余長云，劉勇，曹華

0 引言

鼻咽癌為東南亞及我國南部地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，每年約有80 000新發(fā)病例[1]。放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，對早期患者效果較好，五年生存率可達(dá)90%以上；但對于晚期患者效果并不理想。目前認(rèn)為，放化療結(jié)合的綜合治療是鼻咽癌的重要治療手段，化療在中晚期或復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移患者的治療中起著非常重要的作用[2-4]。然而化療耐藥的產(chǎn)生嚴(yán)重制約了鼻咽癌患者的最終治療效果。因此，闡明鼻咽癌化療耐藥的分子機(jī)制，并采取有效措施預(yù)防和抑制鼻咽癌化療耐藥，對提高患者的總體治療效果具有重要意義。

異黏蛋白（metadherin, MTDH）作為癌基因在乳腺癌、肝癌和肺癌等多種實(shí)體瘤中異常表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MTDH在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（簡稱頭頸鱗癌）組織中高表達(dá)，能通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和腫瘤血管新生促進(jìn)頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移，與患者預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)[6-7]。然而，目前有關(guān)MTDH在頭頸鱗癌化療耐藥中的作用報(bào)道尚少。因此，本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上探討MTDH對鼻咽癌細(xì)胞增殖及紫杉醇耐藥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、HNE-1均購自北納創(chuàng)聯(lián)生物公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，特級胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，0.25%胰蛋白酶消化液（含乙二胺四乙酸）、雙抗（青霉素-鏈霉素）均購自美國Gibco公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，MTDH過表達(dá)慢病毒顆粒、MTDH沉默慢病毒顆粒及對照慢病毒顆粒均由河南九睿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，嘌呤霉素購自美國Santa Cruz公司，Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，兔抗人MTDH多克隆抗體購自美國Proteintech Group公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細(xì)胞5-8F、HNE-1均在37?C、5%CO2及飽和濕度條件下，用含有10%特級胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，常規(guī)0.25%胰蛋白酶消化傳代。所有實(shí)驗(yàn)均選用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將狀態(tài)良好的5-8F、HNE-1細(xì)胞按約2×105個/孔接種于6孔板中，用無抗生素細(xì)胞培基培養(yǎng)24 h，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合率達(dá)80%～85%。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行，感染復(fù)數(shù)MOI=10。轉(zhuǎn)染后24 h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入4 μg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行篩選2周后，Western blot檢測MTDH過表達(dá)和沉默效果，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為親本細(xì)胞組、MTDH過表達(dá)組、MTDH沉默組及陰性對照組。

1.2.3 Western blot提取各組細(xì)胞總蛋白 采用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid, BCA）測定細(xì)胞總蛋白濃度。取50 μg總蛋白進(jìn)行變性處理，進(jìn)行10%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳。蛋白電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h。加入兔抗人MTDH多克隆抗體（1：800）、小鼠抗人β-actin抗體（1：1000）于4?C下孵育過夜。洗膜后，于辣根過氧化抗兔二抗（1：3000）、辣根過氧化抗小鼠二抗（1：1000）室溫下孵育1 h。洗膜后，經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 分別將5-8F、HNE-1 MTDH過表達(dá)細(xì)胞、MTDH沉默細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞按1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設(shè)5個復(fù)孔，共培養(yǎng)5天。分別于培養(yǎng)第1d、2d、3d、4d和5d時向每孔加入10 μl CCK-8測定液，2 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長吸光度值（OD）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞周期及凋亡 分別將5-8F、HNE-1 MTDH過表達(dá)細(xì)胞、MTDH沉默細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞接種于六孔板中，每孔約1×106個細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。胰酶消化制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，以PBS溶液重懸、1 000 r/min離心5 min、去上清液，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次后棄去上清液，每組細(xì)胞加入1 ml 70%乙醇重懸固定細(xì)胞，18 h后行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。同法，收集各組細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC和PI雙染色，1 h內(nèi)行流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.6 CCK-8法檢測紫杉醇對5-8F、HNE-1細(xì)胞的30%抑制濃度（IC30）、50%抑制濃度（IC50）、70%抑制濃度（IC70） 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整5-8F細(xì)胞數(shù)為1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml；過夜貼壁后向各孔中加入不同濃度紫杉醇100 ml（紫杉醇終濃度分別為0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5和25 nmol/L），同時設(shè)置只含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的空白組，每組設(shè)3個復(fù)孔；培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8測定液，2 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長吸光度值（OD）。計(jì)算各濃度的抑制率，并算出紫杉醇對5-8F細(xì)胞的IC30、IC50、IC70濃度。生長抑制率=（OD對照組平均值-OD實(shí)驗(yàn)組平均值）/（OD對照組平均值-OD空白組平均值）×100%。紫杉醇對HNE-1細(xì)胞的IC30、IC50、IC70檢測時加入的紫杉醇終濃度分別為0、0.1、1、5、10、20和50 nmol/L，其余步驟同5-8F細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.7 CCK-8法檢測細(xì)胞生存率 分別將5-8F MTDH過表達(dá)細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞、HNE-1 MTDH過表達(dá)細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設(shè)5個復(fù)孔；過夜貼壁后向各孔中加入含IC50、IC70濃度紫杉醇的細(xì)胞培養(yǎng)基100 ml，48 h后CCK-8法檢測細(xì)胞生存率。分別將5-8F MTDH沉默細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞、HNE-1 MTDH沉默細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設(shè)5個復(fù)孔；過夜貼壁后向各孔中加入含IC30、IC50濃度紫杉醇的細(xì)胞培養(yǎng)基100 ml，48 h后CCK-8法檢測細(xì)胞生存率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用多樣本均數(shù)的方差分析進(jìn)行多個樣本均數(shù)的比較，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本均數(shù)的比較。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立穩(wěn)定高表達(dá)和沉默MTDH的鼻咽癌細(xì)胞株

Western blot結(jié)果顯示5-8F、HNE-1過表達(dá)組細(xì)胞MTDH表達(dá)量分別是對照組的4.6倍、2.77倍；1號干擾序列在5-8F、HNE-1中沉默效率均達(dá)80%以上，見圖1～2。以上結(jié)果表明，MTDH穩(wěn)定高表達(dá)和沉默的細(xì)胞株構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 MTDH對鼻咽癌細(xì)胞生長增殖能力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，MTDH過表達(dá)后5-8F、HNE-1細(xì)胞在培養(yǎng)3、4、5 d時的OD值均大于對照組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；然而，沉默MTDH表達(dá)后，5-8F、HNE-1細(xì)胞在培養(yǎng)3、4、5 d時的OD值均小于對照組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。這些表明，MTDH上調(diào)可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長增殖，MTDH下調(diào)抑制鼻咽癌細(xì)胞生長增殖。

2.3 MTDH對鼻咽癌細(xì)胞周期的影響

圖1 轉(zhuǎn)染MTDH cDNA和MTDH-shRNA后5-8F細(xì)胞中MTDH蛋白相對表達(dá)情況Figure1 The expression of MTDH protein in 5-8F cells transfected with MTDH cDNA and MTDH-shRNA

圖2 轉(zhuǎn)染MTDH cDNA和MTDH-shRNA后HNE-1細(xì)胞中MTDH蛋白表達(dá)情況Figure2 The expression of MTDH protein in HNE-1 cells transfected with MTDH cDNA and MTDH-shRNA

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MTDH沉默組的G1期細(xì)胞比例（5-8F：（55.813±2.521）%，HNE-1：（55.117±1.495）%）較對照組（5-8F：（37.330±0.325）%, HNE-1：（48.487±0.781）%）明顯增加，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=-18.694,P=0.000；HNE-1：t=-6.807,P=0.002）；而MTDH沉默組S期細(xì)胞比例（5-8F：（34.753±2.626）%，HNE-1：（23.543±2.251）%）與對照組（5-8F：（35.127±2.072）%，HNE-1：（20.683±2.634）%）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=0.193,P=0.856;HNE-1：t=-1.430,P=0.226）；MTDH沉默組G2/M期細(xì)胞比例（5-8F：（8.727±4.873）%, HNE-1：（23.277±4.093）%）較對照細(xì)胞組（5-8F：（25.630±1.470）%, HNE-1：（31.060±2.037）%）明顯減少，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=5.752,P=0.005; HNE-1：t=2.949,P=0.042），見圖4。

圖3 MTDH對5-8F細(xì)胞(A)、HNE-1細(xì)胞(B)增殖能力的影響Figure3 Effects of MTDH on proliferation of 5-8F(A) and HNE-1(B) cells

圖4 MTDH對5-8F、HNE-1細(xì)胞周期的影響Figure4 Effect of MTDH on cell cycle of 5-8F and HNE-1 cells

2.4 MTDH對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MTDH過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率（5-8F： （1.243±0.266）%, HNE-1： （5.590±0.387）%）較對照組細(xì)胞凋亡率（5-8F：（3.293±1.243）%, HNE-1： （6.617±0.431）%）降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=4.118,P=0.015；HNE-1：t=3.067,P=0.037），見圖5A。MTDH沉默組細(xì)胞凋亡率（5-8F：（6.737±0.735）%, HNE-1：（11.910±1.102）%）較對照組細(xì)胞凋亡率（5-8F：（3.293±1.243）%, HNE-1：（6.617±0.431）%）增高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=-4.005,P=0.016; HNE-1：t=-7.744,P=0.001），見圖5B。

圖5 MTDH過表達(dá)(A)及沉默(B)后對5-8F、HNE-1細(xì)胞凋亡的影響Figure5 Effects of MTDH overexpression(A) and silence(B) on apoptosis of 5-8F and HNE-1 cells

2.5 上調(diào)MTDH降低鼻咽癌細(xì)胞對紫杉醇敏感度

根據(jù)CCK-8結(jié)果確定，紫杉醇對5-8F的IC30、IC50、IC70分別為2.947、5.875、8.802 nmol/L，紫杉醇對HNE-1的IC30、IC50、IC70分別為2.077、6.768、22.052 nmol/L。分別用IC50、IC70濃度的紫杉醇作用于MTDH過表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞及對照細(xì)胞，48 h后CCK-8法檢測細(xì)胞生存率。結(jié)果顯示：MTDH表達(dá)上調(diào)之后，鼻咽癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感度降低，在IC70濃度下，MTDH過表達(dá)組細(xì)胞的生存率（5-8F： 41.05±5.47, HNE-1：44.37±2.07）高于對照組細(xì)胞（5-8F： 28.94±3.24, HNE-1： 30.16±3.56），兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=-4.261,P=0.003; HNE-1：t=-7.727,P=0.000）；在IC50濃度下，MTDH過表達(dá)組細(xì)胞的生存率（5-8F： 61.36±6.51, HNE-1：64.17±3.26）亦高于對照組細(xì)胞（5-8F： 50.16±2.39, HNE-1： 54.98±3.15），兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=-3.610，P=0.007; HNE-1：t=-4.538,P=0.002），見圖6。

圖6 上調(diào)MTDH降低鼻咽癌細(xì)胞5-8F(A)、HNE-1(B)對紫杉醇敏感度Figure6 MTDH overexpression decreased sensitivity of NPC 5-8F(A) and HNE-1(B) cells to paclitaxel

2.6 下調(diào)MTDH提高鼻咽癌細(xì)胞對紫杉醇敏感度

分別用IC30、IC50濃度的紫杉醇作用于MTDH沉默組鼻咽癌細(xì)胞及對照細(xì)胞，48 h后CCK-8法檢測細(xì)胞生存率。結(jié)果顯示：沉默MTDH表達(dá)之后，鼻咽癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感度升高，在IC50濃度下，MTDH沉默組細(xì)胞的生存率（5-8F： 30.70±1.73, HNE-1： 44.99±3.16）低于對照組細(xì)胞（5-8F：50.16±2.39, HNE-1： 54.98±3.15），兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=14.757,P=0.000; HNE-1：t=5.008,P=0.001）；在IC30濃度下，MTDH沉默組細(xì)胞的生存率（5-8F： 62.56±5.14, HNE-1： 63.36±3.51）亦低于對照組細(xì)胞（5-8F： 73.78±2.76,HNE-1： 72.95±2.94），兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5-8F：t=4.297,P=0.003; HNE-1：t=-4.681,P=0.002），見圖7。

3 討論

紫杉醇作為鼻咽癌化療的一線藥物，其臨床效果得到一致認(rèn)可。然而，細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重制約了其最終治療效果。因此，闡明紫杉醇耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，尋找紫杉醇耐藥密切相關(guān)的分子標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)，有望改善鼻咽癌患者的臨床治療效果。近年來，盡管紫杉醇耐藥的相關(guān)性研究取得一定進(jìn)展，但其具體分子機(jī)制目前仍不十分清楚，尚需從新的角度進(jìn)行深入探討。

圖7 下調(diào)MTDH提高鼻咽癌細(xì)胞5-8F(A)、HNE-1(B)對紫杉醇敏感度Figure7 MTDH silence sensitized NPC 5-8F(A) and HNE-1(B) cells to paclitaxel

MTDH是2002年新發(fā)現(xiàn)的一個癌基因，在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，MTDH在乳腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，并促進(jìn)化療耐藥性產(chǎn)生[8-10]。然而，MTDH在鼻咽癌化療耐藥中的作用目前尚不明確。李果等研究發(fā)現(xiàn)MTDH蛋白在鼻咽癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)較鼻咽部黏膜均顯著上調(diào)，其表達(dá)水平與患者血清EB病毒滴度的高低、T分級、臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)[11]。本研究中，我們通過基因功能獲得或缺失研究表明，MTDH過表達(dá)可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長增殖及紫杉醇耐藥性；而沉默MTDH表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞生長增殖，并增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對紫杉醇敏感度。宋振川等在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MTDH可通過調(diào)控凋亡等促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥[12]。Zhang等在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，以MTDH為靶點(diǎn)的基因疫苗能有效抑制小鼠前列腺癌的生長轉(zhuǎn)移并增強(qiáng)化療藥物紫杉醇的敏感度[13]。本研究結(jié)果與宋振川及Zhang等的研究結(jié)果一致，表明MTDH對紫杉醇化療耐藥具有促進(jìn)作用。然而，MTDH如何調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞生長增殖及紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生有待進(jìn)一步研究。

研究表明，MTDH可通過促增殖和抗凋亡效應(yīng)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。本研究中細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，沉默MTDH表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞G1期比例增加，S期細(xì)胞無顯著變化，G2/M期細(xì)胞比例降低，提示MTDH沉默后可能通過將細(xì)胞阻滯在G1期來抑制細(xì)胞增殖。此外，流式細(xì)胞分析還顯示，MTDH過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率降低，MTDH沉默組細(xì)胞凋亡率增加。這些結(jié)果與MTDH在卵巢癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中的研究一致[15-16]，提示MTDH可能通過調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡進(jìn)而影響鼻咽癌細(xì)胞增殖。EMT是具有極性的上皮細(xì)胞向具有活動能力的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，是一類基本形態(tài)和基因表型變化，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、放化療抵抗等生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用[17]。我們前期研究證實(shí)，MTDH可通過誘導(dǎo)EMT形成，進(jìn)而促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[6]。此外，在另一項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn)，MTDH在酸性微環(huán)境調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞紫杉醇耐藥中發(fā)揮重要作用[18]。這些提示我們，MTDH可能通過EMT調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞紫杉醇耐藥，這也是我們后續(xù)研究的方向之一。

綜上所述，本研究在體外水平闡明MTDH可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長增殖及紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生。該研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了MTDH在腫瘤中的生物功能，為今后利用MTDH蛋白作為鼻咽癌紫杉醇耐藥的分子靶點(diǎn)提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。然而，MTDH調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞生長增殖及紫杉醇耐藥的具體分子機(jī)制仍需深入探討，且需從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對現(xiàn)有體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行佐證。