同的是，黃紅麗等[11-12]報道CRT在胃腺癌細胞株中mRNA及蛋白質(zhì)水平均較正常胃黏膜上皮細胞下調(diào)，胃癌組織中CRT陽性表達率明顯低于正常胃組織。猜測可能的原因是CRT在胃癌免疫中仍有較多的機制不詳，如CRT主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞質(zhì)中，當細胞膜CRT蛋白聚集時才發(fā)出“來吃我”信號，CRT低表達水平是否受CRT胞內(nèi)釋放、膜轉(zhuǎn)移、重新分布等影響，細胞膜CRT蛋白聚集對CRT基因是否有負反饋調(diào)節(jié)，這些機制有待于進一步研究。

腫瘤細胞膜表面出現(xiàn)大量CRT，如果伴隨CD47表達量明顯下降，可增強細胞被吞噬的效率[13]。而如果不伴有CD47表達下降，腫瘤細胞通過高表達CD47逃避巨噬細胞吞噬及細胞毒性作用[14]，腫瘤呈進展態(tài)勢、惡性程度增高。甘波等[15]報道CD47在胃癌組織中表達率為51.85%，高于癌旁組織的36.84%（P＜0.05），CD47表達強度在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤更深的患者中表達更高。Sudo等[16]報道胃癌組織中CD47蛋白表達升高。Yoshida等[17]報道49.5%的胃癌細胞中CD47呈高表達；將胃癌細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CD47高表達的胃癌細胞持續(xù)生長的時間更長，且形成的瘤體更大，具有較強的增殖能力。本研究檢測胃癌組織中CD47高表達率為56.0%，高于癌旁組織的28%（P＜0.05）。CD47高表達的胃癌分化程度低、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加，證實CD47在胃癌組織中呈高表達，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

CRT、CD47在胃癌細胞凋亡和免疫逃逸中扮演重要角色，機體維持兩者的平衡，當不平衡時，免疫監(jiān)視缺乏，導致腫瘤細胞增殖、發(fā)展。多數(shù)腫瘤細胞中CD47、CRT的表達常相伴進行，以防護CRT介導的吞噬作用[18]，因此當CD47高水平表達時，能抵抗CRT的促吞噬及免疫激活功能，從而允許雖有CRT表達的細胞不被吞噬并獲得額外的突變，最后轉(zhuǎn)化成惡性細胞。通過對CRT、CD47不同表達患者3年生存率曲線的分析，CRT、CD47高表達的胃癌病例相對于CRT、CD47低表達的病例生存時間更短，證實了CRT、CD47高表達促進胃癌細胞發(fā)生、發(fā)展，進而降低生存率。

CRT、CD47在胃癌組織中的表達與胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨著以免疫檢查點抑制劑為代表的腫瘤免疫治療臨床研究迅速發(fā)展[19]，腫瘤免疫治療引領(lǐng)了腫瘤治療的新方向，胃癌的免疫治療是一個治療熱點，CD47、CRT是有潛在價值的標志物[20]，可能為胃癌的早期診斷與免疫治療提供潛在靶點，是胃癌治療的新途徑。