彭 博，李炳娟,，關文強,，林 瓊

（1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇、紐扣蘑菇等，是世界市場上最常見的食用栽培蘑菇，其風味鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者的喜愛[1]。但是雙孢蘑菇組織細嫩且菌蓋無明顯的保護結構，在采后貯藏和流通過程中極易發(fā)生褐變，從而影響蘑菇的質量，使商品貶值，導致一定的經(jīng)濟損失[2-3]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）被認為是引起雙孢蘑菇褐變的主要酶類，包括酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶（laccase，LAC）。酚類底物在PPO的作用下氧化形成易聚合生成黑色素的醌類物質，加速雙孢菇褐變。因此，探究雙孢蘑菇在貯藏過程中PPO的調控機理對后期改良雙孢蘑菇品質具有關鍵指導意義。

近年關于PPO的研究大多基于酶特性和基因角度進行研究。目前，已有鴨梨[4]、草莓[5]、陸地棉[6]、馬鈴薯[7]等多個植物PPO基因被克隆。在雙孢蘑菇PPO基因研究中，Wichers等[8]通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應獲得cDNA片段，篩選出2 個全長為1.8 kb和1.9 kb的基因AbPPO1和AbPPO2；Li Nanyi等[2]通過同源克隆和RACE獲得AbPPO3和AbPPO4，分別編碼66、68 kb的蛋白；Weijn等[9]獲得AbPPO5和AbPPO6的編碼序列；冉欣欣[10]研究表明，在不同發(fā)育階段，不同貯藏時期的雙孢蘑菇子實體PPO基因家族成員的表達存在差異性。但由于雙孢蘑菇PPO調控褐變機理相關的轉錄組學及基因組學信息匱乏，研究進程緩慢，因此，有必要探索雙孢蘑菇基因組數(shù)據(jù)進行基因發(fā)現(xiàn)和功能研究。

隨著新一代高通量測序技術發(fā)展，轉錄組測序技術因其具有通量大、低成本、高分辨率、高靈敏度、檢測范圍廣、不需克隆且操作簡單等優(yōu)點成為轉錄組研究的主要手段[11-16]。近年來，轉錄組測序技術在食用菌中得到廣泛應用。Tang Lihua等[17]利用高通量測序技術對3 種不同條件下生長的香菇菌絲體進行轉錄組測序，篩選出香菇與光誘導褐色膜形成相關的基因。易琳琳[18]通過新一代高通量測序技術對2 種不同處理方式的香菇子實體測序，篩選出15 個與細胞壁代謝相關酶相關基因。吳小梅等[19]利用轉錄組測序技術對3 個不同發(fā)育時期的蘑菇進行轉錄組測序，篩選出2 個發(fā)育關鍵基因和8 個與發(fā)育相關的基因。

本實驗采用轉錄組測序技術對采后4 ℃貯藏第1、7和14天的雙孢蘑菇菌蓋進行測序，擬從轉錄組水平分析雙孢蘑菇在不同貯藏時間基因的表達差異，進而對這些差異基因進行GO（Gene Ontology）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，同時篩選與褐變相關的基因，為今后雙孢蘑菇褐變的研究和品質改良等提供一定的理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇采自天津市閩中食用菌種植基地，采取新鮮健康、無開傘、色澤潔白、大小均一（直徑3～4 cm）的優(yōu)質蘑菇置于泡沫盒中，立即運往實驗室，置于4 ℃貯藏。

Trizol?Reagent 美國Life Technologies公司；三氯甲烷（氯仿） 青島精科儀器試劑有限公司；鄰苯二酚天津市贏達稀貴化學試劑廠；無水乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TG16-WS臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；NanoPhotometer?分光光度計 美國Implen公司；2100生物分析儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將雙孢蘑菇分裝入聚乙烯包裝袋中，置于（4±0.5）℃冰溫庫中預冷24 h后封口貯藏。以預冷后24 h的第1天設置為1 d，分別在1、7、14 d隨機取3 袋，取雙孢蘑菇的菌蓋切碎，置于液氮速凍，分別記為Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14。

1.3.2 褐變度的測定

參照Lei Jing等[20]的方法：準確稱取2 g液氮速凍的雙孢蘑菇菌蓋組織，加入5 mL預冷的95%乙醇溶液，冰浴研磨成漿，于4 ℃、8 000 r/min離心10 min。取上清液，測定其410 nm波長處吸光度，即褐變度。

1.3.3 總RNA的提取與測序文庫的構建

圖1 cDNA文庫的構建Fig.1 Construction of cDNA library

采用Trizol法[21]提取雙孢菇菌蓋RNA，利用NanoPhotometer?分光光度計檢測RNA濃度、OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm值。利用生物分析儀精確檢測RNA完整性（用RIN表示）和25S/18S值。RNA樣品標準質量濃度不低于250 ng/μL，OD260nm/OD280nm值應介于1.8～2.2之間，OD260nm/OD230nm值不小于1.8，RIN不低于6.5，25S/18S值不低于1.0。樣品檢測合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司進行cDNA文庫的構建（圖1）及高通量測序。

1.3.4 轉錄組測序數(shù)據(jù)分析

1.3.4.1 序列數(shù)據(jù)質量評估及與參考基因組比對

高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別分析轉化為原始測序序列，為保證信息分析質量，必須對原始序列進行過濾，得到clean reads，后續(xù)分析都基于clean reads。

選取HISAT軟件將過濾后的測序序列進行基因組定位分析。HISAT能夠有效地比對RNA seq測序數(shù)據(jù)中的spliced reads，是目前比對率最高且最準確的比對軟件。

1.3.4.2 差異表達基因篩選及聚類分析

使用FPKM法估算基因表達水平，對read count進行標準化，然后根據(jù)模型進行假設檢驗概率（P值）的計算，最后進行多重假設檢驗校正，得到錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR)。按照∣log2（兩組樣品表達量比值）∣＞1且q＜0.005的原則篩選DEGs。

聚類分析用于判斷DEGs在不同貯藏時間下的表達模式。以不同貯藏時間的差異基因FPKM值為表達水平，做層次聚類分析，不同顏色的區(qū)域代表不同的聚類分組信息，同組內(nèi)的基因表達模式相近，可能具有相似的功能或參與相同的生物學過程。

1.3.4.3 GO富集分析和Pathway富集分析

根據(jù)實驗目的篩選差異基因后，富集分析研究差異基因在GO中的分布狀況以期闡明實驗中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。根據(jù)挑選出的差異基因計算這些差異基因同GO分類中某幾個特定分支的超幾何分布關系，通過假設驗證得到一個特定p值，進而判斷差異基因在該GO中出現(xiàn)富集的情況。在分析中GO富集分析采用的軟件方法為GO seq[22]。

在生物體內(nèi)，通過Pathway顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。作為Pathway相關的主要公共數(shù)據(jù)庫[23]，KEGG是進行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡研究的強有力工具。Pathway顯著性富集分析以KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出在差異表達基因中顯著性富集的Pathway。FDR≤0.05時，表示差異基因在該Pathway中顯著富集，使用KOBAS（2.0）進行Pathway富集分析。

1.3.5 PPO活性的測定

參考Mdelosa等[24]的方法并稍作修改。準確稱取1 g液氮速凍的雙孢蘑菇菌蓋組織研磨成粉，加入8 mL預冷的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5）研磨成漿后，于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，取上清液（即粗酶液）于4 ℃冰箱中備用。室溫下，取2.9 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5）、1.0 mL 0.1%鄰苯二酚和1.0 mL PPO粗酶液于10 mL試管中混勻后開始計時，測量420 nm波長處吸光度的變化。以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5）和0.1%鄰苯二酚為底物，在25 ℃、pH 6.5和波長420 nm處吸光度每分鐘變化0.01為1 個酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007、Origin 8、SPSS 16.0和PowerPoint 2007等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及圖像處理。

2 結果與分析

2.1 雙孢蘑菇貯藏時間褐變度的變化

圖2 采后雙孢蘑菇4 ℃貯藏時間褐變度的變化Fig.2 Changes in browning degree during storage of A. bisporus at 4 ℃

由圖2可知，在4 ℃貯藏時間雙孢蘑菇褐變度隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。果蔬采后運輸和加工過程中易產(chǎn)生黑色素而引起褐變，會影響果蔬的銷售及其營養(yǎng)價值。為進一步探究雙孢蘑菇褐變的機理，利用轉錄組測序技術對其進行后續(xù)研究。

2.2 RNA質量檢測

表1 雙孢蘑菇3 組樣品RNA質量檢測Table1 Evaluation of total RNA extracted from three samples of A. bisporus

由表1可知，所提取的3 組RNA質量較好，可以進行文庫構建以及后續(xù)測序分析。

2.3 轉錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

表2 3 組樣品數(shù)據(jù)產(chǎn)出質量情況Table2 Quality assessment of sequencing output data of three samples

為探究雙孢蘑菇采后貯藏過程中的變化機制，對雙孢蘑菇菌蓋3 個貯藏時間的轉錄組進行測序，共獲得176 329 392 個原始片段，對原始片段過濾后，獲得168 607 212 個剩余片段。由表2可知，Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14三組的Q20值分別為96.49%、96.43%和96.99%，Q30值分別為91.26%、91.12%和92.18%，GC相對含量分別為49.61%、49.67%和49.57%。綜上，轉錄組測序數(shù)據(jù)的數(shù)量和質量較高，可用于后續(xù)分析。

由表3可知，Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14三組轉錄組測序獲得的clean reads中，能定位到基因組上的reads片段有135 603 695 個，占比78.89%～82.5%，在參考序列上有多個比對位置的reads片段有1 627 747 個，占比0.93%～1.04%，在參考序列上有唯一比對位置的reads片段有133 975 948 個，占比77.84%～81.58%，比對到基因組上正鏈的reads片段有66 778 656 個，占比38.69%～40.67%，比對到基因組上負鏈的reads片段有67 197 292 個，占比39.16%～40.91%。能定位到基因組上的reads片段中，分段比對到兩個外顯子上的reads片段有61 654 288 個，占比35.45%～37.83%，整段比對到外顯子的reads片段有72 321 660 個，占比41.63%～43.74%。

表3 Reads與參考基因組比對情況Table3 Results of mapping relative to the reference genome

樣品間基因表達水平相關性用皮爾遜相關系數(shù)的平方（R2）表示。相關系數(shù)R2越接近1，表明樣品之間表達模式的相似度越高。由圖3可知，Pile_C1與Pile_C7間的相關系數(shù)R2為0.927，Pile_C1與Pile_C14間的相關系數(shù)R2為0.845，Pile_C7與Pile_C14間的相關系數(shù)R2為0.917，說明結果可靠且樣本選擇合理。

圖3 Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14三組樣品間相關系數(shù)Fig.3 Correlation coefficients between Pile_C, Pile_C7 and Pile_C14

2.4 差異表達基因篩選結果

圖4 差異表達基因維恩圖Fig.4 Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs)

圖5 不同貯藏時間雙孢蘑菇菌蓋差異表達基因火山圖Fig.5 Volcano diagram of DEGs in A. bisporus pilei at different storage periods

由圖4、5可知，Pile_C7與Pile_C1比較，共篩選出727 個差異表達的基因，其中Pile_C7組相對于Pile_C1組上調基因354 個，占總差異表達48.7%，下調基因373 個，占總差異表達51.3%。Pile_C14與Pile_C1比較，共篩選出1 524 個差異表達的基因，其中Pile_C14組相對于Pile_C1組上調基因768 個，占總差異表達50.4%，下調756 個，占總差異表達49.6%。

為判斷差異基因在不同實驗條件下的表達模式，篩選了95 個差異基因采用熱圖形式對其進行聚類分析。圖6顯示了95 個基因的聚類相關性，其中，38 個基因在貯藏過程中表達量呈下降趨勢；3 個基因在貯藏1 d有較低表達，7 d表達量較高，14 d顯著降低；11 個基因在貯藏1 d表達量較低，7 d和14 d表達量較高；6 個基因在貯藏7 d表達量較低，14 d表達量顯著升高；14 個基因在貯藏過程中表達量逐漸升高；14 個基因在貯藏1 d和7 d表達量較低，14 d表達量較高。

圖6 雙孢蘑菇菌蓋差異表達基因聚類圖Fig.6 Clustering analysis of DEGs in A. bisporus pilei

2.5 差異表達基因GO富集分析

圖8 雙孢蘑菇Pile_C14 vs Pile_C1差異基因GO富集結果Fig.8 GO function of DEGs of A. bisporus in Pile_C14 vs Pile_C1

對不同貯藏時間的雙孢蘑菇菌蓋DEGs進行GO富集分析，鑒于差異表達基因數(shù)目較多，本研究僅對GO三大功能類別靠前的條目進行富集分析。由圖7可知，對Pile_C7和Pile_C1組進行顯著富集，細胞組分、生物過程和分子功能三大功能類別分別包含了4、16 個和23 個功能分類。細胞組分類別中，富集到胞質的差異基因較多；生物過程類別中，富集到氧化還原過程、磷代謝過程和糖代謝的差異基因較多；分子功能中，富集到水解酶活性、核苷酸結合、核苷磷酸結合和陽離子結合的差異基因較多。對Pile_C14和Pile_C1組進行顯著富集，由圖8可知，細胞組分、生物過程和分子功能三大功能類別分別包含了8、21 個和19 個功能分類。細胞組分類別中，富集到膜和細胞器的差異基因較多；生物過程類別中，富集到氧化還原過程和有機氮化合物代謝；分子功能中，富集到氧化還原活性和陽離子結合的差異基因較多。

2.6 差異表達基因Pathway顯著性富集分析

雙孢蘑菇Pile_C7組與Pile_C1組差異表達基因中共有459 個基因被注釋到83 條KEGG代謝通路中；Pile_C14組與Pile_C1組差異表達基因中共有876 個基因被注釋到97 條KEGG代謝通路中，其中包含10 條顯著性富集代謝通路，分別是類固醇生物合成、氨酰-tRNA生物合成、抗生素生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝、氧化磷酸化、半乳糖代謝、甘油脂代謝、磷酸戊糖途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成，這些途徑大都與雙孢蘑菇生理代謝相關。

2.7 褐變相關差異表達基因篩選

圖9 褐變相關基因篩選結果Fig.9 Screening of browning-related genes

由圖9可知，從3 組雙孢蘑菇菌蓋在不同貯藏時間的差異表達基因中篩選出與多酚氧化酶相關的基因有5 個，這些基因包括多酚氧化酶基因和漆酶基因。其中，PPO3（18 085 507）在貯藏第7天時表達量最低，在貯藏第14天時基因表達量上調，這與Li[2]和Lei Jing[20]等的研究結果一致。PPO1（18 082 695）在貯藏時間表達量下調。LAC4（18 085 498）、PPO5（18 078 406）和LAC1（18 080 537）3 個基因表達量在貯藏期間呈上調趨勢，且在第7天和第14天期間基因表達量顯著上調。

基因表達分析結果表明，在雙孢蘑菇不同貯藏時間PPO家族成員的表達具有差異性，漆酶基因LAC1和LAC4在貯藏時間表達量呈上升趨勢。吳小梅[19]的研究結果表明漆酶基因在紐扣期至成熟早期表達量穩(wěn)步增加，在成熟期表達量達到最高，與本研究結果一致。吳光美等[25]的研究表明fv-lac4基因隨著原基出現(xiàn)表達量開始增加，且菌蓋中表達量低于菌柄，這一研究結果也表明該基因可能與雙孢蘑菇褐變無關。卓睿等[26]研究表明糙皮側耳漆酶基因lacc4在原基分化期高表達，推測其可能與原基分化相關。

2.8 雙孢蘑菇貯藏時間PPO活性變化

圖10 采后雙孢蘑菇4 ℃貯藏時間PPO活性的變化Fig.10 Changes in PPO activity during storage of A. bisporus at 4 ℃

從圖10可以看出，雙孢蘑菇PPO活性隨貯藏時間的延長逐漸增強。Lei Jing等[20]研究結果表明AbPPO1基因表達的影響模式與其對褐變度和PPO活性的影響模式不一致，而AbPPO3基因與褐變度和PPO活性的影響模式一致，認為AbPPO1基因可能不參與雙孢蘑菇褐變的形成，AbPPO3參與雙孢蘑菇的褐變。PPO是引起雙孢蘑菇褐變的主要酶，其主要通過將酚類物質氧化為醌，進一步產(chǎn)生黑色素，從而導致雙孢蘑菇褐變的發(fā)生。將PPO活性與PPO3基因表達做Pearson相關性分析得到系數(shù)為－0.777，表明兩者具有一定的相關性，與轉錄組測序結果具有一致性。Van Leeuwen等[27]研究表明，雙孢蘑菇菌蓋皮層褐變程度與PPO活性呈正相關關系，與本實驗研究結果一致。

3 結 論

4 ℃貯藏時間雙孢蘑菇褐變度隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，并對此條件下的雙孢蘑菇菌蓋轉錄組進行Illumina HiSeqTM高通量測序，共獲得176 329 392 個raw reads，168 607 212 個高質量的clean reads。按照︱log2（兩組樣品表達量比值）︱＞1且q＜0.005的原則，Pile_C7與Pile_C1組共篩選出727 個差異表達基因，Pile_C14與Pile_C1組共篩選出1 524 個差異表達基因。GO功能富集結果顯示，Pile_C7與Pile_C1組中，胞質、氧化還原過程和水解酶活性分別是細胞組分、生物過程和分子功能富集最多的條目；Pile_C14與Pile_C1組中，膜、氧化還原過程和氧化還原活性分別是細胞組分、生物過程和分子功能富集最多的條目。Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，Pile_C7與Pile_C1組中459 個差異表達基因被成功注釋到83 條KEGG代謝通路中；Pile_C14與Pile_C1組中876 個差異表達基因被成功注釋到97 條KEGG代謝通路中，其中10 條為顯著富集通路（P＜0.05）。從獲得的差異表達基因中篩選得到5 個多酚氧化酶相關基因，PPO3、PPO1、PPO5、LAC1和LAC4。雙孢蘑菇多酚氧化酶活性隨貯藏時間的延長逐漸增強，與轉錄組測序結果有一致性。研究結果為進一步分析差異基因與褐變的調控關系，及為雙孢蘑菇品種改良提供科學依據(jù)。