韓宏嬌,叢 敏,李欣蔚,孔繁華,李瑋軒,梁肖娜,曹雪妍,岳喜慶

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110161)

酸菜是深受東北人民喜愛的一種傳統(tǒng)的發(fā)酵制品。經(jīng)過發(fā)酵后的蔬菜制品,不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提升,而且口味獨(dú)特。其濃郁酸香的口感得益于發(fā)酵過程中微生物代謝的復(fù)雜變化。在整個(gè)發(fā)酵過程中,發(fā)酵液中各項(xiàng)化學(xué)指標(biāo)以及微生物數(shù)量的變化對(duì)酸菜發(fā)酵品質(zhì)、風(fēng)味和貯藏特性等起著至關(guān)重要的作用[1]。要實(shí)現(xiàn)酸菜由傳統(tǒng)自然發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)槿斯た烧{(diào)控發(fā)酵,必須準(zhǔn)確掌握發(fā)酵過程中的微生物和化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化,這對(duì)于形成口感佳、風(fēng)味好和質(zhì)量高的產(chǎn)品尤為重要[2-4]。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于自然發(fā)酵酸菜的研究主要是利用高新技術(shù)研究微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)變化以及乳酸菌的分離和種類鑒定,人工接種發(fā)酵酸泡菜在發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量變化和風(fēng)味成分分析。而對(duì)自然發(fā)酵酸菜尤其是東北酸白菜及其發(fā)酵液的化學(xué)成分和微生物數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及相關(guān)性分析研究還鮮有報(bào)道。

本研究擬對(duì)東北地區(qū)自然發(fā)酵第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35、40、50、60 d的酸菜及發(fā)酵液中的乳酸菌數(shù)、酵母菌數(shù)、大腸菌群數(shù)和細(xì)菌菌落總數(shù)、pH、總酸度、亞硝酸鹽含量、可溶性蛋白含量、還原糖含量和氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行了系統(tǒng)分析,并研究各項(xiàng)化學(xué)成分含量和微生物數(shù)量之間的相關(guān)性,以期為酸菜發(fā)酵工藝的優(yōu)化及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大白菜 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、3,5-二硝基苯磺酸、結(jié)晶酚、考馬斯亮藍(lán)G-250 分析純,鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

ALC-210.2型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;AL204分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;LDZX-50FBS全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;ZHJH-C1214C超凈工作臺(tái) 青島海爾特種電器有限公司;ZHJH-C1213C無菌操作臺(tái) 青島海爾特種電器有限公司;DNP型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司;ND-2000型紫外分光光度計(jì) 北京中西科技遠(yuǎn)大有限公司;DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司;pHS-3C型精密pH計(jì) 上海理達(dá)儀器;5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸菜的腌制 采用中國(guó)東北地區(qū)酸菜腌制的傳統(tǒng)方法。挑選結(jié)實(shí)飽滿且成熟,無腐爛,無病蟲害的大白菜,將其在通風(fēng)且陽光充足的室外晾曬數(shù)日后(曬蔫、殺菌、去除一定的水分),去除黃葉、老幫并清洗干凈,將整顆大白菜浸入沸水3 min左右后撈出,瀝干水分,整齊擺入5L的發(fā)酵罐中裝滿壓實(shí)并排出空氣,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%淡鹽水將發(fā)酵罐填滿密封,不添加任何發(fā)酵劑和調(diào)味料。用塑料布將發(fā)酵罐口扎緊,將酸菜發(fā)酵罐放置在溫度20～25 ℃,濕度40～65%且避光陰涼的環(huán)境中進(jìn)行自然發(fā)酵,取0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35、40、50、60 d的酸菜及發(fā)酵液進(jìn)行如下指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 化學(xué)成分指標(biāo)的測(cè)定 pH:取酸菜發(fā)酵罐中多個(gè)位置的發(fā)酵液進(jìn)行混合,校準(zhǔn)pH計(jì)后,將電極浸沒在發(fā)酵液中直至數(shù)值穩(wěn)定。連續(xù)測(cè)定三次取平均值作為最終結(jié)果;

總酸度[5]:參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》,取酸菜10.00 g研磨成勻漿，蒸餾水定容至100 mL，過濾備用，采用酸堿滴定法對(duì)發(fā)酵懸濁液進(jìn)行測(cè)定;

亞硝酸鹽含量[6]:取酸菜500 g研磨成漿，參照GB 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測(cè)定》,制備酸菜樣品的亞硝酸鹽提取液，采用鹽酸萘乙二胺法對(duì)發(fā)酵懸濁液進(jìn)行測(cè)定,以亞硝酸鈉含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=0.0162x+0.0053,R2=0.9981,呈線性關(guān)系;

可溶性蛋白含量[7]：取酸菜2.00 g研磨成勻漿，與5 mL去離子水混合后在4 ℃，12000 r/min的條件下離心30 min，上清液即為酸菜可溶性蛋白提取液。參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)酸菜樣液進(jìn)行測(cè)定，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.0057x+0.0121，R2=0.9983，呈線性關(guān)系；

還原糖含量[8]：取酸菜1.00 g研磨成勻漿，定容至25 mL，80℃水浴30 min使還原糖充分溶出，過濾后定容至100 mL即為酸菜還原糖提取液。參照GB/T 5009.7-2008《食品中還原糖的測(cè)定》，采用3,5-二硝基水楊酸比色法對(duì)酸菜樣液進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.3074x-0.0012，R2=0.9992，呈線性關(guān)系；

氨基酸態(tài)氮含量[9]:甲醛滴定法,取酸菜樣品10 g,研磨成勻漿狀,去離子水定容至100 mL,搖勻后過濾,取濾液20 mL與60 mL蒸餾水混合。用0.05 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)堿液調(diào)節(jié)溶液pH至8.2(V1)。再加入10 mL甲醛溶液,再調(diào)節(jié)pH至9.2(V2)。用去離子水(V0)作為空白對(duì)照,計(jì)算如下:

1.2.3 微生物指標(biāo)的測(cè)定 采用純培養(yǎng)法,將發(fā)酵第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35、40、50、60 d的發(fā)酵液用25 mL離心管收集,經(jīng)過四層無菌紗布過濾后,取濾液作為研究對(duì)象進(jìn)行微生物指標(biāo)的測(cè)定。細(xì)菌菌落總數(shù)[10]:參照GB 4789.2-2010,釆用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌菌落總數(shù);乳酸菌總數(shù)[11]:參照GB 4789.35-2010,釆用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定乳酸菌數(shù)量;酵母菌數(shù)量[12]:參照GB 4789.15-2010,采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定酵母菌數(shù)量;大腸菌群數(shù)[13]:參照GB 4789.3-2010,采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定大腸菌群數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel和SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸菜自然發(fā)酵過程中pH的動(dòng)態(tài)變化

pH是酸菜發(fā)酵過程中的重要指標(biāo)。pH不僅會(huì)影響發(fā)酵環(huán)境中微生物的種類、數(shù)量和生長(zhǎng)狀況,還會(huì)影響微生物的代謝途徑及其代謝產(chǎn)物的變化,進(jìn)而影響發(fā)酵風(fēng)味的形成[3]。

自然發(fā)酵酸菜pH隨發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示。在發(fā)酵時(shí)間為0～35 d時(shí),pH逐漸下降,從初始的6.42下降為3.64。在發(fā)酵時(shí)間為40～60 d時(shí),pH在3.70左右保持平穩(wěn)。Xiong等[14]認(rèn)為,發(fā)酵初期乳酸菌的生長(zhǎng)處于劣勢(shì),發(fā)酵環(huán)境中產(chǎn)酸較少。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌在厭氧環(huán)境中利用大白菜中的還原糖發(fā)酵,產(chǎn)生大量的乳酸等酸性物質(zhì),使pH不斷下降[15]。在酸菜發(fā)酵40～60 d,pH變化較小。杜書[16]和馬歡歡等[17]研究表明,pH隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,最終穩(wěn)定在pH3左右,與本文結(jié)果類似。

圖1 酸菜自然發(fā)酵過程中pH的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of pH during natural fermentation of sauerkraut

2.2 酸菜自然發(fā)酵過程中總酸含量的動(dòng)態(tài)變化

如圖2所示,酸菜發(fā)酵環(huán)境中的總酸含量呈持續(xù)上升趨勢(shì),在發(fā)酵時(shí)間為50 d時(shí)達(dá)到最大值6.68 g/kg,在發(fā)酵時(shí)間為50～60 d時(shí)基本保持穩(wěn)定。Liu等[18]發(fā)現(xiàn),乳酸菌在發(fā)酵蔬菜中的作用主要是形成酸性環(huán)境和抑制不耐酸有害菌的生長(zhǎng)。且乳酸菌是發(fā)酵體系中的主體微生物[19]。因此,在酸菜腌制初期,發(fā)酵環(huán)境中以腸膜明串珠菌的異型發(fā)酵為主,產(chǎn)生的CO2、CH3COOH和CH3CH2OH導(dǎo)致發(fā)酵液的總酸含量升高[20]。由此創(chuàng)造的酸性環(huán)境促進(jìn)部分抗酸乳酸菌的繁殖,產(chǎn)生大量乳酸,總酸含量持續(xù)增加。而在發(fā)酵時(shí)間為50 d之后,發(fā)酵環(huán)境中的碳源和氮源因被大量消耗而不足,乳酸菌數(shù)量趨于穩(wěn)定,其產(chǎn)酸作用減弱并逐漸停止,發(fā)酵環(huán)境中總酸含量趨于穩(wěn)定。乳酸菌發(fā)酵食品的酸味及風(fēng)味受其總酸度的影響較大[21]。自然發(fā)酵酸菜中的適量酸有助于掩蓋白菜味,同時(shí)賦予制品獨(dú)特的風(fēng)味。

圖2 酸菜自然發(fā)酵過程中總酸含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of total acid content during natural fermentation of sauerkraut

2.3 酸菜自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的動(dòng)態(tài)變化

在腌制初期,發(fā)酵體系內(nèi)酸度較低,蔬菜本身及發(fā)酵器具上攜帶的腸桿菌和黃桿菌屬等革蘭氏陰性菌會(huì)分泌硝酸還原酶,蔬菜中的大量硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[22]。由圖3所示,酸菜的亞硝酸鹽含量在發(fā)酵時(shí)間為0～9 d時(shí)急劇增加,并在9 d時(shí)達(dá)到最大值69.76 mg/kg。何淑玲等[23]發(fā)現(xiàn),硝酸還原酶產(chǎn)生作用的臨界點(diǎn)為pH5.0,且硝酸還原酶酶活性對(duì)亞硝酸鹽含量變化規(guī)律起主要作用。由圖3變化趨勢(shì)結(jié)合2.1 pH變化規(guī)律,亞硝酸鹽含量在發(fā)酵第15 d(pH4.99)后逐漸減小并趨于穩(wěn)定,15 d之后降低到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以下的水平,小于20 mg/kg。

圖3 酸菜自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of nitrite content during natural fermentation of sauerkraut

2.4 酸菜自然發(fā)酵過程中可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化

Do等[24]研究表明,LactobacillusdelbrueckiiUFV H2b20有編碼合成蛋白質(zhì)水解酶和氨基肽酶的基因,從而提高蛋白質(zhì)的降解速率和消耗速率。由圖4可知,在酸菜的自然發(fā)酵過程中,可溶性蛋白被分解為氨基酸和小肽等物質(zhì)被微生物生長(zhǎng)發(fā)育所利用,整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),從發(fā)酵時(shí)間為0 d時(shí)的49.85 mg/100 g下降到60 d的1.34 mg/100 g,下降了約37倍。在40～60 d時(shí),可溶性蛋白含量趨于穩(wěn)定,蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物也為酸菜特殊風(fēng)味和口感的形成提供了保證。

圖4 酸菜自然發(fā)酵過程中可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of soluble protein during natural fermentation of sauerkraut

2.5 酸菜自然發(fā)酵過程中還原糖含量的動(dòng)態(tài)變化

由圖5所示,發(fā)酵時(shí)間為0～9 d時(shí),酸菜發(fā)酵體系中還原糖含量逐漸增大并達(dá)到最大值,分析原因可能是,隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長(zhǎng)和鹽水的滲透壓作用,導(dǎo)致大白菜本身的還原糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷溶出,此時(shí)微生物對(duì)還原糖的分解速率小于還原糖的生成速率。Dodds等[25]對(duì)TS4乳酸桿菌的研究表明還原糖和NADH是發(fā)酵環(huán)境中酶的主要電子供體。同時(shí),還原糖在發(fā)酵后期作為微生物生長(zhǎng)繁殖的主要碳源被消耗,其含量逐漸減少并趨于穩(wěn)定,因此在發(fā)酵時(shí)間為9～60 d時(shí)整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖5 酸菜自然發(fā)酵過程中還原糖含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic change of reducing sugar during natural fermentation of sauerkraut

2.6 酸菜自然發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的動(dòng)態(tài)變化

微生物通過代謝活動(dòng)產(chǎn)生蛋白酶,Lee等[26]研究發(fā)現(xiàn),泡菜中的Lb.sakei能夠分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量的必需氨基酸和肽類物質(zhì)。如圖6所示,酸菜發(fā)酵環(huán)境中氨基酸態(tài)氮含量在0～9 d逐漸增加,并在發(fā)酵時(shí)間為10 d時(shí),達(dá)到最大值11.3 mg/100 g,這是由于初期微生物數(shù)量較少,且代謝活動(dòng)較弱,因此酶解蛋白質(zhì)作用較弱。在發(fā)酵時(shí)間為10～60 d時(shí),整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),可能是由于高酸性的發(fā)酵環(huán)境抑制中性和堿性蛋白酶的活性,同時(shí)微生物代謝活動(dòng)趨于平穩(wěn),氨基酸態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定。

圖6 酸菜自然發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Change of amino acid nitrogen during natural fermentation of sauerkraut

2.7 酸菜自然發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化

如圖7所示,自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌數(shù)量、酵母菌數(shù)量、大腸桿菌數(shù)量和細(xì)菌菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致,細(xì)菌菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)量、酵母菌數(shù)量和大腸菌群數(shù)量均在發(fā)酵前期逐漸增加到峰值,出現(xiàn)峰值的時(shí)間分別為15、18、9、6 d,在發(fā)酵后期數(shù)量逐漸減少并趨于平穩(wěn)的趨勢(shì),其中酵母菌數(shù)量在發(fā)酵40～60 d時(shí)略有上升,而大腸菌群數(shù)量在發(fā)酵20 d后變?yōu)榱?。Xiong等[19]對(duì)發(fā)酵圓白菜的研究表明,發(fā)酵過程中的主體微生物為乳酸菌。如圖7所示在發(fā)酵第18 d時(shí),乳酸菌數(shù)量到達(dá)峰值成為優(yōu)勢(shì)菌群。隨后其數(shù)量開始減少,這是由于乳酸富集到1.1%～1.3%的濃度時(shí),反而抑制了部分不耐酸乳酸菌的生長(zhǎng)[16,27]。Mundt等[21]發(fā)現(xiàn),甘藍(lán)發(fā)酵初期乳酸菌和細(xì)菌總數(shù)急劇上升,同時(shí)伴隨一定數(shù)量的霉菌和酵母菌,在發(fā)酵后期乳酸菌和細(xì)菌逐漸抑制其他雜菌,與本研究結(jié)果相符。分析原因認(rèn)為,一方面隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌生長(zhǎng)并大量產(chǎn)酸,酸性和低氧的發(fā)酵環(huán)境抑制了酵母菌和大腸菌群的生長(zhǎng)[28]。另一方面,發(fā)酵環(huán)境中微生物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如碳源和氮源不足,使得發(fā)酵液中乳酸菌的數(shù)量逐漸減少。發(fā)酵環(huán)境中微生物的交替生長(zhǎng)為酸菜產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味和提高貯藏品質(zhì)提供了保證。

圖7 酸菜自然發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Dynamic changes of microbial quantity during natural fermentation of sauerkraut

2.8 酸菜自然發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化與化學(xué)成分含量變化的相關(guān)性分析

將酸菜自然發(fā)酵過程中化學(xué)成分含量與各類微生物數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表1所示。乳酸菌數(shù)與pH、大腸菌群數(shù)及可溶性蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為-0.801、-0.697和-0.811。酵母菌數(shù)與亞硝酸鹽含量、還原糖含量及氨基酸態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.934、0.811和0.874。大腸菌群數(shù)與pH、還原糖含量、可溶性蛋白含量及氨基酸態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),與總酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.869、0.830、0.665、0.813和-0.765。而細(xì)菌菌落總數(shù)與氨基酸態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。pH與還原糖含量、可溶性蛋白含量和氨基酸態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),與總酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.858、0.851、0.773和-0.962?？偹岷颗c還原糖含量、可溶性蛋白含量和氨基酸態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為-0.948、-0.742和-0.818。

表1 酸菜自然發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化與化學(xué)成分變化的相關(guān)性分析Table 1 Correlation Analysis of the changes of chemical composition and microbial quantity in the process of sauerkraut fermentation

3 討論

3.1 酸菜自然發(fā)酵過程中微生物數(shù)量與化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化

酸菜中乳酸發(fā)酵是主要的發(fā)酵類型,同時(shí)也有少量的乙醇發(fā)酵過程和微量的醋酸發(fā)酵過程[28]。此外,自然發(fā)酵酸菜的總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),pH隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),因此,酸菜會(huì)呈現(xiàn)獨(dú)特的酸味。在發(fā)酵過程中,發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)先增加后逐漸減小并保持穩(wěn)定的趨勢(shì),細(xì)菌菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)在發(fā)酵前期略有增加,之后逐漸減少,其中大腸菌群數(shù)在發(fā)酵20 d后數(shù)量變?yōu)榱恪＝湍妇鷶?shù)量呈現(xiàn)先增加后降低在略上升的趨勢(shì)。這些微生物數(shù)量的變化顯著影響著發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還原糖、可溶性蛋白和氨基酸態(tài)氮含量的變化,可溶性蛋白含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì),而還原糖和氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)則略有上升后下降。在發(fā)酵過程中,亞硝酸鹽含量的變化趨勢(shì)為先增加后下降,最終在一定范圍內(nèi)波動(dòng)并保持穩(wěn)定,且發(fā)酵21 d后的酸菜產(chǎn)品已經(jīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 酸菜自然發(fā)酵過程中微生物數(shù)量與化學(xué)成分含量之間的關(guān)系

酸菜發(fā)酵環(huán)境中的乳酸菌數(shù)與pH及可溶性蛋白含量極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01)。Liu等[29]研究表明Lb.Plantarum能夠合成蛋白水解酶基因的前體物質(zhì),可水解發(fā)酵體系中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸。因此可溶性蛋白為乳酸菌的生長(zhǎng)提供氮源。乳酸菌是發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)微生物和產(chǎn)酸的主要微生物[19],且發(fā)酵體系中的酸度直接影響pH的變化。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),乳酸菌對(duì)大腸桿菌數(shù)量的消長(zhǎng)規(guī)律有極顯著影響且呈反向相關(guān)關(guān)系,這與楊麗等[30]的研究結(jié)果一致。

酵母菌數(shù)量與氨基酸態(tài)氮含量的相互關(guān)系與Beltran等[31]和Vilanova等[32]的研究結(jié)果相似,可同化氮是酵母菌生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其含量變化的消長(zhǎng)規(guī)律與酵母菌數(shù)量保持同步。酵母菌數(shù)量與酸菜發(fā)酵體系中的還原糖具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系,可能是由于發(fā)酵環(huán)境中的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)限制了酵母菌對(duì)還原糖的消耗速率,也可能是酵母菌發(fā)酵需要一定濃度的還原糖存在。國(guó)內(nèi)外均有研究表明,發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的產(chǎn)生是由于腸桿細(xì)菌和黃桿菌屬分泌的硝酸還原酶作用[22-33]。但亞硝酸鹽含量與酵母菌數(shù)量呈極顯著正相關(guān)的作用機(jī)理尚無定論,有待在后續(xù)研究中開展。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)大腸菌群的生長(zhǎng)受到發(fā)酵體系中多種因素的影響,pH、還原糖含量、可溶性蛋白含量、氨基酸態(tài)氮含量及總酸含量對(duì)大腸菌群數(shù)的影響極顯著。其中可溶性蛋白和氨基酸態(tài)氮作為發(fā)酵體系中的主要氮源促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)發(fā)育。程立坤等[34]證明了葡萄糖濃度對(duì)大腸桿菌TRJTH0709的菌體生物量、菌體比生長(zhǎng)速率等具有顯著影響,與本文結(jié)果一致。但是pH及總酸含量與大腸菌群的關(guān)系與楊麗等[30]的研究存在一定的差異,這可能與發(fā)酵過程中是否添加調(diào)味料以及發(fā)酵液的鹽濃度有關(guān)。

比較細(xì)菌菌落總數(shù)與其他指標(biāo)的變化發(fā)現(xiàn),細(xì)菌菌落數(shù)量?jī)H與氨基酸態(tài)氮含量有顯著的正向相關(guān)關(guān)系。因此,除乳酸菌外,氨基酸態(tài)氮含量是發(fā)酵酸菜中其他微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。

4 結(jié)論

東北酸菜自然發(fā)酵過程中的氨基酸態(tài)氮含量是影響發(fā)酵體系內(nèi)微生物生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),pH和可溶性蛋白的含量下降,總酸含量上升,還原糖、亞硝酸鹽和氨基酸態(tài)氮含量均先增加后減小。細(xì)菌菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)和乳酸菌數(shù)量先增加后減少,大腸菌群數(shù)最后為零。酵母菌數(shù)量先增加后降低,最后略有上升。發(fā)酵體系中化學(xué)成分含量和微生物數(shù)量相關(guān)性顯著(p<0.05)。乳酸菌則受到大腸桿菌和可溶性蛋白含的極顯著影響(p<0.01)。而大腸菌群數(shù)則受諸多化學(xué)成分含量的影響,在發(fā)酵20 d后數(shù)量變?yōu)榱恪＝湍妇鷶?shù)量極顯著地影響還原糖、氨基酸態(tài)氮和亞硝酸的含量(p<0.01),其與亞硝酸鹽的關(guān)系可以進(jìn)一步研究,為解決發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的積累問題提供理論依據(jù)。