任大勇，朱劍威，劉宏妍，于寒松，沈明浩

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

金黃色葡萄球菌是一類革蘭氏陽(yáng)性致病菌株，屬于葡萄球菌屬，易于污染魚(yú)、肉、乳制品等食品從而引發(fā)腸炎，肺炎等食源性疾病[1-2]。此外，由于金黃色葡萄球菌的耐藥菌株對(duì)絕大數(shù)抗生素都具有明顯的耐藥性[3]，這導(dǎo)致感染而造成的死亡事件呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，所以開(kāi)發(fā)天然的具有抑菌金黃色葡萄球菌的物質(zhì)便成為了研究的熱點(diǎn)。

乳酸菌作為一種益生菌，因分泌通常認(rèn)為無(wú)害且具有廣譜抑菌效果的多肽而被廣泛研究。在2011年乳酸乳球菌被我國(guó)原衛(wèi)生部納入《可食用的菌種名單》，且乳酸乳球菌符合美國(guó)食品和藥物管理局的食用標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8149/NZ3900是由Nisin誘導(dǎo)的食品級(jí)的表達(dá)載體。NZ3900菌株是一類乳糖缺陷型菌株，而質(zhì)粒pNZ8149攜帶乳糖分解酶基因，當(dāng)NZ8149正確轉(zhuǎn)入NZ3900菌株后，使菌株代謝乳糖產(chǎn)生乳酸，pH值的下降使溴甲酚紫培養(yǎng)基由紫色變黃色后從而進(jìn)行篩選。

本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中，從東北家庭自制的辣醬、臭豆腐、黏面子等發(fā)酵食品中通過(guò)傳統(tǒng)抑菌實(shí)驗(yàn)和基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)了多株含有plnF、plnE、plnN、plnJ等抗菌肽基因且具有抑菌效果的乳酸菌[5-7]，并進(jìn)一步將抗菌肽基因在pET28a/BL21（DE3）載體進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌、大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌有較好的抑制效果。其中只有plnF表達(dá)產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，但是由于plnF基因在pET28a等大腸表達(dá)載體中表達(dá)后，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的變復(fù)性和純化處理才能被應(yīng)用，所以本實(shí)驗(yàn)試圖在usp45信號(hào)肽作用下[8]，將plnF基因與pNZ8149質(zhì)粒結(jié)合，轉(zhuǎn)入NZ3900乳酸乳球菌表達(dá)載體[9]，為抗菌肽在乳酸乳球菌表達(dá)載體中的胞外分泌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Pfu酶 北京天根生化科技有限公司；Ex Taq酶、dNTP、DL500 DNA Marker、DL2000 NDA Marker、DL15000 DNA Marker 大連寶生物工程有限公司；NcoI、SphI、SacI限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶 NEB（北京）公司；膠回收試劑盒 美國(guó)Omega公司；質(zhì)粒提取試劑盒 美國(guó)Aeygen公司；瓊脂糖 法國(guó)Biowest公司；M17肉湯培養(yǎng)基、MRS肉湯 青島海博生物技術(shù)有限公司；三羥甲基甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、溴甲酚紫、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化鈣、氯化鎂、甘油 北京化工廠。

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538p） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；pNZ8149菌株、NZ3900菌株、植物乳桿菌（T4、T8）、pMG36e-S-cbhII由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品毒理與安全實(shí)驗(yàn)室保存。

GM17培養(yǎng)基：M17培養(yǎng)基、5 g/L葡萄糖；SGM17培養(yǎng)基：M17培養(yǎng)基、0.5 mol/L蔗糖、25 g/L甘氨酸、5 g/L葡萄糖；GM17MC恢復(fù)培養(yǎng)基：M17培養(yǎng)基、5 g/L葡萄糖、20 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2；pNZ8149篩選培養(yǎng)基：M17培養(yǎng)基、0.04 g/L溴甲酚紫、瓊脂；溶液I：0.5 mol/L蔗糖+100 mL/L甘油；溶液II：0.5 mol/L蔗糖+100 mL/L甘油+0.05 mol/L EDTA。

1.2 儀器與設(shè)備

GeneAmp 9700基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司；垂直電泳槽、水平電泳槽、DYY-11型電泳儀 北京六一儀器廠；ECM399型電轉(zhuǎn)化儀 美國(guó)BTX公司；JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Biotop SC810凝膠成像系統(tǒng) 上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株信息與活化

－80 ℃保存的植物乳桿菌T4、T8分別按照1%接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min活化備用；NZ3900、pMG36e-S-cbhII、pNZ8149菌株接種于M17培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧條件下復(fù)蘇培養(yǎng)后備用。

1.3.2 抗菌肽基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI中PlnF抗菌肽基因序列，為與pNZ8149質(zhì)粒相連接，以T4和T8菌株為模板，PlnF上游引物添加SphI酶切位點(diǎn)（5’-ATAAAAGCATGCAAAAAATTTCT AGTTTTGCGTGAC-3’），下游引物添加SacI酶切位點(diǎn)（5’-ATAAAAGAGCTCCTATCCGTGGATGAATCCTCG GACAGC-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照如下程序進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性2 min；35 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s；65 ℃退火45 s；68 ℃延伸90 s）。在2%瓊脂糖中進(jìn)行電泳驗(yàn)證并進(jìn)行DNA純化后在－20 ℃保存。此外，以含有usp45信號(hào)肽基因的pMG36e-S-cbhII為模板，在P1和P2引物[10]上下游分別添加NcoI和SphI酶切位點(diǎn)等后進(jìn)行PCR擴(kuò)增信號(hào)肽基因。

1.3.3 感受態(tài)制備

NZ3900感受態(tài)參考Holo等[11]的方法，略作修改。第1天挑取NZ3900單菌落接種于5 mL GM17中，30 ℃厭氧培育12 h，待12 h后，在10 mL SGM17中轉(zhuǎn)接入500 μL已活化12 h的菌液，30 ℃培養(yǎng)12 h。將10 mL培養(yǎng)液整體加至100 mL SGM17培養(yǎng)液中，30 ℃培育4 h后冰浴20 min，5 000 r/min離心10 min后棄上清液。滅菌預(yù)冷的40 mL溶液I重懸菌體，冰上靜置20 min離心棄上清液，25 mL預(yù)冷溶液II重懸菌體冰上靜置后離心取菌體。再用15 mL溶液I重懸菌體，冰上靜置20 min后離心棄上清液。最后加入1 mL溶液I重懸菌體，80 μL分裝，置于－80 ℃保存。

1.3.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

乳酸乳球菌表達(dá)載體構(gòu)建如圖1所示，提取的pNZ8149質(zhì)粒[12-13]與plnF基因在SphI和SacI限制性內(nèi)切酶作用雙酶切并進(jìn)行回收后，按照20 μL反應(yīng)體系（0.5 μL的T4 DNA連接酶，2 μL的10×T4 DNA Buffer，載體與PCR片段按照不同比例添加）在16 ℃過(guò)夜連接，與80 μL的NZ3900感受態(tài)混勻后在電阻200 Ω、電容25 μF、電場(chǎng)強(qiáng)度10 kV/cm條件下[14]進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇的菌液涂布于篩選培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)24 h。進(jìn)一步挑取平板上黃色生長(zhǎng)的菌株活化[15-16]并進(jìn)行菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證，并將其送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)。進(jìn)一步將usp45信號(hào)肽基因按照如上步驟與重組質(zhì)粒進(jìn)行結(jié)合。

圖1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow chart for the construction of recombinant expression vector

1.3.5 PlnF蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與抑菌活力的測(cè)定

將pNZ8149-usp45-plnF乳酸乳球菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步純化后，接種于M17培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后再次接種于新鮮的5 mL GM17培養(yǎng)基中，待OD600nm至0.4左右后，加入終質(zhì)量濃度為1 ng/mL的Nisin分別誘導(dǎo)表達(dá)3、4、5、6 h。12 000 r/min離心3 min[17]，取上清液和菌體，以超低溫反復(fù)凍融和超聲破碎提取胞內(nèi)蛋白，并經(jīng)一定的透析濃縮處理后，采用牛津杯擴(kuò)散法[18]測(cè)定上清液和胞內(nèi)蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。進(jìn)一步使用Tricine-SDS-PAGE和納升液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜（nano liquid chromatography-electrospray ionizationtandem mass spectrometry，nano LC-ESI-MS/MS）對(duì)PlnF蛋白進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理和圖像處理

抑菌實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次，以SPSS軟件對(duì)抑菌圈大小進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；DNA凝膠電泳結(jié)果均在biotop凝膠成像系統(tǒng)上采集。

2 結(jié)果與分析

2.1 plnF基因的擴(kuò)增

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results

由圖2可知，以植物乳桿菌T4和T8為模板對(duì)plnF基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在150～200 bp之間出現(xiàn)明顯的單一條帶；此外，為使ups45信號(hào)肽基因插入pNZ8149中起到胞外分泌的作用，在引物上下游添加NcoI和SphI酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基之后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)在100 bp上方出現(xiàn)了與預(yù)期一致的條帶，將條帶送去測(cè)序并比對(duì)后證明目標(biāo)條帶分別與plnF和usp45信號(hào)肽基因具有100%的相似度，表明PCR擴(kuò)增過(guò)程中目標(biāo)基因沒(méi)有突變。

2.2 乳酸乳球菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

圖3 乳酸乳球菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證Fig.3 Validation of Lactococcus lactis-positive transformants

由于NZ3900感受態(tài)是乳糖缺陷型菌株，而質(zhì)粒pNZ8149攜帶乳糖分解酶基因，所以當(dāng)重組質(zhì)粒正確轉(zhuǎn)入NZ3900感受態(tài)后，菌落周圍會(huì)在平板上呈現(xiàn)為黃色。挑選黃色的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增如圖3A所示，3號(hào)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在150 bp附近出現(xiàn)了與預(yù)期一致的條帶，經(jīng)進(jìn)一步的測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證pNZ8149-plnF重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)一步將usp45信號(hào)肽基因與pNZ8149-plnF質(zhì)粒進(jìn)行重組，經(jīng)PCR擴(kuò)增、雙酶切驗(yàn)證（圖3B、3C）、測(cè)序和顯色篩選驗(yàn)證表明，pNZ8149-usp45-plnF乳酸乳球菌重組質(zhì)粒成功，將驗(yàn)證正確的乳酸乳球菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子甘油保存于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 重組乳酸乳球菌工程菌抑菌活力的鑒定

在NZ3900/pNZ8149的乳酸菌表達(dá)體系中，低劑量的Nisin可以有效誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)，所以以終質(zhì)量濃度1 ng/mL的Nisin對(duì)工程菌分別誘導(dǎo)3、4、5、6 h后通過(guò)牛津杯擴(kuò)散法對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果測(cè)定。在圖4中，與空載體對(duì)比可知，僅誘導(dǎo)3 h的工程菌上清液中目的蛋白表達(dá)量較少，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果不顯著，僅在9 mm左右，隨著Nisin誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，工程菌上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)誘導(dǎo)5 h時(shí)上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈增至（13.73±0.15）mm，誘導(dǎo)6 h的上清液抑菌圈為（14.03±0.23）mm。并且從誘導(dǎo)4 h開(kāi)始，工程菌胞內(nèi)蛋白對(duì)于致病菌也逐漸具有了一定的抑菌效果，這表明在乳酸乳球菌表達(dá)載體中起胞外表達(dá)的usp45信號(hào)肽被正確識(shí)別，目的蛋白主要以胞外可溶形式存在，且部分蛋白可能由于表達(dá)過(guò)多而積累在胞內(nèi)。一系列結(jié)果表明，Nisin誘導(dǎo)的NZ3900/pNZ8149-usp45-plnF表達(dá)載體，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)于蛋白的表達(dá)量有影響[19]。選取具有抑菌效果的6 h的表達(dá)蛋白進(jìn)行的Tricine-SDS-PAGE和nano LC-ESI-MS/MS分析。

圖4 表達(dá)蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圖Fig.4 Antimicrobial activity of the expressed protein against Staphylococcus aureus

2.4 重組質(zhì)粒的Tricine-SDS-PAGE和nano LC-ESI-MS/MS分析

由抑菌實(shí)驗(yàn)可知，誘導(dǎo)表達(dá)6 h工程菌上清液和胞內(nèi)蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌都具有一定的抑菌效果，所以分別取兩者進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE后，如圖5所示，以pNZ8149/NZ3900為對(duì)照，工程菌上清液在5.8～7.8 kDa附近出現(xiàn)一條與預(yù)期5.9 kDa相近的條帶。進(jìn)一步通過(guò)nano LC-ESI-MS/MS分析，結(jié)果于uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果后制作如圖6所示系統(tǒng)樹(shù)[20]，目的片段與PlnF抗菌肽（編號(hào)F9UU07）具有97.6%的同源性，表明工程菌以胞外表達(dá)形式正確表達(dá)了PlnF蛋白。

圖5 pNZ8149-PlnF的Tricine-SDS-PAGE圖Fig.5 The Tricine-SDS-PAGE of pNZ8149-PlnF

圖6 目標(biāo)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the target protein

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，抗生素反復(fù)刺激使大腸桿菌在自身質(zhì)粒中通過(guò)基因重組的方式整合了cfr耐藥基因，從而形成耐藥性的“超級(jí)細(xì)菌”，在臨床上也有越來(lái)越多的耐藥性葡萄菌屬致病菌被發(fā)現(xiàn)[21-22]，而現(xiàn)有的臨床抗生素對(duì)這些耐藥菌株的治療效果越來(lái)越小，嚴(yán)重危害了人身健康，迫切需要研究開(kāi)發(fā)一些安全、天然、有效抑制耐藥性菌株生長(zhǎng)的抗菌劑?？咕氖怯?0～60 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小于10 kDa的低分子質(zhì)量、具有熱穩(wěn)定的多肽，從昆蟲(chóng)、植物、哺乳動(dòng)物、微生物等天然途徑提取，主要通過(guò)直接破壞微生物的膜結(jié)構(gòu)從而對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌起到抑制生長(zhǎng)的作用[23-24]，被公認(rèn)為是一類潛在的可以替代抗生素的制劑。由于抗菌肽具有選擇性抑菌的特性，所以需要篩選合適的抗菌肽應(yīng)用于不同適應(yīng)癥。例如，Joseph等[25]從篩選出的短鏈抗菌肽DASamP1在體外抑菌實(shí)驗(yàn)中可有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300；以及表達(dá)的植物細(xì)菌素Pln1[26]對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、單核細(xì)胞性李斯特菌等革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的抑菌效果。但是抗菌肽在天然產(chǎn)物中含量較少，提取較為復(fù)雜，以及低產(chǎn)量也限制了抗菌肽的應(yīng)用，所以期望以基因工程技術(shù)來(lái)大量獲得抗菌肽。

本課題組前期從多種家庭自制發(fā)酵食品中篩選出多株具有抑菌效果的乳酸菌，發(fā)現(xiàn)有7 株菌抑制金黃色葡萄球菌效果較好。根據(jù)GenBank中乳酸菌抗菌肽基因設(shè)計(jì)合成了5 對(duì)引物，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)這些基因進(jìn)行克隆與表達(dá)從而驗(yàn)證哪一種抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PlnF對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好。相較于大腸桿菌表達(dá)載體克隆表達(dá)的蛋白處理復(fù)雜和畢赤酵母的長(zhǎng)時(shí)間培育[27-28]，乳酸乳球菌具有培養(yǎng)時(shí)間短，且表達(dá)產(chǎn)物可直接應(yīng)用于食品之中等優(yōu)點(diǎn)[29-30]，為后續(xù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了便捷。

本研究采用乳酸乳球菌Nisin誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)pNZ8149/NZ3900，首先從植物乳桿菌T4、T8中擴(kuò)增plnF基因，進(jìn)一步添加usp45信號(hào)肽基因以構(gòu)建胞外分泌的重組質(zhì)粒pNZ8149-usp45-plnF。構(gòu)建成功的重組菌經(jīng)1 ng/mL Nisin分別誘導(dǎo)3、4、5、6 h，結(jié)果表明，在3～4 h的誘導(dǎo)時(shí)間里，上清液對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果逐漸增加，誘導(dǎo)至5 h后，上清液抑菌效果增加速率逐漸減緩，誘導(dǎo)6 h的上清液對(duì)金黃色葡萄球菌具有（14.03±0.23）mm的抑菌圈。而在構(gòu)建重組質(zhì)粒過(guò)程中，重組質(zhì)粒對(duì)電轉(zhuǎn)化效率影響較大，所以在提取pNZ8149質(zhì)粒和目的基因的過(guò)程中應(yīng)將其濃縮，以減少電轉(zhuǎn)化時(shí)濃度不足的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Nisin誘導(dǎo)的食品級(jí)分泌表達(dá)載體克隆表達(dá)的PlnF抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，為開(kāi)發(fā)新型的天然來(lái)源的抗菌劑提供了一定基礎(chǔ)。