余長云，劉勇，曹華

0 引言

鼻咽癌為東南亞及我國南部地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，每年約有80 000新發(fā)病例[1]。放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，對早期患者效果較好，五年生存率可達90%以上；但對于晚期患者效果并不理想。目前認為，放化療結(jié)合的綜合治療是鼻咽癌的重要治療手段，化療在中晚期或復發(fā)及轉(zhuǎn)移患者的治療中起著非常重要的作用[2-4]。然而化療耐藥的產(chǎn)生嚴重制約了鼻咽癌患者的最終治療效果。因此，闡明鼻咽癌化療耐藥的分子機制，并采取有效措施預防和抑制鼻咽癌化療耐藥，對提高患者的總體治療效果具有重要意義。

異黏蛋白（metadherin, MTDH）作為癌基因在乳腺癌、肝癌和肺癌等多種實體瘤中異常表達，并促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MTDH在頭頸部鱗狀細胞癌（簡稱頭頸鱗癌）組織中高表達，能通過誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和腫瘤血管新生促進頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移，與患者預后顯著負相關[6-7]。然而，目前有關MTDH在頭頸鱗癌化療耐藥中的作用報道尚少。因此，本研究旨在前期研究的基礎上探討MTDH對鼻咽癌細胞增殖及紫杉醇耐藥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人鼻咽癌細胞株5-8F、HNE-1均購自北納創(chuàng)聯(lián)生物公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，特級胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，0.25%胰蛋白酶消化液（含乙二胺四乙酸）、雙抗（青霉素-鏈霉素）均購自美國Gibco公司，細胞計數(shù)（CCK-8）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，MTDH過表達慢病毒顆粒、MTDH沉默慢病毒顆粒及對照慢病毒顆粒均由河南九睿生物技術有限公司設計合成，嘌呤霉素購自美國Santa Cruz公司，Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，兔抗人MTDH多克隆抗體購自美國Proteintech Group公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細胞5-8F、HNE-1均在37?C、5%CO2及飽和濕度條件下，用含有10%特級胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，常規(guī)0.25%胰蛋白酶消化傳代。所有實驗均選用處于對數(shù)生長期的細胞。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 將狀態(tài)良好的5-8F、HNE-1細胞按約2×105個/孔接種于6孔板中，用無抗生素細胞培基培養(yǎng)24 h，使轉(zhuǎn)染時細胞融合率達80%～85%。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進行，感染復數(shù)MOI=10。轉(zhuǎn)染后24 h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入4 μg/ml的嘌呤霉素進行篩選2周后，Western blot檢測MTDH過表達和沉默效果，再進行后續(xù)實驗。后續(xù)實驗分為親本細胞組、MTDH過表達組、MTDH沉默組及陰性對照組。

1.2.3 Western blot提取各組細胞總蛋白 采用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid, BCA）測定細胞總蛋白濃度。取50 μg總蛋白進行變性處理，進行10%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳。蛋白電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h。加入兔抗人MTDH多克隆抗體（1：800）、小鼠抗人β-actin抗體（1：1000）于4?C下孵育過夜。洗膜后，于辣根過氧化抗兔二抗（1：3000）、辣根過氧化抗小鼠二抗（1：1000）室溫下孵育1 h。洗膜后，經(jīng)化學發(fā)光劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。實驗重復三次。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力 分別將5-8F、HNE-1 MTDH過表達細胞、MTDH沉默細胞及陰性對照細胞按1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設5個復孔，共培養(yǎng)5天。分別于培養(yǎng)第1d、2d、3d、4d和5d時向每孔加入10 μl CCK-8測定液，2 h后用酶標儀測定450 nm波長吸光度值（OD）。實驗重復三次。

1.2.5 流式細胞實驗檢測細胞周期及凋亡 分別將5-8F、HNE-1 MTDH過表達細胞、MTDH沉默細胞及陰性對照細胞接種于六孔板中，每孔約1×106個細胞，每組設3個復孔，培養(yǎng)24 h。胰酶消化制成細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，以PBS溶液重懸、1 000 r/min離心5 min、去上清液，重復洗滌細胞2次后棄去上清液，每組細胞加入1 ml 70%乙醇重懸固定細胞，18 h后行流式細胞術檢測細胞周期。同法，收集各組細胞進行Annexin V-FITC和PI雙染色，1 h內(nèi)行流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。實驗均重復三次。

1.2.6 CCK-8法檢測紫杉醇對5-8F、HNE-1細胞的30%抑制濃度（IC30）、50%抑制濃度（IC50）、70%抑制濃度（IC70） 常規(guī)培養(yǎng)細胞處于對數(shù)生長期時消化傳代，細胞計數(shù)并調(diào)整5-8F細胞數(shù)為1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml；過夜貼壁后向各孔中加入不同濃度紫杉醇100 ml（紫杉醇終濃度分別為0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5和25 nmol/L），同時設置只含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的空白組，每組設3個復孔；培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8測定液，2 h后用酶標儀測定450 nm波長吸光度值（OD）。計算各濃度的抑制率，并算出紫杉醇對5-8F細胞的IC30、IC50、IC70濃度。生長抑制率=（OD對照組平均值-OD實驗組平均值）/（OD對照組平均值-OD空白組平均值）×100%。紫杉醇對HNE-1細胞的IC30、IC50、IC70檢測時加入的紫杉醇終濃度分別為0、0.1、1、5、10、20和50 nmol/L，其余步驟同5-8F細胞。實驗均重復三次。

1.2.7 CCK-8法檢測細胞生存率 分別將5-8F MTDH過表達細胞及陰性對照細胞、HNE-1 MTDH過表達細胞及陰性對照細胞1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設5個復孔；過夜貼壁后向各孔中加入含IC50、IC70濃度紫杉醇的細胞培養(yǎng)基100 ml，48 h后CCK-8法檢測細胞生存率。分別將5-8F MTDH沉默細胞及陰性對照細胞、HNE-1 MTDH沉默細胞及陰性對照細胞1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設5個復孔；過夜貼壁后向各孔中加入含IC30、IC50濃度紫杉醇的細胞培養(yǎng)基100 ml，48 h后CCK-8法檢測細胞生存率。實驗重復三次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用多樣本均數(shù)的方差分析進行多個樣本均數(shù)的比較，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗，采用獨立樣本t檢驗進行兩樣本均數(shù)的比較。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 建立穩(wěn)定高表達和沉默MTDH的鼻咽癌細胞株

Western blot結(jié)果顯示5-8F、HNE-1過表達組細胞MTDH表達量分別是對照組的4.6倍、2.77倍；1號干擾序列在5-8F、HNE-1中沉默效率均達80%以上，見圖1～2。以上結(jié)果表明，MTDH穩(wěn)定高表達和沉默的細胞株構(gòu)建成功，可用于下一步實驗研究。

2.2 MTDH對鼻咽癌細胞生長增殖能力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，MTDH過表達后5-8F、HNE-1細胞在培養(yǎng)3、4、5 d時的OD值均大于對照組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；然而，沉默MTDH表達后，5-8F、HNE-1細胞在培養(yǎng)3、4、5 d時的OD值均小于對照組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3。這些表明，MTDH上調(diào)可促進鼻咽癌細胞生長增殖，MTDH下調(diào)抑制鼻咽癌細胞生長增殖。

2.3 MTDH對鼻咽癌細胞周期的影響

圖1 轉(zhuǎn)染MTDH cDNA和MTDH-shRNA后5-8F細胞中MTDH蛋白相對表達情況Figure1 The expression of MTDH protein in 5-8F cells transfected with MTDH cDNA and MTDH-shRNA

圖2 轉(zhuǎn)染MTDH cDNA和MTDH-shRNA后HNE-1細胞中MTDH蛋白表達情況Figure2 The expression of MTDH protein in HNE-1 cells transfected with MTDH cDNA and MTDH-shRNA

流式細胞實驗結(jié)果顯示：MTDH沉默組的G1期細胞比例（5-8F：（55.813±2.521）%，HNE-1：（55.117±1.495）%）較對照組（5-8F：（37.330±0.325）%, HNE-1：（48.487±0.781）%）明顯增加，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=-18.694,P=0.000；HNE-1：t=-6.807,P=0.002）；而MTDH沉默組S期細胞比例（5-8F：（34.753±2.626）%，HNE-1：（23.543±2.251）%）與對照組（5-8F：（35.127±2.072）%，HNE-1：（20.683±2.634）%）比較差異無統(tǒng)計學意義（5-8F：t=0.193,P=0.856;HNE-1：t=-1.430,P=0.226）；MTDH沉默組G2/M期細胞比例（5-8F：（8.727±4.873）%, HNE-1：（23.277±4.093）%）較對照細胞組（5-8F：（25.630±1.470）%, HNE-1：（31.060±2.037）%）明顯減少，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=5.752,P=0.005; HNE-1：t=2.949,P=0.042），見圖4。

圖3 MTDH對5-8F細胞(A)、HNE-1細胞(B)增殖能力的影響Figure3 Effects of MTDH on proliferation of 5-8F(A) and HNE-1(B) cells

圖4 MTDH對5-8F、HNE-1細胞周期的影響Figure4 Effect of MTDH on cell cycle of 5-8F and HNE-1 cells

2.4 MTDH對鼻咽癌細胞凋亡的影響

流式細胞實驗結(jié)果顯示，MTDH過表達組細胞凋亡率（5-8F： （1.243±0.266）%, HNE-1： （5.590±0.387）%）較對照組細胞凋亡率（5-8F：（3.293±1.243）%, HNE-1： （6.617±0.431）%）降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=4.118,P=0.015；HNE-1：t=3.067,P=0.037），見圖5A。MTDH沉默組細胞凋亡率（5-8F：（6.737±0.735）%, HNE-1：（11.910±1.102）%）較對照組細胞凋亡率（5-8F：（3.293±1.243）%, HNE-1：（6.617±0.431）%）增高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=-4.005,P=0.016; HNE-1：t=-7.744,P=0.001），見圖5B。

圖5 MTDH過表達(A)及沉默(B)后對5-8F、HNE-1細胞凋亡的影響Figure5 Effects of MTDH overexpression(A) and silence(B) on apoptosis of 5-8F and HNE-1 cells

2.5 上調(diào)MTDH降低鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感度

根據(jù)CCK-8結(jié)果確定，紫杉醇對5-8F的IC30、IC50、IC70分別為2.947、5.875、8.802 nmol/L，紫杉醇對HNE-1的IC30、IC50、IC70分別為2.077、6.768、22.052 nmol/L。分別用IC50、IC70濃度的紫杉醇作用于MTDH過表達鼻咽癌細胞及對照細胞，48 h后CCK-8法檢測細胞生存率。結(jié)果顯示：MTDH表達上調(diào)之后，鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感度降低，在IC70濃度下，MTDH過表達組細胞的生存率（5-8F： 41.05±5.47, HNE-1：44.37±2.07）高于對照組細胞（5-8F： 28.94±3.24, HNE-1： 30.16±3.56），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=-4.261,P=0.003; HNE-1：t=-7.727,P=0.000）；在IC50濃度下，MTDH過表達組細胞的生存率（5-8F： 61.36±6.51, HNE-1：64.17±3.26）亦高于對照組細胞（5-8F： 50.16±2.39, HNE-1： 54.98±3.15），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=-3.610，P=0.007; HNE-1：t=-4.538,P=0.002），見圖6。

圖6 上調(diào)MTDH降低鼻咽癌細胞5-8F(A)、HNE-1(B)對紫杉醇敏感度Figure6 MTDH overexpression decreased sensitivity of NPC 5-8F(A) and HNE-1(B) cells to paclitaxel

2.6 下調(diào)MTDH提高鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感度

分別用IC30、IC50濃度的紫杉醇作用于MTDH沉默組鼻咽癌細胞及對照細胞，48 h后CCK-8法檢測細胞生存率。結(jié)果顯示：沉默MTDH表達之后，鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感度升高，在IC50濃度下，MTDH沉默組細胞的生存率（5-8F： 30.70±1.73, HNE-1： 44.99±3.16）低于對照組細胞（5-8F：50.16±2.39, HNE-1： 54.98±3.15），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=14.757,P=0.000; HNE-1：t=5.008,P=0.001）；在IC30濃度下，MTDH沉默組細胞的生存率（5-8F： 62.56±5.14, HNE-1： 63.36±3.51）亦低于對照組細胞（5-8F： 73.78±2.76,HNE-1： 72.95±2.94），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=4.297,P=0.003; HNE-1：t=-4.681,P=0.002），見圖7。

3 討論

紫杉醇作為鼻咽癌化療的一線藥物，其臨床效果得到一致認可。然而，細胞耐藥性的產(chǎn)生嚴重制約了其最終治療效果。因此，闡明紫杉醇耐藥性產(chǎn)生的分子機制，尋找紫杉醇耐藥密切相關的分子標志物和干預靶點，有望改善鼻咽癌患者的臨床治療效果。近年來，盡管紫杉醇耐藥的相關性研究取得一定進展，但其具體分子機制目前仍不十分清楚，尚需從新的角度進行深入探討。

圖7 下調(diào)MTDH提高鼻咽癌細胞5-8F(A)、HNE-1(B)對紫杉醇敏感度Figure7 MTDH silence sensitized NPC 5-8F(A) and HNE-1(B) cells to paclitaxel

MTDH是2002年新發(fā)現(xiàn)的一個癌基因，在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中異常表達，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，MTDH在乳腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中高表達，并促進化療耐藥性產(chǎn)生[8-10]。然而，MTDH在鼻咽癌化療耐藥中的作用目前尚不明確。李果等研究發(fā)現(xiàn)MTDH蛋白在鼻咽癌細胞和組織中的表達較鼻咽部黏膜均顯著上調(diào)，其表達水平與患者血清EB病毒滴度的高低、T分級、臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關[11]。本研究中，我們通過基因功能獲得或缺失研究表明，MTDH過表達可促進鼻咽癌細胞生長增殖及紫杉醇耐藥性；而沉默MTDH表達可抑制鼻咽癌細胞生長增殖，并增強鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感度。宋振川等在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MTDH可通過調(diào)控凋亡等促進乳腺癌細胞紫杉醇耐藥[12]。Zhang等在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，以MTDH為靶點的基因疫苗能有效抑制小鼠前列腺癌的生長轉(zhuǎn)移并增強化療藥物紫杉醇的敏感度[13]。本研究結(jié)果與宋振川及Zhang等的研究結(jié)果一致，表明MTDH對紫杉醇化療耐藥具有促進作用。然而，MTDH如何調(diào)控鼻咽癌細胞生長增殖及紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生有待進一步研究。

研究表明，MTDH可通過促增殖和抗凋亡效應調(diào)控腫瘤細胞的增殖[14]。本研究中細胞周期分析結(jié)果顯示，沉默MTDH表達后鼻咽癌細胞G1期比例增加，S期細胞無顯著變化，G2/M期細胞比例降低，提示MTDH沉默后可能通過將細胞阻滯在G1期來抑制細胞增殖。此外，流式細胞分析還顯示，MTDH過表達組細胞凋亡率降低，MTDH沉默組細胞凋亡率增加。這些結(jié)果與MTDH在卵巢癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中的研究一致[15-16]，提示MTDH可能通過調(diào)控細胞周期和凋亡進而影響鼻咽癌細胞增殖。EMT是具有極性的上皮細胞向具有活動能力的間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，是一類基本形態(tài)和基因表型變化，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、放化療抵抗等生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用[17]。我們前期研究證實，MTDH可通過誘導EMT形成，進而促進頭頸鱗癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[6]。此外，在另一項研究中我們發(fā)現(xiàn)，MTDH在酸性微環(huán)境調(diào)控鼻咽癌細胞紫杉醇耐藥中發(fā)揮重要作用[18]。這些提示我們，MTDH可能通過EMT調(diào)控鼻咽癌細胞細胞紫杉醇耐藥，這也是我們后續(xù)研究的方向之一。

綜上所述，本研究在體外水平闡明MTDH可促進鼻咽癌細胞生長增殖及紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生。該研究結(jié)果進一步豐富了MTDH在腫瘤中的生物功能，為今后利用MTDH蛋白作為鼻咽癌紫杉醇耐藥的分子靶點提供了新的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。然而，MTDH調(diào)控鼻咽癌細胞生長增殖及紫杉醇耐藥的具體分子機制仍需深入探討，且需從體內(nèi)實驗對現(xiàn)有體外實驗結(jié)果進行佐證。