邵凱迪，王留興，陸士新,2

0 引言

中國食管癌發(fā)病率位于全球食管癌發(fā)病率的第7位，死亡率居全球食管癌死亡率第10位[1]。而我國食管癌約90%病例是鱗狀細(xì)胞癌[2]。目前食管癌的治療方法主要是手術(shù)、放療及化療。迄今為止，盡管有多種可用的治療選擇，但食管癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及其不良預(yù)后仍然是臨床醫(yī)學(xué)的難題。

自腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell, CSC）學(xué)說提出，眾多學(xué)者把對食管癌的研究方向轉(zhuǎn)到干細(xì)胞層面上來，以SP分選作為腫瘤干細(xì)胞的鑒定方式之一。Huang與Li等[3-4]用Hoechst 33342方法從食管癌細(xì)胞系和食管癌組織原代培養(yǎng)細(xì)胞中分離，鑒定出側(cè)群（side population, SP）與非側(cè)群（non-side population, NSP）細(xì)胞。SP細(xì)胞這群特殊的細(xì)胞具有高致瘤性、自我更新、多向分化、耐藥的潛能，這些特性與腫瘤干細(xì)胞十分相似[5-7]，因此SP分選漸漸成為研究腫瘤干細(xì)胞的重要方法，為進(jìn)一步研究腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)功能和分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

二甲雙胍（metformin, Metf）在臨床上廣泛用于Ⅱ型糖尿病的治療。對健康者的血糖并無明顯影響。近年來，Metf的抗腫瘤作用受到廣泛重視，因Metf對CSC具有抑制作用[8]。目前，Metf對食管癌CSCs的作用及機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，本文旨在研究二甲雙胍對食管鱗癌SP細(xì)胞干性的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE系列（30, 150, 180,410, 450, 510）、S1、TE1、Ec109細(xì)胞購自協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司。Hoechst 33342、鹽酸二甲雙胍購于美國Sigma-Aldrich公司。CCK-8試劑盒購于日本Dojindo化學(xué)公司。鼠抗β-actin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。兔抗SOX2、OCT4單克隆抗體購于美國Abcam公司。山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗購于北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞系均用RPMI 1640（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。食管癌細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，每2～3天用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）傳代一次.

1.3 SP細(xì)胞比例檢測及分選

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2遍，常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×106個細(xì)胞每毫升重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中（+2%FBS）。取1 ml重懸的液體，加入ABCG2抑制劑利血平，于37℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，然后加入終濃度為5 μg/ml的熒光染料Hoechst 33342，于37℃培養(yǎng)箱中避光孵育90 min，期間間斷振蕩混勻。孵育結(jié)束后，用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，離心收集，重懸于400 μl PBS中，用350 nm的紫外激光激發(fā)Hoechst 33342，用405/BP309（Hoechst藍(lán)）濾光片測量熒光發(fā)射。流式細(xì)胞儀檢測或分選。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 二甲雙胍對細(xì)胞系SP比例的作用

取處于對數(shù)生長期食管癌KYSE150細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，然后接種在6孔板中，待長到約6孔板面積的50%時，加入含不同濃度二甲雙胍的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)置3個平行孔；加入不同濃度二甲雙胍后24 h后常規(guī)消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，通過1.3步驟進(jìn)行SP細(xì)胞比例檢測。

1.5 使用CCK-8方法檢測不同濃度二甲雙胍對SP細(xì)胞增殖的影響

取分選的SP細(xì)胞，常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5 000個每孔接種于96孔板中過夜，第二天觀察細(xì)胞貼壁情況良好后，每孔加入含不同濃度的二甲雙胍培養(yǎng)基（終濃度分別為5、10、15、20 mmol/L），每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，以不加藥物的復(fù)孔為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后，加入配制好的CCK-8工作液，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，于酶標(biāo)儀中測定在450 nm處的吸光度（OD值）。吸光度（OD值）=實(shí)驗(yàn)組平均OD值-調(diào)零孔平均OD值。

1.6 二甲雙胍對SP細(xì)胞平克隆形成能力的影響

取分選的SP及NSP細(xì)胞，常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)，以300個每孔接種于6孔板，每孔加入含不同濃度的二甲雙胍以及10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，每個濃度設(shè)置3個平行孔，細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14天，至細(xì)胞克隆超過50個細(xì)胞時終止培養(yǎng)，無水甲醇溶液室溫固定10 min，結(jié)晶紫室溫染色20 min后流水沖洗染料，計(jì)數(shù)每孔克隆形成數(shù)?？寺⌒纬陕?每孔克隆形成數(shù)/每孔接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 二甲雙胍對SP細(xì)胞成球能力的作用

將分選后的細(xì)胞接種于6孔板中，加入不同濃度二甲雙胍后48 h后將細(xì)胞常規(guī)消化為單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔2 000個細(xì)胞，接種于低吸附6孔板中，每個濃度設(shè)置3個平行孔，加入3 ml無血清成球培養(yǎng)基，將6孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10天，拍照并統(tǒng)計(jì)。

1.8 二甲雙胍對SP細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響

取分選的SP細(xì)胞， PBS洗3次后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白的提取。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)TBST/5%脫脂奶粉室溫封閉后，依次孵育相應(yīng)的一抗和二抗，最后進(jìn)行顯色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，本研究應(yīng)用Studentttest等檢驗(yàn)方法，用GraphPad Prism 5.0軟件制圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系的SP比例

為了明確細(xì)胞系的SP比例，本實(shí)驗(yàn)共檢測9種食管鱗癌細(xì)胞系的SP比例，SP比例在0.2%～2%左右，且不同細(xì)胞系的SP比例不盡相同，見圖1。每種細(xì)胞系至少重復(fù)三次，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)KYSE150細(xì)胞SP比例較穩(wěn)定，遂對其進(jìn)行分選及以下實(shí)驗(yàn)。

2.2 二甲雙胍對SP比例的影響

KYSE150細(xì)胞通過不同濃度的二甲雙胍作用24 h后進(jìn)行SP檢測，發(fā)現(xiàn)對照組SP比例為（1.54±0.45）%，5 mmol/L二甲雙胍作用24 h后的SP比例為（1.02±0.39）%，10 mmol/L二甲雙胍作用24 h后SP比例降為（0.53±0.32）%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03和P=0.001）。由此可知二甲雙胍能降低SP的比例，且SP比例的下降程度與二甲雙胍濃度呈正相關(guān)性，見圖2。

2.3 不同濃度二甲雙胍對SP細(xì)胞增殖的影響

圖1 9種不同食管鱗癌細(xì)胞系的SP(side population)比例Figure1 SP radte of nine different esophageal squamous cell lines

圖2 不同濃度二甲雙胍對KYSE150 SP比例的影響Figure2 Effect of different concentrations of metformin on SP rate of KYSE150

分選后的SP細(xì)胞給予不同濃度二甲雙胍作用24或48 h后，通過CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖，5 mmol/L二甲雙胍處理SP細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖并未受到影響，其余實(shí)驗(yàn)組測得細(xì)胞增殖均受到不同程度抑制，且細(xì)胞的增殖抑制程度與二甲雙胍濃度及給藥時間呈顯著正相關(guān)性，見圖3。

圖3 不同濃度二甲雙胍對SP細(xì)胞增殖的影響Figure3 Effect of different concentrations of metformin on proliferation of SP cells

2.4 不同濃度二甲雙胍對SP細(xì)胞克隆形成能力的影響

14天后觀察分選后SP細(xì)胞的克隆形成情況，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞形成克隆較NSP細(xì)胞的克隆較大且多，0 mmol/L二甲雙胍SP細(xì)胞平均克隆數(shù)目為（122.2±10.31）個，NSP細(xì)胞平均克隆數(shù)目為（51.4±4.58）個，而在培養(yǎng)基中加入5 mmol/L二甲雙胍組均未見克隆長出，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），見圖4。

2.5 二甲雙胍對SP細(xì)胞成球能力的影響

食管癌KYSEl50經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理48 h后接種6孔板中，10天后結(jié)束培養(yǎng)并觀察拍照，SP細(xì)胞中0 mmol/L二甲雙胍組成球數(shù)目為（26.00±2.31）個，5 mmol/L二甲雙胍組成球數(shù)目為（9.67±1.20）個，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。NSP細(xì)胞中0 mmol/L二甲雙胍組成球數(shù)目為（9.00±1.16）個，5 mmol/L二甲雙胍組成球數(shù)目為（1.67±0.67）個，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），見圖5。

圖4 不同濃度二甲雙胍對SP、NSP細(xì)胞克隆形成能力的影響Figure4 Effect of different concentrations of metformin on clonality of SP and non-side population (NSP) cells

2.6 二甲雙胍對SP細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響

圖5 不同濃度二甲雙胍對SP、NSP細(xì)胞成球能力的影響Figure5 Effect of different concentrations of metformin on sphere-forming efficiency of SP and NSP cells

分選后的SP細(xì)胞經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理24 h后提取總蛋白，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因SOX2以及OCT4的表達(dá)均有不同程度的降低，見圖6。

圖6 不同濃度二甲雙胍對SP細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響Figure6 Effect of different concentrations of Metf on expression of related genes protein in SP cells

3 討論

我國食管癌患者就診時大多處于中晚期，無論是手術(shù)還是放化療，其臨床效果及預(yù)后均不能讓人滿意，甚至大多數(shù)患者在病理性完全緩解后早期出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國食管癌患者5年生存率約為20.9%[9]。盡管目前有一些新藥物包括靶向藥應(yīng)用于食管癌的治療，但對于絕大多數(shù)終末期食管癌患者來說，預(yù)后依然相對較差。放化療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍然是患者預(yù)后差的主要原因。

腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有無限分裂潛能、自我更新能力和固有化療耐藥性的一小部分細(xì)胞[10-11]，雖只占腫瘤細(xì)胞的很少部分，但卻有著強(qiáng)大的致瘤性、轉(zhuǎn)移性和放療抵抗性。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出很好地解釋了有關(guān)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥性等問題，并且提供了更多的腫瘤治療和臨床應(yīng)用思路，若能夠降低腫瘤干細(xì)胞的比例，將會在一定程度上降低患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，改善腫瘤患者的預(yù)后。

目前流行病學(xué)研究顯示Metf可以降低多種實(shí)體瘤的發(fā)生，范洪君等[12]以甲基芐基亞硝胺誘發(fā)大鼠食管癌，并用Metf治療，其結(jié)果顯示：Metf明顯抑制食管癌的發(fā)生。Li和Wang等[13-14]的研究證明Metf抑制食管癌細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)了食管癌對順鉑的敏感度。Honjo等[15]研究證明：因Metf靶向CSC和mTOR，所以Metf抑制食管癌細(xì)胞生長并且增強(qiáng)了食管癌細(xì)胞對5-Fu毒性敏感度。目前的研究支持以前的臨床觀察，即Metf用于臨床治療對食管癌患者有益，能夠補(bǔ)充其他治療，有效治療食管癌。

在本實(shí)驗(yàn)中測得的9種食管鱗癌細(xì)胞系的SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞比例在0.2%～2%左右，這個比例與世界文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值一致，結(jié)果表明：我們分離SP細(xì)胞的技術(shù)是科學(xué)的、可信的。SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞比例各不相同，這與其惡性程度有一定的關(guān)系[16-17]；同時放化療的長期應(yīng)用也可以富集SP細(xì)胞，因此SP/NSP的比例也可能與細(xì)胞系來源的患者是否經(jīng)過放化療有關(guān)。KYSE150來源為日本49歲女性低分化食管鱗癌，并經(jīng)過放療，這與其有著穩(wěn)定的SP/NSP比例有一定的關(guān)系。平板克隆形成是檢測單個腫瘤細(xì)胞增殖能力的簡單方法，能形成克隆的細(xì)胞必為能貼壁并具有增殖活力的細(xì)胞；成球?qū)嶒?yàn)反應(yīng)了細(xì)胞的干性，有許多實(shí)驗(yàn)研究，通過細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)來獲得干細(xì)胞[18-19]；SOX2及OCT4均為干細(xì)胞相關(guān)基因，對維持干細(xì)胞多向分化及自我更新能力有著非常重要的作用。Bao等[20]對胰腺癌的研究顯示二甲雙胍可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成及成球能力，并降低CD44、EpCAM、EZH2、Notch-1、Nanog及Oct4等干性相關(guān)基因的表達(dá)從而殺傷胰腺癌干細(xì)胞。Honjo等[15]對食管腺癌的相關(guān)研究，結(jié)果顯示二甲雙胍可以抑制食管腺癌干性相關(guān)基因的表達(dá)并且抑制PI3K/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增加氟尿嘧啶對食管腺癌干細(xì)胞的殺傷能力。

從本實(shí)驗(yàn)可看出，二甲雙胍可以降低KYSE150細(xì)胞系的SP數(shù)量，抑制分選的SP細(xì)胞的增殖、平板克隆形成、成球?qū)嶒?yàn)等，并能夠降低SOX2、OCT4等干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，并且隨著二甲雙胍濃度的增高，其降低效果更明顯。由此可知，二甲雙胍能夠在一定程度上降低食管癌細(xì)胞的干性，其可能也是通過降低干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)來殺傷干細(xì)胞，不過其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

二甲雙胍作為臨床上常用的治療2型糖尿病的藥物，其安全性及不良反應(yīng)已知、價格低廉，已有多篇文章報(bào)道其對不同腫瘤的抑制作用等，通過本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠殺傷腫瘤干細(xì)胞，在一定程度上降低腫瘤干細(xì)胞的比例，這可能為食管癌的臨床治療提供一個新的思路，為食管癌患者提供一個更有效的治療方法。