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        氧化條件下茶多酚對豬肉肌原纖維蛋白理化和凝膠特性的影響

        2019-01-28 08:06:10康大成郭燕云
        食品科學 2019年2期

        李 玲,季 慧,康大成,周 怡,郭燕云

        (臨沂大學生命科學學院,山東 臨沂 276000)

        肌原纖維蛋白是肉類中含量最高的重要蛋白質,占總蛋白的55%~60%,適宜的加工處理可以使其形成穩(wěn)定的網絡結構,從而賦予肉制品良好的凝膠特性和感官特性,也是人們日常生活中優(yōu)質蛋白的主要來源[1-2]。然而,最近流行病學報道[3]過度食用腌制或加工紅肉制品與心血管疾病和結腸癌存在一定聯系,這可能與攝入的肉類食品在加工保藏和隨后消化過程中蛋白質氧化程度提高有關,蛋白質氧化會影響產品的感官質量或加工特性,甚至影響消費者的健康安全[4]。蛋白質氧化會導致蛋白質側鏈基團修飾,蛋白質大分子發(fā)生交聯聚集等,進而引起蛋白質功能發(fā)生顯著改變,如凝膠特性、持水性和乳化性等,從而影響肉制品的色澤、保水性和口感[5]。因此控制蛋白質氧化,提高蛋白質的凝膠性能是近年來急需解決的首要問題。

        植物多酚來源于天然植物提取物,因其抗氧化活性高而被廣泛應用于食品工業(yè)中。近年來酚類化合物應用到肉制品加工的研究較多,比如5%玫瑰提取物可以阻止牛肉餅中的蛋白質和脂質氧化[6],500 mg/kg茶多酚可以降低肉糜制品中脂肪氧化硫代巴比妥酸反應物含量和蛋白質羰基含量,但是增加了肉糜凝膠的蒸煮損失,降低了肉糜中蛋白的巰基和二硫鍵含量[7]。低濃度綠茶提取物能保持肉蛋白結構和氧化穩(wěn)定性,而高濃度綠茶提取物導致肉的持水力降低,質構變差[8]。低濃度綠原酸能有效抑制羰基的生成,適量綠原酸可抑制蛋白質的氧化[9],低濃度綠原酸使肌原纖維蛋白結構展開,凝膠增強,高濃度綠原酸使蛋白質交聯聚集,溶解度下降,凝膠被破壞[10]。茶多酚是肉制品加工中常用的抗氧化劑之一,主要由兒茶素類多酚組成。茶多酚能夠結合自由基,保護蛋白質巰基免受自由基的攻擊,阻止氧化引起的二硫鍵交聯[7],而多酚對蛋白質側鏈結構的影響研究很少,關于多酚對蛋白質凝膠性能和持水性的研究有待繼續(xù)探討。

        采用羥自由基模擬氧化體系,以茶多酚為抗氧化劑,研究多酚質量濃度對肌原纖維蛋白游離巰基、表面疏水性、二聚酪氨酸含量以及內源色氨酸熒光強度等蛋白質理化特性的影響,以及肌原纖維蛋白凝膠特性與多酚質量濃度的關系,闡明茶多酚對蛋白質氧化程度與凝膠水分分布之間的關系,為凝膠類肉制品的加工提供一定的理論依據。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        豬背最長肌 南京蘇果超市;茶多酚(純度98%) 臨沂鑫正實驗器材有限公司;KCl、MgCl2、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylene bis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid,EGTA)、Na2HPO4、NaCl、NaOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉、溴酚藍(bromophenol blue,BPB)、FeCl3、抗壞血酸、H2O2、HCl、三羥甲基氨基甲烷(tris (hydroxymethyl) methyl aminomethane,Tris)、甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、水溶性VE(Trolox)(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

        1.2 儀器與設備

        Allegra 25R高速冷凍離心機 美國Beckman公司;F-4600熒光分光光度計 日本日立公司;PQ001核磁共振分析儀 上海紐邁電子設備有限公司;H-S4數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;優(yōu)普UPW系列超純水器成都超純科技有限公司;Spectrum紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司;CR-400色差儀 柯尼卡美能達光學有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

        參考Park[11]和Feng Xianchao[12]等方法并略作修改。取新鮮豬背最長肌,用刀剔除豬肉上多余的筋膜、脂肪后,將豬肉切成均勻的小塊并用絞肉機攪碎后稱質量,所得肉糜用于提取豬肉肌原纖維蛋白。稱取50 g肉樣,加4 倍體積pH 7.0緩沖液(0.1 mol/L KCl,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EDTA,10 mmol/L Na2HPO4),勻漿離心,棄上清液,取沉淀重復上述步驟3 遍。沉淀再加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl洗液,勻漿離心,棄上清液,沉淀重復洗滌2 次,第3次加洗液勻漿后,用4 層紗布過濾以除去結締組織等,最后用0.1 mol/L HCl溶液調pH值為6.2后離心去上清液,所得膏狀物為肌原纖維蛋白。

        1.3.2 羥自由基氧化體系的構建

        參考Xiong Youling等[13]的方法構建羥自由基氧化體系。首先用20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)將肌原纖維蛋白稀釋為50 mg/mL,配制10 mg/mL茶多酚溶液,根據預實驗確定本研究中茶多酚質量濃度梯度。在溶解后的蛋白質溶液中依次加入FeCl3、抗壞血酸、H2O2溶液用來構建羥自由基的模擬氧化體系,并且整個體系最終含有以下成分:40 mg/mL豬肉肌原纖維蛋白、0.01 mmol/L的FeCl3、0.1 mmol/L的VC和10 mmol/L H2O2,其中茶多酚質量濃度分別為0、0.02、0.2、1 mg/mL。在4 ℃恒溫操作間氧化12 h后,用1 mmol/L Trolox/EDTA終止氧化反應,即為氧化后的豬肉肌原纖維蛋白,貯藏于0~4 ℃,2 d內用完。以未加茶多酚和氧化劑的蛋白溶液作為空白對照組。

        1.3.3 物理化學性能的測定

        游離巰基含量采用DTNB法[14]進行測定:將樣品用不含尿素的TGB(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸,4 mmol/L EDTA,pH 8.0)緩沖溶液稀釋至1 mg/mL,吸取1.5 mL,加入15 μL Ellman試劑(DTNB),振蕩1 h,使之充分反應,離心(12 000×g,10 min)后取上清液,在412 nm波長處測定吸光度。

        疏水性測定采用溴酚藍結合法進行:參照Chelh等[15]描述的方法將肌原纖維蛋白用20 mmol磷酸鹽緩沖溶液稀釋為5 mg/mL的蛋白溶液。取1 mL加入0.2 mL的1 mg/mL溴酚藍溶液,充分混勻,離心取上清液,測定595 nm波長處的吸光度。

        二聚酪氨酸含量參考Davies等[16]方法:利用酶標儀測定吸光度,激發(fā)波長325 nm,發(fā)射波長420 nm,狹縫寬度10 nm,靈敏度2。最終二聚酪氨酸含量用熒光強度表示。

        內源色氨酸熒光強度的變化通過F-4600熒光分光光度儀進行檢測:用15 mmol/L PIPES緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH 6.25)將樣品稀釋為蛋白質量濃度0.1 mg/mL,吸取0.1 mL置于石英比色皿中,室溫條件下于283 nm波長處激發(fā),記錄300~400 nm波長范圍的發(fā)射光譜供后續(xù)分析。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設置為5 nm,電壓為700 V。

        1.3.4 熱誘導凝膠的制備及性能測定

        將氧化后的豬肉肌原纖維蛋白質量濃度調至40 mg/mL后,在80 ℃水浴30 min,制得凝膠,用于測定其蒸煮得率、白度、保水性及凝膠水分分布分析。

        1.3.4.1 蒸煮得率

        蛋白凝膠稱量后,80 ℃水浴30 min,冷卻至室溫,將凝膠倒置于濾紙上,用濾紙吸干水分,然后稱量凝膠質量。蒸煮得率以蒸煮后質量與蒸煮前質量的比值計算。

        1.3.4.2 凝膠白度

        用色差儀測定蛋白凝膠的色差值,其中亮度值L*、紅度值a*、黃度值b*。儀器經零點白板校正后進行樣品測定,每組測定3 次,取平均值。按式(1)計算白度值W:

        1.3.4.3 凝膠保水性(water holding capacity,WHC)

        用離心法測定凝膠WHC,將制備好的蛋白凝膠準確稱其質量后,于4 ℃ 、6 000×g離心15 min,記錄離心前后離心管的質量以及空管質量。按式(2)計算WHC:

        式中:m為空管質量/g;m1為離心前離心管與凝膠的質量/g;m2為離心后離心管與凝膠的質量/g。

        1.3.4.4 凝膠水分分布

        低場核磁數據測量參考Han Minyi[17]和Ji Hui[18]等的方法進行。測定條件:質子共振頻率為22.6 MHz,測量溫度為32 ℃。將大約1.0 g樣品放入直徑15 mm核磁管中,隨后立即放入PQ001核磁共振成像儀中進行分析。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列測定樣品弛豫時間T2值。不同弛豫時間各峰面積分別記為P21、P22和P23。

        1.4 數據處理

        所有實驗重復進行3 次,每次重新提取肌原纖維蛋白。用SPSS 18.0統計軟件進行單因素方差分析和Duncan’s進行多重比較,結果表示為。

        2 結果與分析

        2.1 茶多酚對豬肉肌原纖維蛋白性能的影響

        2.1.1 茶多酚對豬肉肌原纖維蛋白中游離巰基含量的影響

        圖1 茶多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白游離巰基含量的變化Fig.1 Effect of tea polyphenols on free sulfydryl content of myof i brillar protein under oxidative conditions

        從圖1可以看出,空白對照組的游離巰基含量最高,而未添加茶多酚的氧化處理組游離巰基含量明顯低于空白對照組,兩組差異顯著(P<0.05),說明氧化處理后游離巰基被氧化成二硫鍵,游離巰基含量降低,巰基氧化被認為是蛋白質氧化最初的反應之一[12]。胡忠良等[19]研究發(fā)現隨著氧化劑濃度的增加,游離巰基和總巰基含量降低,與本研究結果一致。此外,蛋白質的氧化變性形成蛋白質聚集體,會覆蓋一些巰基,使能夠檢測到的游離巰基數量減少,也可能導致巰基含量下降[20]。在羥自由基氧化條件下,0.02、0.2、1.0 mg/mL茶多酚組的游離巰基含量顯著高于0 mg/mL茶多酚組(P<0.05),并且游離巰基含量依次為1.0 mg/mL組>0.2 mg/mL組>0.02 mg/mL組,隨著茶多酚質量濃度的增加,豬肉肌原纖維蛋白中游離巰基含量呈上升的趨勢。茶多酚質量濃度為1.0 mg/mL時,樣品蛋白的游離巰基含量和空白對照組差異不顯著(P>0.05)。茶多酚有效抑制了羥自由基對蛋白質側鏈的氧化,在茶多酚添加量為0~1 mg/mL時,隨著質量濃度的增加,游離巰基含量升高,說明茶多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白側鏈基團具有保護作用。

        2.1.2 茶多酚對豬肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

        由圖2可知,氧化未添加茶多酚組的疏水性顯著高于空白對照組(P<0.05),說明氧化后表面疏水性增加,有更多的疏水性氨基酸暴露在分子表面,導致蛋白構象發(fā)生變化,或者蛋白質間發(fā)生聚集和交聯等反應[21]。

        圖2 茶多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of tea polyphenols on surface hydrophobicity of myof i brillar protein under oxidative conditions

        添加茶多酚后,表面疏水性隨茶多酚質量濃度的增加而降低,1 mg/mL組顯著低于空白對照組(P<0.05)。而有研究表明,在肌原纖維蛋白中添加不同量的綠原酸,表面疏水性持續(xù)增加[9]。產生這種差異的原因可能是茶多酚與綠原酸的結構不同,茶多酚中主要是黃烷醇類的兒茶素和表兒茶素,B環(huán)上都有3’,4’,5’-鄰三羥基,通常鄰位羥基越多,抗氧化活性越強;而綠原酸是咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸,其對DPPH和ABTS自由基的清除能力顯著小于茶多酚的黃烷醇類[22]。因此茶多酚的抗氧化能力強于綠原酸,其結合羥自由基的能力強。另外,可能是由于茶多酚與蛋白發(fā)生疏水相互作用,從而降低了溴酚藍與蛋白表面疏水基團的結合,疏水性降低,茶多酚起到很好地穩(wěn)定蛋白質結構的作用。

        2.1.3 茶多酚對豬肉肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響

        圖3 茶多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.3 Effect of tea polyphenols on dityrosine content of myof i brillar protein under oxidative conditions

        由圖3可知,氧化未加茶多酚組的二聚酪氨酸含量顯著高于空白對照組(P<0.05)。說明酪氨酸對羥自由基很敏感,易被氧化發(fā)生聚合反應而生成二聚酪氨酸,是蛋白質氧化程度檢測的指標之一。有研究2 種自由基氧化大黃魚肌原纖維蛋白時均發(fā)現,隨氧化劑濃度的升高,二聚酪氨酸含量顯著增加[23],這與本研究結果相一致。羥自由基氧化后,蛋白質通過共價和非共價相互作用形成蛋白聚合物,氨基酸側鏈受到自由基的攻擊,與其他活性氨基酸殘基發(fā)生共價交聯,從而形成了聚合物。

        隨著茶多酚添加量的增加,二聚酪氨酸含量降低。其中0.02 mg/mL茶多酚組與0 mg/mL茶多酚組差異不顯著(P>0.05),可能是因為茶多酚的添加量過低,沒有足夠多的酚羥基結合羥自由基。而茶多酚為0.2、1.0 mg/mL組中二聚酪氨酸含量顯著低于茶多酚為0 mg/mL的氧化組(P<0.05)。說明茶多酚具有明顯的抗氧化作用,抑制蛋白質側鏈氨基酸的聚合作用,降低了二聚酪氨酸的含量。而當茶多酚添加量為1.0 mg/mL時,二聚酪氨酸含量還要低于空白對照組,其原因可能是茶多酚的添加對蛋白質側鏈氨基酸保護作用,導致氨基酸被包埋,熒光強度降低。這與本研究中1.0 mg/mL組疏水性最低相一致,說明茶多酚起到保護蛋白質側鏈基團,不被氧化劑的破壞。

        2.1.4 茶多酚對豬肉肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光強度的影響

        圖4 茶多酚對氧化體系中對肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光強度的影響Fig.4 Effect of tea polyphenols on endogenous tryptophan fl uorescence intensity of myofibrillar protein under oxidative conditions

        由圖4可知,與空白對照組相比,氧化處理后的0 mg/mL茶多酚組熒光強度最低,可能是氧化后,蛋白空間結構有部分展開,內部的色氨酸暴露出來,導致內源熒光強度降低,這與前人[24]對肌原纖維蛋白氧化處理后熒光強度降低相一致。

        隨著茶多酚的添加,內源色氨酸熒光強度逐漸升高,1 mg/mL茶多酚組與空白對照組接近,且最大熒光強度由335 nm藍移到330 nm。其原因可能是茶多酚具有抗氧化作用,對肌原纖維蛋白具有保護作用,質量濃度越高,效果越好。而本研究中疏水性的結果證實,茶多酚質量濃度為1 mg/mL時,疏水性最低,蛋白結構得到很好地保護,從而內源色氨酸熒光強度高。有人研究沒食子酸氧化條件下色氨酸熒光強度的影響時也發(fā)現,隨著沒食子酸濃度(10、50、100 μmol/g)的增加,熒光強度增加[25],與本研究的趨勢一致。

        2.2 茶多酚對豬肉肌原纖維蛋白凝膠蒸煮得率、白度、保水性的影響

        表1 茶多酚對肌原纖維蛋白凝膠得率、白度和保水性的影響Table1 Effects of tea polyphenols on gel yield, whiteness and WHC of myof i brillar protein

        根據表1可知,空白對照組的蒸煮得率、白度和保水性都高于氧化未加茶多酚組,說明氧化處理后,蛋白質側鏈氨基酸結構受到破壞,蛋白構象發(fā)生變化,部分水分析出,形成汁液流失,導致凝膠的保水性降低[10]。氧化引起的二硫鍵交聯會阻礙熱誘導加工中有序二硫鍵的形成,降低蛋白質官能團之間的相互作用,使凝膠的保水性降低,質構變差[26]。氧化處理后,隨著茶多酚質量濃度的增加,蒸煮得率和保水性增加,1.0 mg/mL與0 mg/mL茶多酚組差異顯著(P<0.05),這可能是茶多酚具有較強結合自由基的能力,能延緩氧化進程,保護蛋白質側鏈結構,進而獲得較高的蒸煮得率和保水性。

        2.3 茶多酚對氧化體系中豬肉肌原纖維蛋白凝膠水分分布的影響

        圖5 肌原纖維蛋白凝膠水分子的T2弛豫特性Fig.5 T2 relaxation time spectra of heat-induced gels of myof i brillar protein

        由圖5可見,肌原纖維蛋白凝膠低場核磁水分分布在1~10 000 ms的弛豫時間內出現了3 個峰,這與韓敏義等[17]研究豬肉肌原纖維蛋白熱凝膠的實驗結果基本一致。T2值范圍內對應的3 個峰分別對應肌原纖維蛋白凝膠中3 種狀態(tài)的水:弛豫時間T21在0~15 ms之間,屬于凝膠中的結合水;弛豫時間T22在63~382 ms之間,屬于凝膠中的不易流動水;弛豫時間T23在714~2 171 ms之間,屬于凝膠中的自由水。弛豫時間T2在1~10 000 ms內對應的3 個峰的峰面積分別記為P21、P22、P23。

        表2 茶多酚對肌原纖維蛋白凝膠中各組分水所占比例的影響Table2 In fl uence of tea polyphenols on the proportions of three water forms in heat-induced myo fi brillar protein gels

        由表2可知,氧化處理后的0 mg/mL茶多酚組與空白對照組相比,不易流動水顯著減少(P<0.05),自由水顯著增加(P<0.05),說明氧化處理后,凝膠中的一部分不容易流動水可能會變成自由水,凝膠保水性降低,這與本實驗關于豬肉肌原纖維蛋白氧化后凝膠保水性降低的研究結果相一致??赡苁且驗榧≡w維蛋白氧化處理后,側鏈被修飾,蛋白質結構展開,使肌球蛋白的α-螺旋結構不穩(wěn)定,形成β-折疊或無規(guī)卷曲,導致其空間結構松散,使結合水和不易流動水的比例減小[27-29]。隨著茶多酚添加量的增加,結合水略有增加,不易流動水含量顯著增加,自由水含量顯著減少(P<0.05),說明茶多酚的添加提高了凝膠的保水性。Pearce等[30]的研究也認為P22組分的提高意味著肌原纖維蛋白凝膠保水性提高。因此,可以通過低場核磁測定凝膠中T2值,分析蛋白凝膠中3 種不同狀態(tài)的水,預測凝膠的保水性。

        2.4 相關性分析

        由表3可知,茶多酚質量濃度與肌原纖維蛋白游離巰基含量(r=0.917)、蒸煮得率(r=0.970)和P21結合水含量(r=0.911)呈極顯著正相關,茶多酚質量濃度與表面疏水性(r=-0.970)、二聚酪氨酸含量(r=-0.868)及白度(r=-0.771)呈極顯著負相關,說明隨著茶多酚的添加,抗氧化能力增強,蛋白質被氧化破壞的程度減小,蛋白質對結合水的束縛增強,部分自由水轉為不易流動水,凝膠的保水性增強。

        蛋白質側鏈游離巰基含量與表面疏水性(r=-0.956)和二聚酪氨酸(r=-0.830)呈極顯著負相關,與保水性(r=0.769)呈正相關。凝膠保水性與不易流動水含量(r=0.918)極顯著正相關性、與自由水含量(r=-0.924)呈顯著的負相關性。凝膠保水性與表面疏水性(r=-0.680,P<0.05)呈顯著負相關,與二聚酪氨酸含量(r=-0.735,P<0.01)和白度(r=-0.822,P<0.01)呈極顯著負相關性。其他學者也認為豬肉保水性與低場核磁結果中的不易流動水顯著相關[17,31-32]。本研究中添加適量的茶多酚,能夠清除羥自由基,可以提高肌原纖維蛋白游離巰基含量、蒸煮得率、保水性和凝膠不易流動水含量,降低肌原纖維蛋白表面疏水性、二聚酪氨酸含量和凝膠自由水含量,對肌原纖維蛋白結構起保護作用。

        表3 各指標相關性分析Table3 Correlation analysis between tea polyphenol concentration and properties of heat -induced myo fi brillar protein gels

        3 結 論

        肌原纖維蛋白氧化后,降低了其游離巰基含量和內源色氨酸熒光強度,提高了表面疏水性和二聚酪氨酸含量。而在氧化體系中含有1.0 mg/mL的茶多酚,能有效提高肌原纖維蛋白的游離巰基含量、凝膠蒸煮得率和保水性,顯著降低自由水含量,并提高色氨酸內源熒光強度,有效延緩肌原纖維蛋白的氧化程度??梢姡忸愒谫A藏過程中,添加一定量的抗氧化劑能有效降低肌原纖維蛋白的氧化程度。

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