羅海波，周 濤，孔曉雪，陶明煊，姜 麗，王利斌，王韋華，郁志芳,*

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

衰老是導(dǎo)致茭白采后品質(zhì)快速下降的重要因素，嚴重影響其商品品質(zhì)和市場價值[1]。研究表明，抑制或延緩果蔬采后衰老可有效減少營養(yǎng)成分消耗損失、風(fēng)味色澤改變及質(zhì)地軟化或木纖化，提高果蔬抗病菌能力，降低腐爛率，從而維持果蔬采后品質(zhì)和貯藏壽命[2]。因此，深入研究茭白采后衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)，有助于為實踐中進一步研發(fā)精準(zhǔn)的采后貯運保鮮新技術(shù)提供理論支撐。

關(guān)于衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)研究，自19世紀末應(yīng)用實驗方法研究以來，科研人員曾先后提出過多種假說，目前已知的果蔬采后衰老生物學(xué)基礎(chǔ)主要有營養(yǎng)虧缺假說、衰老基因調(diào)控學(xué)說、激素調(diào)控學(xué)說、自由基學(xué)說、細胞凋亡理論、死亡因子、端粒學(xué)說和差誤理論等，其中影響較為深遠的主要是激素調(diào)控學(xué)說、自由基學(xué)說、細胞凋亡理論和衰老基因調(diào)控學(xué)說[3-4]。目前，盡管這些學(xué)說對衰老現(xiàn)象的解釋都有不同的理論和實驗證據(jù)，但對采后衰老生物學(xué)基礎(chǔ)的清楚認識遠遠不夠，關(guān)于果蔬采后衰老生物學(xué)基礎(chǔ)的研究仍需繼續(xù)。

同位素標(biāo)記相對與絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，與傳統(tǒng)雙向電泳和熒光差異雙向電泳技術(shù)相比，具有定量準(zhǔn)確、數(shù)據(jù)豐富、重復(fù)性好、分辨率高和自動化程度高等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于動物[5]、植物[6]、微生物[7]等材料的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，獲悉了許多關(guān)于生長發(fā)育、生物與非生物脅迫、細胞生理功能等相關(guān)分子機理和調(diào)控機制。因此，對茭白采后衰老期間線粒體蛋白質(zhì)表達譜進行研究，能夠更加全面準(zhǔn)確地探明茭白采后衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)。然而，應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對茭白采后衰老期間線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究鮮見報道。

乙烯利（e t h y l e n e，E T）是果蔬常用的催熟劑，可以促進多種果蔬的成熟，1-甲基環(huán)丙烯（1-methyleyelopropene，1-MCP）可延緩果蔬采后衰老進程，保持果蔬良好的品質(zhì)，二者在果蔬采后成熟衰老過程中均發(fā)揮重要生理作用[8]。本實驗擬采用i T R A Q結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（two-dimensional liquid chromatographytandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS）技術(shù)對茭白采后常溫貯藏期間以及ET和1-MCP處理后線粒體蛋白質(zhì)表達譜進行比較，篩選差異表達蛋白并進行生物信息學(xué)分析，探索茭白采后衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)，以期為茭白貯運保鮮新技術(shù)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用茭白于6月下旬采自安徽大別山露天種植田，當(dāng)天運回實驗室，充分散去田間熱后，挑選無感官異常、形態(tài)大小一致的茭白，自來水清洗，室溫下晾干。

ET、1-甲基環(huán)丙烯、蔗糖、甘露醇、聚乙烯吡烙烷酮、乙二胺四乙酸、L-半胱氨酸、牛血清白蛋白、Percoll、iTRAQ8 plex試劑盒（AB SCIEX）、Tris-HCl（pH 6.8、pH 8.5、pH 8.8）、溴酚藍、Bradford蛋白濃度測定試劑盒 南京壽德試驗器材有限公司；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、3-（3-（膽酰胺丙基）二甲氨基）丙磺酸內(nèi)鹽、碘乙酰胺、IPG Buffer、甲酸、甲酸銨美國通用電氣公司；十二烷基硫酸鈉、三羧基氨基甲烷、甘氨酸、三氯乙酸、過硫酸銨、碳酸鈉、N,N,N’,N’-四甲基二乙胺 Amresco公司；三乙基碳酸氫銨緩沖液（triethylammonium bicarbonate buffer，TEAB）、蛋白酶抑制劑 美國Sigma公司；胰蛋白酶（Trypsin Gold）上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-320智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；KQ-300DB超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；FRESCO 17微量高速冷凍離心機 美國Thermo電子公司；AJ-30i高速冷凍離心機、OptimaL-100XP超速冷凍離心機 美國Beckman公司；TGL-16M高速冷凍離心機 南京馳遠生物科技有限公司；5810/5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ImageScanner掃描儀 美國Healthcare公司；FS-900N超聲波細胞粉碎機 上海生析超聲儀器有限公司；1200液相色譜儀 美國Agilent公司；Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系統(tǒng)、TripleTOF 5600系統(tǒng)、Protein Pilot 5.0軟件 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 ET和1-MCP處理

將晾干的茭白分為3 組，每組取3 kg進行實驗，第一組在1 000 μL/L ET溶液中浸泡30 min后密封19.5 h，第二組在10 μL/L 1-MCP環(huán)境中密封20 h，第三組（對照）直接密封20 h，實驗設(shè)3 次重復(fù)，用高密度聚乙烯塑料袋敞口包裝，置25 ℃下貯藏0、3 d和6 d，取樣提取純化線粒體。

1.3.2 線粒體提取與純化

參照杜傳來等[9]的方法提取純化茭白線粒體，每個樣品進行3 次生物學(xué)重復(fù)，純化后的線粒體置于－70 ℃冰箱備用。

1.3.3 茭白線粒體蛋白iTRAQ分析

茭白線粒體蛋白iTRAQ分析委托上海鹿明生物科技有限公司進行。

1.3.4 蛋白定性和定量

質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為.wiff文件，采用專用的Proteinpilot軟件打開進行分析。數(shù)據(jù)處理采用含Paragon algorithm算法的Protein Pilot Software v. 5.0進行，檢索的數(shù)據(jù)庫為水稻數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫來源于Uniprot。采用Cutoff Applied＞0.05、Global FDR from Fit≤1%且Peptide≥2為可信蛋白評判鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 差異表達蛋白篩選

采用Excel軟件進行差異表達蛋白篩選，以對照組貯藏0 d為比較基準(zhǔn)，組間蛋白變化倍數(shù)大于2.0或小于0.5，且P＜0.05為差異蛋白，將同一在任意比較組中為差異蛋白的蛋白均列出。

1.3.6 生物信息學(xué)分析

采用DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/mapper.html）對差異蛋白進行基因本體（gene ontology，GO）分類注釋和功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茭白線粒體蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果

茭白線粒體iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析共獲得1 908 個可信蛋白，以每組貯藏0 d（CK0d）為相對定量參考標(biāo)準(zhǔn)，采用組間表達量變化倍數(shù)大于2.0 倍且重復(fù)組數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗滿足P＜0.05的蛋白進行差異表達蛋白篩選，共獲得315 個差異表達蛋白（6 個比較組相同的差異蛋白僅統(tǒng)計1 次），詳細信息結(jié)果見表1。茭白貯藏期間差異表達蛋白數(shù)量顯著增多，對照組貯藏3 d和6 d后差異表達蛋白數(shù)量分別為79、121 個，其中上調(diào)表達差異蛋白分別為70、91 個，表明這些蛋白可能與茭白采后衰老密切相關(guān)。ET處理顯著提高了差異表達蛋白數(shù)量，貯藏3 d和6 d后分別為116、165 個，與對照組相比，ET處理組貯藏3 d后上調(diào)和下調(diào)差異表達蛋白分別增加了3、34 個，貯藏6 d后分別增加了44、0 個，這些增加的差異表達蛋白可能與ET促進茭白采后衰老有關(guān)。1-MCP處理也顯著提高了差異表達蛋白數(shù)量，貯藏3 d和6 d后分別為117、131 個；但與對照組相比，1-MCP處理組貯藏3 d和6 d后上調(diào)差異表達蛋白分別減少了40、6 個，下調(diào)差異表達蛋白分別增加了78、16 個，暗示1-MCP處理可能抑制了衰老相關(guān)蛋白的上調(diào)表達，從而延緩衰老。

表1 ET和1-MCP處理對茭白25 ℃貯藏期間線粒體蛋白表達譜的影響Table1 Effects of ethylene and 1-MCP on mitochondrial protein pro fi le in Z. latifolia during storage at 25 ℃

2.2 差異表達蛋白的生物信息學(xué)分析

圖1 差異表達蛋白的GO分類注釋Fig.1 GO annotation of the differentially expressed proteins

將篩選獲得的差異表達蛋白進行GO富集分析和KEGG通路分析，結(jié)果見圖1、2。圖1A、D顯示，茭白采后貯藏期間差異表達蛋白參與的生物學(xué)過程主要集中在單有機物代謝、單有機物生物合成、小分子代謝、有機酸代謝、細胞氨基酸生物合成、羧酸代謝及含堿基小分子代謝過程；參與的分子功能主要集中于催化活性、輔因子結(jié)合、裂解酶活性、磷酸吡哆醛結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性及氧化還原酶活性。ET處理后有機氮化合物代謝、核苷酸代謝、含堿基小分子代謝和蛋白質(zhì)折疊等生物學(xué)過程相關(guān)蛋白顯著富集，涉及分子功能主要包括氫離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、4鐵/4硫簇結(jié)合、離子結(jié)合和陰離子結(jié)合等（圖1B、E）。1-MCP處理后有機氮化合物代謝、羧酸代謝、含氧酸代謝、有機氮化合物生物合成、含堿基小分子代謝和核苷酸代謝等過程相關(guān)蛋白顯著富集，涉及分子功能主要包括陰離子結(jié)合、過渡金屬離子結(jié)合、氧化還原酶活性、輔酶結(jié)合和碳氧裂解酶活性等（圖1C、F）。以上結(jié)果表明，茭白采后衰老響應(yīng)差異表達蛋白具有多種分子功能，它們參與多類生物學(xué)過程，且主要集中在核苷酸代謝、有機酸代謝及含堿基小分子代謝等方面，ET和1-MCP處理顯著促進/抑制了部分生物學(xué)過程同時誘導(dǎo)了其他生物學(xué)過程，這些代謝過程可能在茭白采后衰老調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

圖2 差異表達蛋白質(zhì)顯著富集的KEGG通路Fig.2 The KEGG pathways for the most signif i cant enrichment of the differentially expressed proteins

圖2 A、D顯示，茭白采后常溫貯藏期間代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成與代謝相關(guān)蛋白顯著富集。ET和1-MCP處理對茭白采后貯藏期間KEGG通路有顯著調(diào)控作用。與對照組相比，ET處理組貯藏3 d后氧化磷酸化和甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝相關(guān)蛋白顯著富集（圖2B），貯藏6 d后磷酸戊糖途徑、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝相關(guān)蛋白顯著富集（圖2E）。1-MCP處理組貯藏3 d后三羧酸循環(huán)、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解途徑相關(guān)蛋白顯著富集（圖2 C），貯藏6 d后磷酸戊糖途徑、C 5支鏈二元酸代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝途徑相關(guān)蛋白顯著富集（圖2F）。以上結(jié)果表明，ET和1-MCP處理顯著誘導(dǎo)了茭白采后貯藏期間KEGG通路相關(guān)蛋白的改變，這些通路可能與ET和1-MCP調(diào)控茭白采后衰老有密切聯(lián)系。

2.3 差異表達蛋白的生物學(xué)功能分析

蔬菜采后失去了養(yǎng)分供應(yīng)來源，同化作用基本停止，異化作用占主導(dǎo)地位，成為利用自身營養(yǎng)物質(zhì)進行生命活動的獨立個體。呼吸作用是蔬菜采后貯藏過程中最主要的生理代謝活動，是在多種復(fù)雜酶系統(tǒng)參與下經(jīng)過許多中間反應(yīng)步驟進行的生物氧化還原過程，同時直接聯(lián)系著其他各種生理生化代謝，從而制約著蔬菜品質(zhì)變化、抗病能力和貯藏壽命[10]。植物呼吸作用在細胞質(zhì)基質(zhì)和線粒體中進行，且線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所[10]。本實驗采用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合2D-LC-MS/MS技術(shù)，以貯藏0 d（CK0d）為相對定量參考標(biāo)準(zhǔn)，研究比較了茭白采后常溫貯藏期間及ET和1-MCP處理后線粒體蛋白質(zhì)表達譜差異，發(fā)現(xiàn)6 個處理組在常溫貯藏期間共有315 個蛋白（附表，未列出）表達量變化倍數(shù)在2.0 倍以上且重復(fù)組數(shù)據(jù)差異顯著（P＜0.05），這些差異蛋白廣泛參與呼吸代謝及其伴隨的物質(zhì)代謝、能量代謝、活性氧代謝、細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）和細胞結(jié)構(gòu)降解等生物學(xué)過程，與前面生物信息學(xué)分析結(jié)果基本一致。

蔬菜呼吸代謝的底物主要是單糖，淀粉和蔗糖代謝可水解為單糖。本實驗中，7 個差異表達蛋白參與淀粉和蔗糖代謝，分別為4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶DPE1、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、蔗糖合酶1、蔗糖合酶7、β-葡萄糖苷酶6、β-葡萄糖苷酶26及Os03g0278000蛋白。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶可催化1,4-α-D-葡聚糖轉(zhuǎn)移合成多糖、糖蛋白或糖脂的可逆反應(yīng)[11]；α-1,4葡聚糖磷酸化酶能夠可逆催化麥芽寡糖、淀粉或糖原轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖的磷酸化反應(yīng)[12]；蔗糖合酶是廣泛存在于植物中的一種糖基轉(zhuǎn)移酶，能催化蔗糖的分解及合成反應(yīng)[13]；β-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大類酶，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[14]。茭白常溫貯藏期間4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6、β-葡萄糖苷酶26和蔗糖合酶7表達量均顯著上調(diào)表達，蔗糖合酶1和Os03g0278000蛋白顯著下調(diào)表達。ET處理促進了貯藏6 d時4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6和β-葡萄糖苷酶26上調(diào)表達，1-MCP處理抑制了貯藏3 d時4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6，但促進了β-葡萄糖苷酶26和蔗糖合酶7上調(diào)表達。以上結(jié)果表明，茭白采后常溫貯藏期間淀粉和蔗糖水解加速，1-MCP處理對茭白采后淀粉和蔗糖水解有一定延緩作用，ET處理則相反。

蔬菜呼吸代謝途徑有多種，主要包括糖酵解、發(fā)酵途徑、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑和乙醛酸循環(huán)途徑[10]。本實驗中，經(jīng)鑒定有4 個蛋白與糖酵解有關(guān)，包括果糖激酶-2、磷酸丙糖異構(gòu)酶、丙酮酸激酶和丙酮酸脫羧酶；11 個蛋白與三羧酸循環(huán)有關(guān)，包括丙酮酸脫氫酶E1組成亞基α-1、檸檬酸合酶、2 個異檸檬酸脫氫酶亞基、異檸檬酸脫氫酶、2 個順烏頭酸酶、二氫硫辛酸脫氫酶、3 個蘋果酸脫氫酶；10 個蛋白與磷酸戊糖途徑有關(guān)，包括2 個6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、果糖二磷酸醛縮酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉(zhuǎn)運、Os01g0926300、Os05g0524400、Os06g0133800、Os07g0176900和Os08g0154300蛋白；未發(fā)現(xiàn)發(fā)酵途徑相關(guān)差異表達蛋白。對上述呼吸代謝途徑相關(guān)差異表達蛋白進一步分析發(fā)現(xiàn)，茭白采后貯藏期間3 個糖酵解相關(guān)蛋白顯著下調(diào)表達，1 個上調(diào)表達，三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白均有上調(diào)表達趨勢，但僅有蘋果酸脫氫酶達到2.0 倍以上差異，而磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白均顯著上調(diào)表達；ET處理顯著促進了貯藏第3天時糖酵解途徑相關(guān)蛋白下調(diào)表達趨勢，貯藏6 d時與對照組無顯著差異，同時提高了整個貯藏期間三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白上調(diào)表達趨勢；1-MCP處理顯著促進了整個貯藏期間糖酵解相關(guān)蛋白下調(diào)表達趨勢，同時抑制了三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白的上調(diào)表達趨勢。這一結(jié)果與ET和1-MCP處理對茭白采后貯藏期間呼吸強度的影響結(jié)果一致。而有研究表明，合成代謝中多處需要呼吸作用產(chǎn)生的ATP供能，糖酵解和三羧酸循環(huán)是植物獲得生命活動所需能量的主要途徑，盡管磷酸戊糖途徑的一些中間產(chǎn)物是許多重要有機物質(zhì)（核酸、芳香族氨基酸等）生物合成的底物，但其提供的能量遠比三羧酸循環(huán)少得多[15]。由此推測，茭白采后貯藏期間糖酵解減弱，三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑增強導(dǎo)致的能量狀態(tài)改變可能與茭白采后衰老有密切聯(lián)系。

呼吸代謝過程中糖酵解、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑等脫下的氫被NAD＋或黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)DA）所接受，它們進一步經(jīng)呼吸電子傳遞鏈傳遞給O2生成H2O，同時偶聯(lián)ADP和Pi進行氧化磷酸化生成ATP[16]。本實驗中，19 個蛋白與呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化有關(guān)，分別為NADH脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白α亞基、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基、NADH泛醌氧化還原酶23 kDa亞基、NADH泛醌氧化還原酶75 kDa亞基、黃素蛋白亞基琥珀酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶鐵硫亞基1、NADH-細胞色素b5還原酶、細胞色素c、ATP合酶、ATP合酶α亞基、ATP合酶β亞基、ATP合酶γ鏈、無機焦磷酸酶、Os02g0816800、Os04g0656100、Os07g0645400、Os08g0478200和Os12g0638700蛋白。茭白采后常溫貯藏期間僅5 個差異蛋白（黃素蛋白β亞基、ATP合酶α亞基、無機焦磷酸酶、Os04g0656100和Os12g0638700蛋白）上調(diào)表達，其余蛋白均下調(diào)表達或與貯藏第0天無顯著差異；ET處理顯著促進了貯藏第3天多數(shù)呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化相關(guān)蛋白下調(diào)表達，貯藏第6天抑制作用減弱，其中ATP合酶α亞基和無機焦磷酸酶表達量顯著高于對照組；1-MCP處理延緩了多數(shù)呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化相關(guān)蛋白下調(diào)表達。以上結(jié)果表明，茭白采后常溫貯藏期間呼吸電子傳遞和氧化磷酸化減弱，能量供應(yīng)顯著減少，ET處理雖然促進了糖酵解和三羧酸循環(huán)，但減弱了氧化磷酸化，從而導(dǎo)致能量虧損，而1-MCP處理有利于維持較高的能量水平。

呼吸電子傳遞鏈在進行電子傳遞過程中，大部分的電子經(jīng)過末端氧化酶如細胞色素氧化酶和交替氧化酶傳給O2生成H2O，但也會有少量電子“漏出”直接與O2結(jié)合形成·、H2O2和·OH等活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[17]。在正常生命活動中，這些ROS可及時被細胞內(nèi)酶類抗氧化系統(tǒng)和非酶類抗氧化系統(tǒng)清除并維持在一定的水平[18]。本實驗中，6 個蛋白與酶類抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，分別為[Cu-Zn]超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、[Mn]SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）同工酶B、過氧化物還原酶-2F、2 個過氧化物酶（peroxidase，POD）；4 個蛋白與非酶類抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，分別為L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶1、谷胱甘肽還原酶、2-半胱氨酸過氧化物還原酶BAS1和硫轉(zhuǎn)移酶。酶類抗氧化系統(tǒng)中，茭白采后常溫貯藏期間[Cu-Zn]SOD、[Mn]SOD、CAT同工酶B均顯著上調(diào)表達，2個過氧化物酶在貯藏第3天上調(diào)表達，貯藏6 d時下調(diào)表達，過氧化物還原酶-2F的表達在整個貯藏期間變化不大；ET和1-MCP處理在貯藏第3天均顯著抑制了[Cu-Zn]SOD、[Mn]SOD、CAT同工酶B上調(diào)表達，但促進了2 個POD上調(diào)表達，貯藏6 d時ET處理組出現(xiàn)相反的調(diào)控作用，這可能是ROS積累的重要原因；1-MCP處理顯著促進了整個貯藏期間[Cu-Zn]SOD和2個POD上調(diào)表達，提高了ROS清除能力。非酶類抗氧化系統(tǒng)中，谷胱甘肽還原酶、2-半胱氨酸過氧化物還原酶BAS1和硫轉(zhuǎn)移酶上調(diào)表達，L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶1下調(diào)表達。ET處理顯著抑制了貯藏3 d時L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶1、谷胱甘肽還原酶、硫轉(zhuǎn)移酶表達，促進了2-半胱氨酸過氧化物還原酶BAS1上調(diào)表達。上述ROS清除酶類的上調(diào)表達可能暗示線粒體受到ROS的氧化脅迫程度提高，ET和1-MCP處理對ROS代謝有調(diào)控作用。

研究表明，線粒體ROS代謝狀態(tài)可能在PCD中占據(jù)重要地位[19]。徐建興[20]進行細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，10－9mol/L水平的ROS促進細胞增殖，10－6mol/L水平的ROS引起PCD，10－3mol/L水平的ROS引起細胞的損傷死亡，表明ROS代謝狀態(tài)與PCD存在緊密聯(lián)系。目前關(guān)于植物線粒體內(nèi)ROS的正常水平尚不清楚，但當(dāng)ROS水平超出自身清除系統(tǒng)所及范圍時會使線粒體處于氧化脅迫狀態(tài)，引起線粒體呼吸鏈酶活性下降和膜脂過氧化水平增強以及DNA損傷，這將使呼吸電子傳遞鏈不通暢而導(dǎo)致漏電程度增高，造成ROS積累增多和呼吸鏈進一步受損，如此惡性循環(huán)使線粒體的ROS代謝狀態(tài)不斷惡化，進而激活PCD甚至導(dǎo)致細胞壞死[21]。本實驗中，盡管沒有直接證據(jù)證明ROS積累造成線粒體DNA損傷，但經(jīng)鑒定有5 個差異表達蛋白（組蛋白H2A、H2A.1、H2A.6、H2B.10和H4）與遺傳物質(zhì)的載體染色質(zhì)相關(guān)。線粒體與原核細胞相似，沒有染色體，只有染色質(zhì)[22]。染色質(zhì)是間期細胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA組成的線性復(fù)合結(jié)構(gòu)，是間期細胞遺傳物質(zhì)的載體和存在形式[23]。茭白采后常溫貯藏期間5 個組蛋白均顯著下調(diào)表達，1-MCP處理抑制了5 個組蛋白下調(diào)表達趨勢，ET處理有相反的結(jié)果，暗示1-MCP處理可能通過降低ROS脅迫而減輕DNA損傷。同時，實驗還發(fā)現(xiàn)1 個蛋白（膜聯(lián)蛋白V）與PCD有關(guān)。膜聯(lián)蛋白V是一種檢測PCD的試劑，尤其在PCD早期檢測中靈敏度較高[24]。茭白采后常溫貯藏期間膜聯(lián)蛋白V顯著上調(diào)表達，貯藏3 d和6 d時分別為貯藏0 d的4.1305 倍和4.9659 倍，表明茭白采后貯藏期間PCD顯著升高。1-MCP/ET處理顯著抑制/促進了膜聯(lián)蛋白V上調(diào)表達，推測1-MCP處理可能維持了較好的ROS代謝狀態(tài)和能量供應(yīng)水平，減輕了DNA損傷程度，從而抑制茭白采后貯藏期間PCD，延緩衰老。

呼吸代謝在提供生命活動所需能量的同時，還會產(chǎn)生許多中間產(chǎn)物，其中有些十分活躍，是進一步合成其他有機物如蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、核酸以及次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)，并廣泛參與相應(yīng)的生理過程[10]。本實驗中，與蛋白質(zhì)代謝、氨基酸代謝、脂類代謝、核酸代謝、有機酸代謝及次生代謝相關(guān)的差異表達蛋白分別有36、58、15、8、13 個和14 個。對上述代謝相關(guān)蛋白的差異表達趨勢分析發(fā)現(xiàn)，茭白采后常溫貯藏期間23 個蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白中僅有6 個上調(diào)表達，而13 個蛋白降解相關(guān)蛋白中有11 個上調(diào)表達；氨基酸代謝相關(guān)差異表達蛋白涉及20 種氨基酸的合成和鳥氨酸循環(huán)，多數(shù)氨基酸合成相關(guān)蛋白在貯藏期間上調(diào)表達，鳥氨酸循環(huán)相關(guān)蛋白均顯著上調(diào)表達；脂類代謝相關(guān)蛋白中3 個甘油酯代謝、2 個脂肪水解、1 個脂肪酸氧化、6 個脂肪酸生物合成、2 個鞘脂代謝相關(guān)蛋白均上調(diào)表達，1 個磷脂代謝相關(guān)蛋白下調(diào)表達；核酸代謝相關(guān)蛋白中7 個上調(diào)表達，1 個下調(diào)表達；有機酸代謝相關(guān)蛋白中10 個蛋白上調(diào)表達，3 個蛋白與貯藏0 d無顯著差異；次生代謝相關(guān)蛋白中13 個上調(diào)表達，1 個下調(diào)表達。以上結(jié)果表明，茭白采后常溫貯藏期間蛋白質(zhì)合成減弱而降解增強，氨基酸合成和鳥氨酸循環(huán)顯著提高，脂肪合成和脂質(zhì)氧化反應(yīng)均加速，核酸、有機酸及次生代謝也顯著加快，這可能與茭白采后貯藏期間物質(zhì)分解消耗增多，需要更多地合成相應(yīng)物質(zhì)以維持正常的生理功能有關(guān)。1-MCP處理對上述物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達有顯著的抑制作用，ET處理有促進作用，表明1-MCP處理有利于延緩物質(zhì)分解消耗。

需要特別指出的是，1-MCP處理在貯藏第3天對絕大多數(shù)物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的上調(diào)/下調(diào)表達有抑制作用，但顯著促進了次生代謝相關(guān)蛋白細胞色素P450 74A2和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）上調(diào)表達。細胞色素P450 74A2編碼丙二烯氧合酶，該酶可以轉(zhuǎn)化由LOX催化衍生的脂肪酸氫過氧化物成不穩(wěn)定的重要脂類中間體丙二烯氧化物，再經(jīng)丙二烯氧化物環(huán)化酶、12-氧-植物二烯酸還原酶等催化生成茉莉酸[25]。茉莉酸類是植物傷反應(yīng)中的重要信號分子，在植物防御機制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[25]。那么這是否暗示1-MCP處理提高了茭白采后對外界不良環(huán)境的防御能力而延緩衰老，還有待進一步的實驗證實。

呼吸代謝中間產(chǎn)物與植物細胞壁物質(zhì)的合成與也有緊密聯(lián)系，細胞衰老過程中伴隨著細胞壁化學(xué)組成的變化[26]。本實驗中，經(jīng)鑒定有3 個蛋白與纖維素合成有關(guān)，3 個蛋白與木質(zhì)素合成有關(guān)。茭白采后常溫貯藏期間3 個纖維素合成相關(guān)蛋白（纖維素合成酶催化亞基1[UDP]、纖維素合成酶催化亞基5[UDP]、纖維素合成酶催化亞基8[UDP]）均顯著下調(diào)表達，而3 個木質(zhì)素合成相關(guān)蛋白（3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基轉(zhuǎn)移酶、脫氫奎尼酸脫水酶、肉桂酸-4-羥化酶）均顯著上調(diào)表達，1-MCP處理對纖維素合成相關(guān)蛋白無顯著影響，但抑制了木質(zhì)素合成相關(guān)蛋白上調(diào)表達，表明茭白采后木質(zhì)化是其衰老的一個重要特征。這一結(jié)果與前期研究中發(fā)現(xiàn)茭白貯藏過程中酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量顯著上升的結(jié)果一致。

茭白采后常溫貯藏期間可能與衰老相關(guān)的其他差異表達蛋白中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白10 個，脅迫響應(yīng)與防御相關(guān)蛋白20 個，內(nèi)吞作用相關(guān)蛋白8 個，吞噬體和輔助因子相關(guān)蛋白各3 個，磷酸肌醇代謝、ABC轉(zhuǎn)運、同源重組、蛋白質(zhì)互作、外膜結(jié)構(gòu)維持和線粒體分裂相關(guān)蛋白各1 個。

細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是細胞外因子通過與受體（膜受體或核受體）結(jié)合，引發(fā)細胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)及蛋白間相互作用，從而影響細胞生物學(xué)功能的過程[27]。研究表明，蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化在生物體細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色，涉及如光合作用、糖代謝、細胞生長發(fā)育及基因表達等幾乎所有的生理及病理過程。本實驗發(fā)現(xiàn)6 個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白（磷脂酰肌醇磷脂酶C、EF手型鈣結(jié)合蛋白、類受體蛋白激酶1、MAP3K類蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、2C類蛋白磷酸酶41）顯著上調(diào)表達。一般認為，植物對外界刺激的反應(yīng)主要是通過細胞質(zhì)中Ca2＋濃度的瞬間變化來傳遞的[28]，磷脂酰肌醇磷脂酶C可誘發(fā)Ca2＋從胞內(nèi)儲庫中釋放出來，瞬間增加細胞質(zhì)中Ca2＋濃度[29]，EF手型鈣結(jié)合蛋白通過與Ca2＋結(jié)合成為激活態(tài)，在體內(nèi)參與多種生物學(xué)功能[30]。植物類受體蛋白激酶1屬于蛋白激酶的一個亞家族，通過胞外結(jié)構(gòu)域識別病原信號分子，發(fā)生磷酸化或去磷酸化反應(yīng)而開啟或關(guān)閉下游靶蛋白，將胞外信號轉(zhuǎn)換為胞質(zhì)信號[31]。MAP3K類蛋白和2C類蛋白磷酸酶41均是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[32]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶幾乎參與所有生理及病理等逆境脅迫響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[32]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水稻抗白葉枯病基因Xa21[33]、番茄抗假單孢菌基因Pto[34]和玉米抗葉銹病基因Lr10[35]等抗病基因都編碼受體樣蛋白激酶，并含有絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。以上6 個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白顯著上調(diào)表達暗示鈣信號途徑可能是茭白采后衰老響應(yīng)的重要途徑，茭白常溫貯藏期間受到的生物性脅迫顯著增加，造成茭白自身防御能力下降，9 個脅迫響應(yīng)與防御相關(guān)蛋白的顯著上調(diào)表達進一步予以證實。1-MCP處理顯著抑制了上述6 個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白上調(diào)表達，表明1-MCP處理提高了茭白對外界不良環(huán)境的防御能力而使脅迫響應(yīng)減弱。

圖3 茭白采后衰老可能的信號通路Fig.3 Possible signaling pathways involved in postharvest senescence of Zizania latifolia

與此同時，4 個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白（GTP結(jié)合蛋白Rab6、線粒體Rho GTP酶、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白、C2結(jié)構(gòu)域蛋白）下調(diào)表達。G蛋白普遍存在于真核生物細胞中，其中植物細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白主要有3 類：異三聚體G蛋白、小G蛋白和幾種特殊的GTP結(jié)合蛋白[36]，而小G蛋白又包括5 個亞家族，即Ras、Rho、Rab、Arf和Ran，每個亞家族在細胞中起著不同的調(diào)控作用[37]。研究表明，Rho家族成員可能參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌動蛋白重組過程調(diào)控，Rab家族參與膜轉(zhuǎn)運過程[38]。腺苷酸環(huán)化酶可催化ATP分解生成3’,5’-環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和焦磷酸（ppi），是cAMP跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中的重要效應(yīng)器[39]。C2結(jié)構(gòu)域蛋白大多定位于細胞膜系統(tǒng)，可能參與了逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或膜轉(zhuǎn)運[40]。本實驗中，GTP結(jié)合蛋白Rab6和Rho GTP酶均隸屬于小G蛋白Ras超家族，且激活型G蛋白（Gs）可介導(dǎo)受體與腺苷酸環(huán)化酶之間的相互作用，從而激活腺苷酸環(huán)化酶，調(diào)節(jié)胞內(nèi)第二信使cAMP水平，將細胞外信號轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎麅?nèi)信號[41]。本實驗中上述4 個蛋白均下調(diào)表達，這一結(jié)果與王韋華等[1]在研究完整茭白常溫貯藏期間總蛋白表達譜差異時發(fā)現(xiàn)Ras相關(guān)小G蛋白和C2結(jié)構(gòu)域蛋白下調(diào)表達結(jié)果一致，但與鮮切茭白貯藏期間顯著上調(diào)表達相反，表明cAMP信號途徑與傷脅迫響應(yīng)密切相關(guān)但對衰老的響應(yīng)并不明顯。

綜合上述分析，參考Cell Signaling Technology, Inc.（https://www.cellsignal.com/contents/ research/science/science）所提供的已知信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路，推測茭白采后衰老過程中可能通過ROS激活Ca2＋/MAPKs、細胞色素c和茉莉酸等信號參與茭白采后衰老調(diào)控，其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路見圖3。

內(nèi)吞作用、吞噬體、輔助因子相關(guān)蛋白、磷酸肌醇代謝、ABC轉(zhuǎn)運、同源重組及蛋白質(zhì)互作等相關(guān)蛋白中僅有類MDR ABC轉(zhuǎn)運蛋白、發(fā)夾結(jié)構(gòu)1結(jié)合蛋白和Os05g0303000蛋白顯著上調(diào)表達，其余蛋白均顯著下調(diào)表達，但這些蛋白與茭白采后衰老的確切關(guān)系尚不清楚，還有待進一步深入研究。

此外，39 個差異表達蛋白經(jīng)鑒定既沒有確切的名稱，也沒有相應(yīng)的KEGG通路，其中22 個蛋白在茭白采后常溫貯藏期間上調(diào)表達，17 個蛋白下調(diào)表達，ET處理對少數(shù)蛋白的表達趨勢有促進作用，1-MCP對多數(shù)蛋白的表達趨勢有抑制作用，表明它們可能與茭白采后衰老存在一定聯(lián)系。

3 結(jié) 論

應(yīng)用iTRAQ技術(shù)共鑒定獲得茭白線粒體蛋白質(zhì)1 908 個，以貯藏第0天（CK0d）為相對定量參考標(biāo)準(zhǔn)，茭白貯藏期間及ET和1-MCP處理茭白線粒體表現(xiàn)2.0 倍以上顯著差異（P＜0.05）的蛋白質(zhì)共計315 個。

代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成與代謝、核苷酸代謝、含堿基小分子代謝途徑等可能與茭白采后衰老有關(guān)，三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、C5支鏈酸代謝及氨基酸代謝途徑可能在茭白采后衰老過程中發(fā)揮重要作用。

茭白采后碳水化合物水解加速，磷酸戊糖途徑加強而糖酵解途徑和氧化磷酸化減弱，導(dǎo)致能量合成減少同時形成氧化脅迫，這可能激活Ca2＋/MAPKs、細胞色素c和茉莉酸等信號途徑，造成初級代謝紊亂和次級代謝產(chǎn)物（如木質(zhì)素）積累，從而促進細胞凋亡或細胞壞死，最終加速衰老。

茭白采后衰老過程中可能通過ROS積累激活Ca2＋/MAPKs、細胞色素c和茉莉酸等信號進行調(diào)控，而cAMP信號途徑與傷脅迫響應(yīng)密切相關(guān)但對衰老的響應(yīng)并不明顯，茉莉酸信號和磷酸肌醇信號可能協(xié)同鈣信號在茭白采后衰老過程中發(fā)揮作用。

然而，以上差異表達蛋白的生物學(xué)功能及其相互作用仍待進一步驗證，相關(guān)通路與茭白采后衰老的確切關(guān)系還需深入研究。