張國慶，黃子琪，王明月，孔俊豪，李余動(dòng)*，陳建設(shè)

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

人體微生物群是一個(gè)極其復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，以口腔微生物群為例，不同個(gè)體的口腔微生物群都會(huì)不同。這種微生物群組成和變化的多樣性決定了人體口腔生態(tài)系統(tǒng)的平衡或失調(diào)，甚至決定著口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展[1-2]?？谇晃⑸锏姆N類保守估計(jì)有19 000 種[3]，但目前口腔中能被檢測分離出的微生物只有700 種，而且有近一半以上的細(xì)菌不可培養(yǎng)，如Anaerolineae、Bacteroidetes等在傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法中不能培養(yǎng)[4-5]。近年來，人們用分子生物學(xué)、分子生態(tài)學(xué)等手段對口腔微生物群落進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)很多因素，如飲食、人種及地域等均會(huì)引起口腔內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異[6]。Ren Wen等研究認(rèn)為，口臭是由人體口腔微生物引起的，口臭患者的舌苔有更豐富的細(xì)菌[7]?？谇晃⑸锛戎苯訁⑴c口腔疾病的發(fā)展，也通過與其他人體微生物的交互作用間接影響人體健康。Atarashi等的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者唾液中的肺炎克雷伯氏菌會(huì)迅速定植到小鼠腸道，導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，直接證實(shí)了口腔細(xì)菌與腸道疾病之間的關(guān)系[8]。

Illumina MiSeq是新一代高通量測序平臺(tái)之一，該測序平臺(tái)克服了傳統(tǒng)測序方法讀長較短、誤差較大等缺陷，因而可獲得更準(zhǔn)確的微生物群落信息[9-10]。16S rRNA基因全長約1 542 bp，在結(jié)構(gòu)和功能上都具有高度的保守性，且存在于所有的細(xì)菌中，因此常常被用于微生物鑒定。16S rRNA基因的9 個(gè)高變區(qū)（V1～V9）中，V4區(qū)是最準(zhǔn)確且能識(shí)別到屬水平的可變區(qū)，而V3～V4區(qū)測序讀長比V4區(qū)更長，相較單獨(dú)V4區(qū)測序更加準(zhǔn)確[11-12]。

據(jù)調(diào)查，大學(xué)生群體對口腔健康的知識(shí)了解較少，口腔的健康狀況不容樂觀[13]，尤其是飲食習(xí)慣對大學(xué)生口腔健康的影響應(yīng)該引起足夠重視。本實(shí)驗(yàn)采用Illumina MiSeq測序平臺(tái)，基于16S rDNA V3～V4高變區(qū)對不同飲食習(xí)慣的大學(xué)生群體的唾液微生物進(jìn)行研究，以期揭示飲食習(xí)慣對唾液微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性差異的影響，促進(jìn)在校學(xué)生對合理膳食與口腔健康的重視。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象與試劑

實(shí)驗(yàn)采樣對象為在讀大學(xué)生，通過問卷的形式對對葷素飲食、是否飲酒、是否喝茶和咖啡等含咖啡因飲料，以及是否運(yùn)動(dòng)等10余項(xiàng)差異選項(xiàng)進(jìn)行調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示以葷素飲食差異為研究方向較好，群體區(qū)分較其他項(xiàng)明顯，最終在盡可能平衡口腔衛(wèi)生等影響因素的條件下，選取符合實(shí)驗(yàn)要求的大學(xué)生36 名，依據(jù)每周飲食攝入葷食時(shí)間分成2 組：每周攝入葷食時(shí)間不少于4 d為A組，少于4 d為B組[14]。選取標(biāo)準(zhǔn)：1）取樣前3 個(gè)月無抗生素使用史，齲、失、補(bǔ)牙數(shù)小于2，無其他口腔疾?。?）無先天性疾病及系統(tǒng)性疾?。ㄈ绨滩　⒏窝?、糖尿病等），6 個(gè)月內(nèi)無重大疾病史；3）受試者取樣前12 h內(nèi)未實(shí)施口腔保?。ㄈ缢⒀?、嚼口香糖等），取樣前6 h內(nèi)無進(jìn)食、飲酒、喝含咖啡因的飲料等。該研究提供唾液樣品的大學(xué)生均悉知實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟⒑炇鹬橥鈺?/p>

DNA Mini Kit 德國QIAGEN公司；Premix Ex TaqTMHot Start Version 日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；Illumina MiSeq測序平臺(tái) 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣方法

唾液采集采用自然流出法，具體方法為，用一次性無菌取樣杯收集志愿者自然流出、清澈無痰的唾液，采樣量大于2 mL。采樣過程注意避免污染，唾液樣品直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，避免唾液樣本低溫保存對結(jié)果造成影響[15-16]。

1.3.2 DNA提取

使用DNA Mini Kit提取唾液樣品中總DNA，提取方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取得到的DNA于－80 ℃凍存，備用。

1.3.3 16S rRNA基因擴(kuò)增及高通量測序

提取得到的D N A樣本1 0 0 μ L，對D N A的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]（使用引物序列為338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R：5’-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3’[18-19]）。使用的聚合酶為Premix Ex TaqTMHot Start Version。電泳檢測合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至檢測機(jī)構(gòu)，用Illumina MiSeq測序平臺(tái)雙端測序（Paired-end）分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 質(zhì)量控制

測序所得原始數(shù)據(jù)，采用QIIME軟件（v1.9.1）的微生物16S rRNA分析流程，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列（Q＜20），通過barcode區(qū)分樣品序列，去除primer序列，進(jìn)行overlap連接，去除雜合體，最終獲得用于分析的序列，每個(gè)樣本的序列超過10 000 條認(rèn)為數(shù)據(jù)符合要求。

1.4.2 群落結(jié)構(gòu)分析

采用QIIME軟件將序列聚類成可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），并對所有樣本的序列按0.97的相似度進(jìn)行OTU聚類，選取每一類中最長的序列作為OTU的代表序列，使用Greengene數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進(jìn)行物種注釋，得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息[20]。統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品包含的OTU情況及每個(gè)OTU中含有的序列的數(shù)目。采用QIIME進(jìn)行組間差異分析，將屬水平上的分類信息分別按照樣品和分組進(jìn)行聚類，做出熱圖（heatmap圖）。采用QIIME進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），其中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，顏色相同的點(diǎn)屬于同一分組，2 個(gè)點(diǎn)之間的距離越近，表示2 個(gè)樣品中的微生物群落差異越小。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件R對各組樣品進(jìn)行單因素方差分析[21]，P＜0.05表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 唾液細(xì)菌基因組DNA提取

圖1 V3～V4區(qū)PCR結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of bacterial 16S rRNA V3-V4 region

通過對比試劑盒法（DNA Mini Kit）與化學(xué)法（吐溫提取法）對部分唾液樣品的細(xì)菌DNA提取的影響，發(fā)現(xiàn)采用化學(xué)法提取的DNA電泳拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重（泳道9～12），提取濃度也不穩(wěn)定，綜合對比后認(rèn)為DNA Mini Kit的提取效果較化學(xué)法好（圖1），DNA純度與濃度均達(dá)到構(gòu)建測序文庫的要求，最后采用此試劑盒提取細(xì)菌DNA用于測序。最新研究也表明，唾液樣品的不同收集方法與DNA提取方法對唾液微生物組成的檢測影響并不大[22-23]。

2.2 唾液細(xì)菌種群的豐度與多樣性

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves

本實(shí)驗(yàn)共得到990 286 條優(yōu)質(zhì)序列（每個(gè)樣品平均27 508 條），發(fā)現(xiàn)了212 個(gè)物種，在門和屬2 個(gè)水平上對同類的OTU進(jìn)行聚類，其歸屬于16 個(gè)門、143 個(gè)屬。各樣品的稀釋曲線均趨于平緩（圖2），表明測序已趨于飽和，測序深度已基本覆蓋樣品中所有物種。

表1 多樣性指數(shù)Table1 Diversity indices

本實(shí)驗(yàn)中樣本α多樣性分析中的多樣性指數(shù)如表1所示。其中A組和B組Simpson多樣性指數(shù)分別為0.93±0.04與0.95±0.02，Shannon多樣性指數(shù)分別為5.54±0.63與5.78±0.03，2 組樣本有著相似的多樣性指數(shù)，所有樣本的覆蓋度均大于95%。

2.3 唾液細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)

2.3.1 門水平分布

圖3 樣本的門水平菌群豐度（a）及優(yōu)勢菌（b）Fig.3 Abundance of salivary bacteria （a） and dominant bacteria （b） at the phylum level

表2 不同分類水平上樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其相對豐度Table2 Bacterial community structure and their relative abundance at different taxonomic levels%

本實(shí)驗(yàn)檢出的微生物共涉及16 個(gè)門，2 組樣本共有的優(yōu)勢菌門（菌群豐度＞1%）為Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Fusobacteria，其中Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria不存在顯著性差異，而Fusobacteria存在極顯著性差異（P＜0.01）（圖3）。在非優(yōu)勢菌門中，SR1、Saccharibacteria在A組的相對豐度顯著低于B組（P＜0.05）（表2）。

2.3.2 屬水平分布

圖1 樣本的屬水平菌群豐度（a）及優(yōu)勢菌（b）Fig.1 Abundance of salivary bacteria （a） and dominant bacteria （b） at the genus level

本實(shí)驗(yàn)共檢出11 3 個(gè)屬，在優(yōu)勢屬（圖4）中，A組中Streptococcus相對豐度比B組極顯著增加（P＜0.01），F(xiàn)usobacterium相對豐度比B組極顯著減少（P＜0.01），而在非優(yōu)勢屬中，A組中Peptostreptococcus、Parvimonas、Eubacterium、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、SR1_genera_incertae_sedis、Catonella、Mogibacterium、Solobacterium相對豐度均比B組顯著減少（P＜0.05），A組中Corynebacterium相對豐度比B組顯著增加（P＜0.05）（表2）。

2.4 樣品的PCA與聚類分析

2.4.1 PCA分析

采用QIIME進(jìn)行PCA分析，其中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，相同的顏色表示是同一組的樣本，2 個(gè)點(diǎn)之間的距離越近，說明2 個(gè)樣品的微生物群落差異越小。由PCA結(jié)果可知，2 組樣本均比較分散，主成分區(qū)分度不是特別明顯，但在各自象限均占主要優(yōu)勢（圖5），說明2 組樣本的主成分有一定差異，但沒有顯著差異。這可能與本研究的采樣對象均為健康大學(xué)生群體有關(guān)，還需要擴(kuò)大取樣人群范圍進(jìn)一步研究。

圖5 A組和B組樣品的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of salivary microbial communities in two groups

2.4.2 聚類分析

物種分類heatmap圖用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來。將屬水平上的分類信息進(jìn)行組間豐度相似性聚類，將聚類后數(shù)據(jù)表示在熱圖上，將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

圖6 A組和B組樣品的菌群組成熱圖Fig.6 Heat map analysis of salivary microbial community structures in two groups

由菌群組成的熱圖（圖6）可知，紅色代表細(xì)菌豐度高，藍(lán)色代表細(xì)菌豐度低，2 組樣本的菌落組成存在差異，如Haemophilus、Gemella、Rothia等在A組中豐度較高，Peptostreptococcus、Neisseria、Saccharibacteria、Fusobacterium等在B組中豐度較高，而Streptococcus在2 組中沒有明顯變化。

3 討 論

學(xué)者們普遍認(rèn)為口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展是由口腔中微生物群落結(jié)構(gòu)所調(diào)控，而其中唾液微生物有重要的影響[24-25]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及微生態(tài)的興起，人們越來越關(guān)注口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性對健康的潛在影響[26]。從微生物群落結(jié)構(gòu)差異的角度來探索個(gè)人飲食習(xí)慣與健康的關(guān)聯(lián)是微生態(tài)研究的切入點(diǎn)。

本研究關(guān)注大學(xué)生這一群體，實(shí)驗(yàn)研究對象選擇在校大學(xué)生，飲食與生活習(xí)慣相對一致，且學(xué)校生活較為規(guī)律，其他環(huán)境因素影響較小，所選用的個(gè)體均經(jīng)過嚴(yán)格篩選，盡可能選擇在其他方面統(tǒng)一的志愿者，保證樣本的可靠性。通過對葷素飲食不同的兩組大學(xué)生口腔內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本有著相似的菌群多樣性指數(shù)，但部分菌群的豐度，在門水平和屬水平上存在顯著組間差異；其中，還有值得關(guān)注的潛在致病菌或條件致病菌，如Corynebacterium、Streptococcus等菌屬[27-28]。

口腔唾液有著復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)，本研究結(jié)果表明口腔唾液中Corynebacterium、Streptococcus等潛在致病或條件致病菌的屬與常吃葷食呈正相關(guān)，而Peptostreptococcus、Eubacterium等無害菌屬與常吃葷食呈負(fù)相關(guān)。這種微生物種群差異也說明，飲食習(xí)慣對口腔微生物存在一定影響，合理飲食結(jié)構(gòu)，多吃蔬菜水果，控制肉類的攝入，將有助于人們的身體健康[29]。需要指出的是，本研究結(jié)果還需要后續(xù)加大樣本數(shù)量，設(shè)置重復(fù)樣品，并通過收取志愿者不同時(shí)間周期的樣品[30]，研究口腔的微生物菌群動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步研究飲食習(xí)慣與菌群結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，對于指導(dǎo)在校學(xué)生合理膳食具有現(xiàn)實(shí)意義。