陸文斌，宮雪超， 金建華，胡文蔚，王月，張華

0 引言

近年，腫瘤免疫療法發(fā)展迅速，尤其以嵌合抗原受體（CAR）-T為代表的過繼性T細(xì)胞療法。其中，CD19-CAR T更以令人驚嘆的臨床治療效果獲得了FDA批準(zhǔn)[1]。在CAR改造T細(xì)胞所涉及的諸多重要環(huán)節(jié)中，選擇腫瘤細(xì)胞表面特異性靶點(diǎn)和獲取具有合適親和力的單鏈抗體基因是最重要的基礎(chǔ)要素[2]。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是大腸癌組織產(chǎn)生的一種糖蛋白，常作為胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌等腫瘤的標(biāo)志物，是多種免疫療法的消化道腫瘤特異性靶點(diǎn)[3-4]。CA19-9是唾液酸化lewis-a血型抗原，在胃腸道等多種癌癥診斷中都有一定價(jià)值。目前，已有較多靶向CA19-9以提高診斷靈敏度和特異性的研究，但以此為靶點(diǎn)構(gòu)建CAR-T細(xì)胞用于臨床治療的報(bào)道[5-6]不多。本研究擬利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建帶有人IgG1 Fc標(biāo)簽的抗CEA scFv和抗CA19-9 scFv真核表達(dá)載體。另外，為提高抗體表達(dá)效率，在anti-CEA scFv上游加入人IL-2信號(hào)肽，形成三個(gè)不同單鏈抗體融合基因；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，在HEK293細(xì)胞中表達(dá)三個(gè)抗體-Fc融合蛋白，并進(jìn)行表達(dá)檢測和親和力鑒定。以此獲得anti-CEA scFv和anti-CA19-9 scFv基因并驗(yàn)證兩種單鏈抗體親和力，為后續(xù)開展以CEA和CA19-9為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種E.coliBL21（DE3）和質(zhì)粒pET-32a（+）購自Novagen公司（美國）；Fc/pTT5為含有人IgG1 Fc段基因的pTT5載體，由本實(shí)驗(yàn)室保存。HEK293、SW480、CFPAC-1等細(xì)胞株均購自中科院上海細(xì)胞庫（中國）；EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、NcoⅠ等限制性內(nèi)切酶和Taq酶、T4連接酶等工具酶均購自NEB公司（美國）；rProtein-A FF親和層析柱購自GE公司（美國）；鼠抗人IgG Fc單克隆抗體、鼠抗人CEA單克隆抗體、鼠抗人CA19-9單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG H＆L多克隆抗體均購自Abcam公司（英國）；基因及引物合成由金唯智公司（中國）完成；合成后測序驗(yàn)證由生工生物工程（上海）股份有限公司（中國）完成。以下為anti-CEA scFv上下游引物（P1和P2）和anti-CA19-9 scFv上下游引物（P3和P4），兩端均引入酶切位點(diǎn)（5’-EcoRⅠ，3’-NcoⅠ）；hIL-2信號(hào)肽上游引物（P5）；hIL-2信號(hào)肽基因合成序列（5’端整合EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，3’端引入anti-CEA scFv 5’端重復(fù)序列）。P1：5’-AAGAATTCATGTCCTGGGTCAAAC-3’；P2：5’-AACCATGGGGCGGCCCTGGGCTCCA-3’；P3： 5’-AAGAATTCATGGCCCAGGTGAAGCT-3’；P4： 5’-AACCATGGTCTTTTAATCTCCAGCT-3’；P5： 5’-AAGAATTCATGAGTGGTTTTGGAGT-3’；hIL-2信號(hào)肽：5’-AGAATTCATG AGTGGTTTTT GGAGTCAGTA CATTCTCTTT TCAAATCCTT CTCTGCCCCT TACTGGCAAT TCCTGGGTCA AACAGGCT-3’。

1.2 方法

1.2.1 基因合成和pET32a（+）表達(dá)載體構(gòu)建 從GenBank獲取兩種單鏈抗體基因序列：抗CEA scFv（AB001737.1）和抗CA19-9 scFv（BD455083.1）；其中，AB001737.1為完整讀碼框；CA19-9 scFv（BD455083.1）需要?jiǎng)h除兩端多余密碼子，并在3’段加入終止子。對(duì)兩基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，加入酶切位點(diǎn)（5’-BamHⅠ和3’-XhoⅠ）并送基因公司做全基因合成?；蚝铣珊螅瑢⒑衋nti-CEA scFv/pET32a（+）和anti-CA19-9 scFv/pET32a（+）的兩種E.coliDH5α在肉湯培養(yǎng)基（LB）抗性平板（50 μg/ml氨芐西林）上進(jìn)行劃線接種，37℃培養(yǎng)過夜。挑取抗性平板上的陽性單菌落，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；提取質(zhì)粒，并經(jīng)雙酶切鑒定后，送基因公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.2 scFv/pET32a（+）轉(zhuǎn)化BL21和表達(dá) 經(jīng)測序驗(yàn)證，將純化后的陽性重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)E.coliBL21（DE3）中。LB抗性平板篩選后，挑選生長狀態(tài)良好的單菌落，接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基（50 μg/ml氨芐西林）中，37℃振蕩，培養(yǎng)過夜。次日，取對(duì)數(shù)生長期菌液轉(zhuǎn)接于大瓶培養(yǎng)液中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；加入誘導(dǎo)劑IPTG（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L），30℃誘導(dǎo)表達(dá)3 h。10 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，直接煮沸，上樣，SDS-PAGE電泳分析；以未誘導(dǎo)的菌體（0 mmol/L IPTG）作陰性對(duì)照，以未插入外源基因的空質(zhì)粒菌體為空白對(duì)照。

1.2.3 融合基因合成及pTT5表達(dá)載體構(gòu)建 以anti-CEA scFv/pET32a（+）為模板，以P1和P2為引物，使用PCR擴(kuò)增法刪除anti-CEA scFv基因末端終止子，并在基因兩端引入酶切位點(diǎn)，獲得anti-CEA scFv（-t）；循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次后72℃延伸10 min。利用同樣方法，以P3和P4為引物，以anti-CA19-9 scFv/pET32a（+）為模板，獲得anti-CA19-9 scFv（-t）。為進(jìn)一步探索提高抗體產(chǎn)量可能，使用重疊區(qū)基因擴(kuò)增法，在anti-CEA scFv（-t）基因5’端加入hIL-2信號(hào)肽基因；以P5和P2為引物，以IL-2信號(hào)肽（含重復(fù)區(qū)）和anti-CEA scFv（-t）為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建IL-2信號(hào)肽與anti-CEA scFv（-t）融合基因—IL2s-anti-CEA scFv（-t）；循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min ，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，循環(huán)30次后72℃延伸10 min。anti-CEA scFv（-t）、anti-CA19-9 scFv（-t）和IL2s-anti-CEA scFv（-t）三種基因擴(kuò)增產(chǎn)物使用EcoRⅠ和NcoⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用膠回收試劑盒純化抗體基因片段；并與同樣雙酶切的Fc/pTT5載體片段進(jìn)行連接（反應(yīng)體系T4Ligase和T4Ligase Buffer），16℃過夜。次日，將連接有抗體基因的載體分別導(dǎo)入感受態(tài)DH5α中，并將菌液涂布于LB抗性平板上（含有50 μg/ml氨芐西林），37℃培養(yǎng)過夜。16～24 h后，挑取陽性單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行酶切和測序鑒定。

1.2.4 不同scFv-Fc/pTT5在HEK293細(xì)胞中表達(dá) 在DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）中接種HEK293細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測G418篩選濃度和維持濃度。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，將HEK293細(xì)胞以4×105個(gè)/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中；細(xì)胞再生長至約70%～80%時(shí)，按說明書方法進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，并以未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞作為陰性對(duì)照。載體和脂質(zhì)體混合后，室溫孵育20 min，加入HEK293細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，G418（1 μg/ml）加壓篩選；48 h后，每天取5 ml培養(yǎng)物，離心收集細(xì)胞。超聲法破碎細(xì)胞，鏡檢破碎率，提取上清液和沉淀中的蛋白，SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 rProtein-A FF親和層析純化抗體融合蛋白 A液：20 mmol/L PBS（pH7.0），B液：0.1 mol/L甘氨酸（pH3.0），C液：1 mol/L Tris（pH8.0）。A液平衡rProtein-A FF層析柱，將含有anti-CEA scFv-Fc/pTT5和anti-CA19-9 scFv-Fc/pTT5的兩種細(xì)胞總蛋白粗提液分別上樣，用A液以相同流速洗脫至讀數(shù)穩(wěn)定，再用B液緩慢洗脫；同時(shí)，用C液以1/10接樣（以內(nèi)含0.5 ml C液的離心管接收流穿液）；最后，用甘氨酸（pH2.5）和C液交替洗脫層析柱，NaN3封柱。

1.2.6 Western blot法檢測抗體融合蛋白表達(dá) 取三個(gè)單鏈抗體融合基因轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后的培養(yǎng)液濃縮液、細(xì)胞破碎后上清液和沉淀中蛋白提取液、純化產(chǎn)物等各20 μl上樣，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，100 mA電流半干轉(zhuǎn)2 h；2% BSA室溫封閉2 h，棄掉封閉液，將硝酸纖維素膜置于干凈培養(yǎng)皿中，加入5 μg/ml鼠抗人IgG Fc單克隆抗體（anti-Human IgG Fc mAb），4℃保濕過夜；TBST洗3次，每次5～10 min，加入1：2 500稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG H＆L多克隆抗體，室溫放置1.5 h；TBST洗滌3次，每次5～10 min；DAB顯色。

1.2.7 基于細(xì)胞的競爭性ELISA檢測scFv親和力 收獲CEA陽性細(xì)胞（SW480）和CEA/CA19-9雙陽性細(xì)胞（CFPAC-1），計(jì)數(shù)；鋪裝于96孔板中（50 000個(gè)/孔），培養(yǎng)過夜。次日，移除培養(yǎng)基；用150 μl PBS和2% FBS洗滌。棄上清液，每孔加入150 μl 1nmol/L鼠抗人CA19-9 mAb稀釋液和鼠抗人CEA mAb稀釋液，室溫孵育1 h。棄上清液，洗滌（方法同前）；每孔加入150 μl不同濃度（濃度梯度：1～100 nmol/L）的anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc（待測抗體），室溫孵育1 h。棄上清液，洗滌；每孔加150 μl HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG H＆L多克隆抗體（1：10 000倍稀釋），室溫孵育1 h。棄上清液，洗滌；每孔加150 μl DAB顯色液，15 min后終止反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值。每個(gè)樣品重復(fù)3孔。根據(jù)吸光率制作飽和結(jié)合圖；評(píng)估解離常數(shù)（KD），確定能夠抵消50% CEA和CA19-9親本抗體的anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc用量。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

抗CEA scFv和抗CA19-9 scFv兩段基因經(jīng)編輯和基因合成后，被克隆到pET32a（+），并轉(zhuǎn)入DH5α中。在抗性平板中，隨機(jī)挑取5個(gè)單菌落，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切（BamHⅠ和XhoⅠ）鑒定；鑒定結(jié)果符合兩個(gè)單鏈抗體基因大小（anti-CEA scFv，708 bp；anti-CA19-9 scFv，735 bp）。將鑒定后的單鏈抗體-pET32a（+）重組質(zhì)粒送上海生工測序鑒定，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全吻合（圖略）。

2.2 抗體在原核細(xì)胞中的表達(dá)

測序驗(yàn)證后，將anti-CEA scFv/pET32a（+）和anti-CA19-9 scFv/pET32a（+）表達(dá)載體導(dǎo)入感受態(tài)E.coliBL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h后進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果見圖1～2，在40 kDa上方都有過表達(dá)條帶，與anti-CEA scFv（42.55 kDa）和anti-CA19-9 scFv（43.97 kDa）預(yù)測蛋白質(zhì)量相近；其中，anti-CEA scFv/pET32a（+）在1.0 mmol/L IPTG濃度下表達(dá)量最高。而anti-CA19-9 scFv/pET32a（+）則在0.4～0.6 mmol/L IPTG濃度下有較高表達(dá)。相反，陰性對(duì)照（0 mmol/L IPTG）在40 kDa上方并沒有過表達(dá)；而空白對(duì)照（pET32a）不僅在該處沒有過表達(dá)，18 kDa處還形成過表達(dá)（空載體表達(dá)蛋白）。據(jù)此判斷，在E.coliBL21（DE3）中，anti-CEA scFv和anti-CA19-9 scFv都存在過表達(dá)可能。

圖1 Anti-CEA scFv/pET32a(+)在E.coli BL21( DE3) 中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Figure1 Anti-CEA scFv/pET32a (+) expressed in E.coli BL21 (DE3) with IPTG

圖2 Anti-CA19-9 scFv/pET32a(+)在E.coli BL21( DE3) 中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Figure2 Anti-CA19-9 scFv/pET32a (+) expressed in E.coli BL21 (DE3) with IPTG

2.3 融合基因合成和pTT5載體構(gòu)建

anti-CEA scFv（-t）、anti-CA19-9 scFv（-t）和IL2s-anti-CEA scFv（-t）三種基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別與同樣經(jīng)EcoRⅠ和NcoⅠ雙酶切的Fc/pTT5質(zhì)粒連接后，分別導(dǎo)入DH5α中；經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定，證明三個(gè)單鏈抗體基因與Fc/pTT5正確連接，見圖3～5。

圖3 Anti-CA19-9 scFv-Fc/pTT5表達(dá)載體構(gòu)建及酶切鑒定Figure3 Construction of anti-CA19-9 scFv-Fc/pTT5 and identification of restriction enzyme

圖4 Anti-CEA scFv-Fc/pTT5表達(dá)載體構(gòu)建及酶切鑒定Figure4 Construction of anti-CEA scFv-Fc/pTT5 and identification of restriction enzyme

圖5 IL2s-anti-CEA scFv-Fc/pTT5表達(dá)載體構(gòu)建及酶切鑒定Figure5 Construction of IL2s-anti-CEA scFv-Fc/pTT5 and identification of restriction enzyme

2.4 HEK293中表達(dá)、純化及鑒定

anti-CEA scFv（-t）-Fc/pTT5、anti-CA19-9 scFv（-t）-Fc/pTT5和IL2s-anti-CEA scFv（-t）-Fc/pTT5轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，G418加壓篩選。轉(zhuǎn)染48 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、細(xì)胞破碎后上清液和沉淀、純化和鑒定。Western blot檢測結(jié)果顯示，anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc在細(xì)胞沉淀中有表達(dá)條帶，在細(xì)胞上清液中沒有表達(dá)條帶；無論是培養(yǎng)液中還是細(xì)胞上清液和沉淀中都未見帶有IL-2信號(hào)肽基因的IL2s-anti-CEA scFv-Fc表達(dá)條帶。在轉(zhuǎn)染72 h后，除能看到anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc在細(xì)胞沉淀中的表達(dá)條帶，IL2s-anti-CEA scFv-Fc在細(xì)胞上清液和沉淀中也出現(xiàn)表達(dá)條帶；其中，anti-CEA scFv-Fc經(jīng)rProtein-A FF柱子純化后能在Western blot檢測中顯示清晰條帶。所有條帶大小與三種抗體融合蛋白預(yù)測分子質(zhì)量相當(dāng)（anti-CEA scFv-Fc，50.5 kDa；anti-CA19-9 scFv-Fc，51.9 kDa；IL2s-anti-CEA scFv-Fc，52.6 kDa），見圖6～7。

2.5 基于細(xì)胞的競爭性ELISA檢測scFv親和力

圖6 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染scFv-Fc/pTT5 48h后HEK293細(xì)胞Figure6 HEK293 cells detected by Western blot after transfection of scFv-Fc/pTT5 for 48h

圖7 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染scFv-Fc/pTT5 72h后的HEK293細(xì)胞Figure7 HEK293 cells detected by Western blot after transfection of scFv-Fc/pTT5 for 72h

通過競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，與完整單克隆抗體相比較，確定兩種單鏈抗體anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc相對(duì)親和力。對(duì)每個(gè)樣品吸光度值進(jìn)行平均，并繪制飽和結(jié)合圖。經(jīng)過ELISA測定和飽和結(jié)合曲線圖分析，anti-CA19-9 scFv-Fc相對(duì)親和力約為6 nmol/L，anti-CEA scFv-Fc相對(duì)親和力約為8.2 nmol/L，見圖8～9。

圖8 Anti-CA19-9 scFv-Fc相對(duì)親和力（與鼠抗人CA19-9單克隆抗體對(duì)比）Figure8 Relative binding affinity of anti-CA19-9 scFv-Fc,compared with anti-human CA19-9 mAb

圖9 Anti-CEA scFv-Fc相對(duì)親和力（與鼠抗人CEA單克隆抗體對(duì)比）Figure9 Relative binding affinity of the anti-CEA scFv-Fc,compared with anti-human CEA mAb

3 討論

雖然CAR-T在急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋML）等癌癥治療方面取得巨大突破，但治療實(shí)體瘤（如胃腸癌、胰腺癌等）還面臨諸多挑戰(zhàn)[7-8]。主要困難之一就是實(shí)體瘤沒有像B細(xì)胞血液腫瘤CD19那樣的特異性標(biāo)志物[9]。CEA是目前研究最深入的腫瘤標(biāo)志物之一；在多種內(nèi)胚層組織、上皮性組織起源細(xì)胞及相關(guān)疾病中均有表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞免疫逃避及擴(kuò)散/轉(zhuǎn)移中都具有重要作用；在結(jié)直腸癌中表達(dá)最高（60%～90%）[10]，已被廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌的診斷及靶向治療。人CEA基因家族位于19號(hào)染色體q13.2區(qū)，共29個(gè)基因，其中CEACAM5（CEA, CD66e）通過糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidylinositol, GPI）連接于細(xì)胞膜[11]。CA19-9是一種類黏膜蛋白形式的糖蛋白，也是多種癌癥檢測的重要參考指標(biāo)之一。CA19-9對(duì)于胰腺癌的特異性為90%，敏感度為81%；被認(rèn)為是胰腺癌中最具價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物[12]。CEA和CA19-9都是位于腫瘤細(xì)胞表面的抗原物質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可與單克隆抗體結(jié)合，非常適合作為腫瘤免疫治療靶標(biāo)[13-15]。通過基因工程技術(shù)，我們構(gòu)建了靶向CEACAM5和CA19-9的單鏈抗體融合蛋白（scFv-Fc）真核表達(dá)載體。為提高抗體表達(dá)效率和便于檢測其表達(dá)，通過重疊區(qū)基因擴(kuò)增法[16-18]和亞克隆技術(shù)向抗CEA scFv和抗CA19-9 scFv下游引入hIgG1 Fc基因，并在抗CEA scFv上游增加人IL-2信號(hào)肽，獲得3個(gè)單鏈抗體融合蛋白的表達(dá)載體anti-CEA scFv-Fc、IL2s-anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc；將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過Western blot等證明，三個(gè)抗體均可以通過Fc段抗體融合技術(shù)在HEK293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)；但培養(yǎng)基中未檢測到IL2s-anti-CEA scFv-Fc，表明沒有產(chǎn)生分泌型anti-CEA scFv?？紤]到IL2s-anti-CEA scFv-Fc在細(xì)胞上清和沉淀中均有表達(dá)，可以確定IL2信號(hào)肽沒有發(fā)揮作用，具體原因有待下一步研究確定。從結(jié)果分析來看，三個(gè)抗體在細(xì)胞中表達(dá)效率仍然不高。為明確抗CEA scFv和抗CA19-9 scFv的親和力及識(shí)別腫瘤細(xì)胞的陽性結(jié)合率，通過競爭性細(xì)胞ELISA檢測兩種抗體對(duì)CEA陽性細(xì)胞（SW480）和CEA/CA19-9雙陽性細(xì)胞（CFPAC-1）進(jìn)行競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，證實(shí)兩種抗體可以與腫瘤細(xì)胞表面抗原CEA和CA19-9特異性結(jié)合。通過抗CEA單鏈抗體和抗CA19-9單鏈抗體在HEK293細(xì)胞中表達(dá)，我們獲取了抗體基因的優(yōu)化序列，并對(duì)抗體識(shí)別抗原的能力進(jìn)行了研究，證實(shí)兩種單鏈抗體能夠較好的識(shí)別結(jié)直腸癌等消化道腫瘤細(xì)胞表面抗原，為后續(xù)研究腫瘤特異性抗體藥物和改造T細(xì)胞進(jìn)行過繼性免疫治療奠定了基礎(chǔ)。