張紅，洛若愚，胡曉霞，陳歡，王琳琳

0 引言

宮頸癌是危害全世界婦女健康最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居女性生殖器官腫瘤第二位[1]。我們前期研究[2]顯示卵泡抑素樣蛋白（Follistatin-like protein, FSTL1）在宮頸癌組織中低表達(dá)，F(xiàn)STL1能抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移能力，然而FSTL1在宮頸癌中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究采用基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)FSTL1對(duì)下游基因及信號(hào)通路的影響，探討FSTL1在宮頸癌發(fā)生中的分子機(jī)制，為宮頸癌的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌細(xì)胞HeLa（HPV-18+）購自中科院上海細(xì)胞庫，用含有10%胎牛血清（Gibco, 澳大利亞）、1%10 000 u/ml青霉素和10 000 μg/ml鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）的RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco, 蘇州賽默飛世爾儀器有限公司）培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈貼壁生長。

1.2 FSTL1慢病毒感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選

FSTL1慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建和包裝。轉(zhuǎn)染前一天鋪2 ml密度為（3～5）×104個(gè)/毫升的細(xì)胞于6孔板中，待第二天細(xì)胞融合度達(dá)到20%～30%時(shí)，按照上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司的慢病毒使用操作手冊(cè)說明分別感染FSTL1慢病毒（實(shí)驗(yàn)組,Overexpression, OE）和陰性對(duì)照（對(duì)照組, Negative control, NC），8～12 h后換回正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后更換含有最佳篩選濃度的嘌呤霉素（1.0 μg/ml）完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，之后用低濃度的嘌呤霉素（0.8 μg/ml）壓力篩選2周后即為FSTL1穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.3 RNA提取和RT-qPCR

用TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）按說明書提取總RNA，經(jīng)37℃ 15 min，85℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄為cDNA（TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，RR047A，日本）。以GAPDH基因作為內(nèi)參， 參照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（FP205）說明書，經(jīng)95℃預(yù)變性15 min ，40個(gè)循環(huán)（95℃ 10 s 、60℃ 32 s）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析FSTL1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 芯片檢測

本實(shí)驗(yàn)基因芯片采用人全基因表達(dá)譜（Affymetrix GeneChip PrimeViewTMHuman Gene Expression Array）芯片，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司按照Affymetrix表達(dá)譜芯片檢測說明書進(jìn)行操作，通過RNA質(zhì)檢、純化、雜交、洗染、掃描及數(shù)據(jù)分析來篩選出差異表達(dá)基因。

1.5 差異基因的篩選及生物學(xué)信息分析

將樣本芯片數(shù)據(jù)歸一化及背景噪音過濾后，根據(jù)相同探針的表達(dá)差異倍數(shù)（Fold change）≥2和顯著差異水平進(jìn)行校正（FDR）＜0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)來篩選差異表達(dá)基因。運(yùn)用DAVID在線分析軟件的GO分類富集功能對(duì)FSTL1差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程（biological process, BP）、細(xì)胞組件（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）3 個(gè)方面進(jìn)行功能富集分類。運(yùn)用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫對(duì)FSTL1差異表達(dá)基因進(jìn)行經(jīng)典信號(hào)通路的富集分析，以P＜0.05為界，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路。

1.6 差異基因的驗(yàn)證

根據(jù)基因芯片結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)選取29個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。用TRIzol試劑（上海普飛生物技術(shù)有限公司）按說明書提取總RNA，經(jīng)42℃ 1 h，70℃ 10 min反轉(zhuǎn)錄為cDNA（Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒，M1705）。以GAPDH基因作為內(nèi)參，按照SYBR Master Mixture試劑盒說明書（TaKaRa, DRR041B），經(jīng)95℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)（95℃ 5 s 、60℃ 30 s）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果采用t檢驗(yàn)，用（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選

按照表達(dá)差異倍數(shù)（Fold change）≥2和顯著差異水平進(jìn)行校正（FDR）＜0.05的篩選條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組樣本的基因進(jìn)行數(shù)據(jù)的聚類分析。其中，每一列代表一個(gè)樣本，每一行代表一個(gè)差異基因；紅色表示基因的表達(dá)程度相對(duì)上調(diào)，綠色表示基因的表達(dá)程度相對(duì)下調(diào)，黑色表示基因的表達(dá)沒有顯著變化，見圖1。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組有593個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，288個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中上調(diào)最明顯的為FOS和EGR1，另外下調(diào)最明顯的為DAW1和GKN2，見表1。

2.2 FSTL1的差異表達(dá)基因的GO分類富集分析

利用DAVID在線分析軟件對(duì)FSTL1的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL1的上調(diào)差異表達(dá)基因的生物過程主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡、胚胎發(fā)育及對(duì)病毒的防御上，細(xì)胞組分富集于胞核、胞質(zhì)，細(xì)胞間黏附等上，分子功能富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白或核酸的結(jié)合等上，見表2。下調(diào)差異表達(dá)基因的生物過程主要富集在細(xì)胞增殖、凋亡、胰島素樣生長因子的調(diào)控以及缺氧應(yīng)激上，細(xì)胞組分富集于胞外、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等上，分子功能富集于胰島素樣生長因子結(jié)合、蛋白結(jié)合及細(xì)胞因子受體結(jié)合上，見表3。

圖1 HeLa細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因的聚類分析熱圖Figure1 Heat map of cluster analysis of up- and downregulated differentially-expressed genes in HeLa cells

2.3 FSTL1差異表達(dá)基因的信號(hào)通路富集分析

將FSTL1的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集分析。結(jié)果顯示，在數(shù)據(jù)庫 KEGG中FSTL1的差異表達(dá)基因共參與了42項(xiàng)經(jīng)典信號(hào)通路，其中，25條信號(hào)通路被激活，如癌癥轉(zhuǎn)錄誤調(diào)節(jié)信號(hào)通路（NFKBIZ、KDM6A、IL6、CEBPB、RXRA等基因）、絲裂源活化的蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路等；5條信號(hào)通路被抑制如癌癥轉(zhuǎn)錄誤調(diào)節(jié)信號(hào)通路（TRAF1、IGF1R、ID2、 ARNT2、MET等基因）、P53信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路等；另外12條信號(hào)通路差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

2.4 疾病和功能分析

表1 HeLa細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)前10位差異表達(dá)基因Table1 Top 10 up- or down-regulated differentiallyexpressed genes in HeLa cells

表2 FSTL1上調(diào)差異表達(dá)基因的GO分類富集分析Table2 Gene Ontology enrichment analysis of differentially-expressed genes up-regulated by FSTL1

基于GeneSet等關(guān)于疾病和功能的公共數(shù)據(jù)庫，利用IPA在線分析軟件對(duì)FSTL1差異表達(dá)基因進(jìn)行疾病與功能的富集，結(jié)果顯示，F(xiàn)STL1差異表達(dá)基因主要參與調(diào)節(jié)癌癥發(fā)生、機(jī)體的損傷和發(fā)育、胃腸道疾病和基因的表達(dá)等生物學(xué)過程，見圖2。

表3 FSTL1下調(diào)差異表達(dá)基因的GO分類富集分析Table3 Gene Ontology enrichment analysis of differentially-expressed genes down-regulated by FSTL1

表4 FSTL1下游差異表達(dá)基因的KEGG的信號(hào)通路富集分析中上調(diào)或下調(diào)的前五位Table4 Top 5 up- or down- regulated KEGG pathway enrichment analysis of differentially-expressed downstream genes of FSTL1 in HeLa cells

2.5 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

圖2 FSTL1的疾病與功能富集顯著性富集情況Figure2 Disease and functional enrichment analysis of FSTL1

基于芯片數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)的結(jié)果，我們共選擇29個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，29個(gè)基因在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果均與基因芯片結(jié)果趨勢一致，18個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào)，11個(gè)差異基因表達(dá)下調(diào)，其中4個(gè)差異基因無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明RT-PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果趨勢一致，見圖3。

3 討論

近來研究證實(shí)，F(xiàn)STL1與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。FSTL1是一種除外周淋巴細(xì)胞以外，幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞均有表達(dá)的分泌性糖蛋白，是富含半胱氨酸的分泌性酸性（SPARC）家族蛋白之一，但它的功能和生物學(xué)特性與SPARC家族蛋白有所不同[3]。FSTL1在多種腫瘤中異常表達(dá)，有研究報(bào)道，F(xiàn)STL1在乳腺癌[4]、肺癌、腎透明細(xì)胞癌[5]、鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)，而在食管鱗癌[6]、前列腺癌[7]、肝癌[8]中表達(dá)上調(diào)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)FSTL1在宮頸癌組織中低表達(dá)，并與宮頸癌細(xì)胞的遷移有關(guān)，然而FSTL1在宮頸癌中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究在宮頸癌HeLa細(xì)胞中過表達(dá)FSTL1，通過基因芯片技術(shù)共篩選出593個(gè)下游基因表達(dá)上調(diào)，288個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，其中上調(diào)最明顯的是FOS和EGR1，下調(diào)最明顯的是DAW1和GKN2。因此，我們猜測FSTL1可能通過影響對(duì)下游差異基因FOS、EGR1、DAW、GKN2等的表達(dá)參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

FSTL1在不同的疾病中發(fā)揮的作用及機(jī)制也不盡相同。研究不僅發(fā)現(xiàn)FSTL1可與細(xì)胞周期依賴蛋白激酶（cyclinB1）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）、細(xì)胞凋亡蛋白酶（Caspase-9）等多種酶或分子結(jié)合，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及周期[9]。研究還發(fā)現(xiàn)FSTL1可通過調(diào)節(jié)多種白介素及免疫細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用[10]。在腎透明細(xì)胞癌中，F(xiàn)STL1可以通過抑制細(xì)胞NF-κB和HIF-2α的表達(dá)而較少細(xì)胞凋亡[5]。在鼻咽癌中FSTL1可以通過上調(diào)NF-κB和下調(diào)JNK的表達(dá)來增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的抗原識(shí)別能力，增強(qiáng)鼻咽癌患者的固有免疫應(yīng)答能力[10]。然而FSTL1在宮頸癌中發(fā)揮的作用仍不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過基因芯片篩選轉(zhuǎn)染FSTL1后HeLa細(xì)胞中的下游基因的表達(dá)變化，通過對(duì)這些差異基因進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因參與的生物過程主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡、胚胎發(fā)育、病毒防御以及缺氧應(yīng)激、胰島素樣生長因子的調(diào)控上，細(xì)胞組分富集于胞核、胞質(zhì)，細(xì)胞間黏附、胞外、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等上，分子功能富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白或核酸的結(jié)合、胰島素樣生長因子結(jié)合及細(xì)胞因子受體結(jié)合等上。結(jié)合文獻(xiàn)，我們選取部分富集的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，F(xiàn)OS、EGR1、Bax、 Bcl-2、P53、Akt等基因表達(dá)上調(diào)，MMP-9、MET、LC3A等基因表達(dá)下調(diào)。因此，推測FSTL1可能通過調(diào)控這些富集的基因的表達(dá)，從而參與宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)過程。

圖3 RT-qPCR驗(yàn)證FSTL1下游差異表達(dá)基因情況Figure3 RT-qPCR verification of differentially-expressed downstream genes of FSTL1

FSTL1不僅能與蛋白激酶和細(xì)胞因子等相互作用，而且還參與多條信號(hào)通路調(diào)控不同的生物學(xué)活動(dòng)，尤其是在腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。有研究[11-14]顯示，Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/NF-κB、MAPK、TGF-β、IGF-1等信號(hào)通路參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。這些信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、惡變、周期和轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究證實(shí)，F(xiàn)STL1也參與調(diào)控NF-κB、MAPK、PI3K/AKT等信號(hào)通路[5,8,15-16]。本研究對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，差異基因共參與42項(xiàng)經(jīng)典信號(hào)通路。其中30條經(jīng)典信號(hào)通路有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），30條經(jīng)典信號(hào)通路中25條通路被激活，如癌癥轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路等；5條信號(hào)通路被抑制，如癌癥轉(zhuǎn)錄誤調(diào)節(jié)信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路等。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，我們選取以上信號(hào)通路中的部分基因進(jìn)行進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，Bax、Bcl-2、P53、Akt、MMP-9、ERK1、FOS、SOS等基因表達(dá)異常。因此，我們推測FSTL1在宮頸癌中作用機(jī)制可能通過調(diào)控PI3K/AKT/Bax/Bcl-2和P53信號(hào)通路來參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。對(duì)這些信號(hào)通路的深入研究有助于我們更好的理解宮頸癌的發(fā)生機(jī)制，為進(jìn)一步對(duì)宮頸癌的研究提供理論依據(jù)。