張國慶，黃子琪，王明月，孔俊豪，李余動*，陳建設

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

人體微生物群是一個極其復雜的生態(tài)系統(tǒng)，以口腔微生物群為例，不同個體的口腔微生物群都會不同。這種微生物群組成和變化的多樣性決定了人體口腔生態(tài)系統(tǒng)的平衡或失調(diào)，甚至決定著口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展[1-2]?？谇晃⑸锏姆N類保守估計有19 000 種[3]，但目前口腔中能被檢測分離出的微生物只有700 種，而且有近一半以上的細菌不可培養(yǎng)，如Anaerolineae、Bacteroidetes等在傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法中不能培養(yǎng)[4-5]。近年來，人們用分子生物學、分子生態(tài)學等手段對口腔微生物群落進行深入研究，發(fā)現(xiàn)很多因素，如飲食、人種及地域等均會引起口腔內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異[6]。Ren Wen等研究認為，口臭是由人體口腔微生物引起的，口臭患者的舌苔有更豐富的細菌[7]?？谇晃⑸锛戎苯訁⑴c口腔疾病的發(fā)展，也通過與其他人體微生物的交互作用間接影響人體健康。Atarashi等的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者唾液中的肺炎克雷伯氏菌會迅速定植到小鼠腸道，導致強烈的炎癥反應，直接證實了口腔細菌與腸道疾病之間的關(guān)系[8]。

Illumina MiSeq是新一代高通量測序平臺之一，該測序平臺克服了傳統(tǒng)測序方法讀長較短、誤差較大等缺陷，因而可獲得更準確的微生物群落信息[9-10]。16S rRNA基因全長約1 542 bp，在結(jié)構(gòu)和功能上都具有高度的保守性，且存在于所有的細菌中，因此常常被用于微生物鑒定。16S rRNA基因的9 個高變區(qū)（V1～V9）中，V4區(qū)是最準確且能識別到屬水平的可變區(qū)，而V3～V4區(qū)測序讀長比V4區(qū)更長，相較單獨V4區(qū)測序更加準確[11-12]。

據(jù)調(diào)查，大學生群體對口腔健康的知識了解較少，口腔的健康狀況不容樂觀[13]，尤其是飲食習慣對大學生口腔健康的影響應該引起足夠重視。本實驗采用Illumina MiSeq測序平臺，基于16S rDNA V3～V4高變區(qū)對不同飲食習慣的大學生群體的唾液微生物進行研究，以期揭示飲食習慣對唾液微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性差異的影響，促進在校學生對合理膳食與口腔健康的重視。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與試劑

實驗采樣對象為在讀大學生，通過問卷的形式對對葷素飲食、是否飲酒、是否喝茶和咖啡等含咖啡因飲料，以及是否運動等10余項差異選項進行調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示以葷素飲食差異為研究方向較好，群體區(qū)分較其他項明顯，最終在盡可能平衡口腔衛(wèi)生等影響因素的條件下，選取符合實驗要求的大學生36 名，依據(jù)每周飲食攝入葷食時間分成2 組：每周攝入葷食時間不少于4 d為A組，少于4 d為B組[14]。選取標準：1）取樣前3 個月無抗生素使用史，齲、失、補牙數(shù)小于2，無其他口腔疾??；2）無先天性疾病及系統(tǒng)性疾?。ㄈ绨滩?、肝炎、糖尿病等），6 個月內(nèi)無重大疾病史；3）受試者取樣前12 h內(nèi)未實施口腔保?。ㄈ缢⒀?、嚼口香糖等），取樣前6 h內(nèi)無進食、飲酒、喝含咖啡因的飲料等。該研究提供唾液樣品的大學生均悉知實驗目的并簽署知情同意書。

DNA Mini Kit 德國QIAGEN公司；Premix Ex TaqTMHot Start Version 日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；Illumina MiSeq測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣方法

唾液采集采用自然流出法，具體方法為，用一次性無菌取樣杯收集志愿者自然流出、清澈無痰的唾液，采樣量大于2 mL。采樣過程注意避免污染，唾液樣品直接用于后續(xù)實驗，避免唾液樣本低溫保存對結(jié)果造成影響[15-16]。

1.3.2 DNA提取

使用DNA Mini Kit提取唾液樣品中總DNA，提取方法嚴格按照試劑盒說明書進行，提取得到的DNA于－80 ℃凍存，備用。

1.3.3 16S rRNA基因擴增及高通量測序

提取得到的D N A樣本1 0 0 μ L，對D N A的V3～V4區(qū)進行PCR擴增[17]（使用引物序列為338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R：5’-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3’[18-19]）。使用的聚合酶為Premix Ex TaqTMHot Start Version。電泳檢測合格的PCR擴增產(chǎn)物送至檢測機構(gòu)，用Illumina MiSeq測序平臺雙端測序（Paired-end）分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 質(zhì)量控制

測序所得原始數(shù)據(jù)，采用QIIME軟件（v1.9.1）的微生物16S rRNA分析流程，對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列（Q＜20），通過barcode區(qū)分樣品序列，去除primer序列，進行overlap連接，去除雜合體，最終獲得用于分析的序列，每個樣本的序列超過10 000 條認為數(shù)據(jù)符合要求。

1.4.2 群落結(jié)構(gòu)分析

采用QIIME軟件將序列聚類成可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），并對所有樣本的序列按0.97的相似度進行OTU聚類，選取每一類中最長的序列作為OTU的代表序列，使用Greengene數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進行物種注釋，得到每個OTU的分類學信息[20]。統(tǒng)計各個樣品包含的OTU情況及每個OTU中含有的序列的數(shù)目。采用QIIME進行組間差異分析，將屬水平上的分類信息分別按照樣品和分組進行聚類，做出熱圖（heatmap圖）。采用QIIME進行主成分分析（principal component analysis，PCA），其中一個點代表一個樣品，顏色相同的點屬于同一分組，2 個點之間的距離越近，表示2 個樣品中的微生物群落差異越小。

1.4.3 統(tǒng)計學分析

使用統(tǒng)計軟件R對各組樣品進行單因素方差分析[21]，P＜0.05表示組間差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 唾液細菌基因組DNA提取

圖1 V3～V4區(qū)PCR結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of bacterial 16S rRNA V3-V4 region

通過對比試劑盒法（DNA Mini Kit）與化學法（吐溫提取法）對部分唾液樣品的細菌DNA提取的影響，發(fā)現(xiàn)采用化學法提取的DNA電泳拖尾現(xiàn)象嚴重（泳道9～12），提取濃度也不穩(wěn)定，綜合對比后認為DNA Mini Kit的提取效果較化學法好（圖1），DNA純度與濃度均達到構(gòu)建測序文庫的要求，最后采用此試劑盒提取細菌DNA用于測序。最新研究也表明，唾液樣品的不同收集方法與DNA提取方法對唾液微生物組成的檢測影響并不大[22-23]。

2.2 唾液細菌種群的豐度與多樣性

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves

本實驗共得到990 286 條優(yōu)質(zhì)序列（每個樣品平均27 508 條），發(fā)現(xiàn)了212 個物種，在門和屬2 個水平上對同類的OTU進行聚類，其歸屬于16 個門、143 個屬。各樣品的稀釋曲線均趨于平緩（圖2），表明測序已趨于飽和，測序深度已基本覆蓋樣品中所有物種。

表1 多樣性指數(shù)Table1 Diversity indices

本實驗中樣本α多樣性分析中的多樣性指數(shù)如表1所示。其中A組和B組Simpson多樣性指數(shù)分別為0.93±0.04與0.95±0.02，Shannon多樣性指數(shù)分別為5.54±0.63與5.78±0.03，2 組樣本有著相似的多樣性指數(shù)，所有樣本的覆蓋度均大于95%。

2.3 唾液細菌種群結(jié)構(gòu)

2.3.1 門水平分布

圖3 樣本的門水平菌群豐度（a）及優(yōu)勢菌（b）Fig.3 Abundance of salivary bacteria （a） and dominant bacteria （b） at the phylum level

表2 不同分類水平上樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)及其相對豐度Table2 Bacterial community structure and their relative abundance at different taxonomic levels%

本實驗檢出的微生物共涉及16 個門，2 組樣本共有的優(yōu)勢菌門（菌群豐度＞1%）為Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Fusobacteria，其中Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria不存在顯著性差異，而Fusobacteria存在極顯著性差異（P＜0.01）（圖3）。在非優(yōu)勢菌門中，SR1、Saccharibacteria在A組的相對豐度顯著低于B組（P＜0.05）（表2）。

2.3.2 屬水平分布

圖1 樣本的屬水平菌群豐度（a）及優(yōu)勢菌（b）Fig.1 Abundance of salivary bacteria （a） and dominant bacteria （b） at the genus level

本實驗共檢出11 3 個屬，在優(yōu)勢屬（圖4）中，A組中Streptococcus相對豐度比B組極顯著增加（P＜0.01），F(xiàn)usobacterium相對豐度比B組極顯著減少（P＜0.01），而在非優(yōu)勢屬中，A組中Peptostreptococcus、Parvimonas、Eubacterium、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、SR1_genera_incertae_sedis、Catonella、Mogibacterium、Solobacterium相對豐度均比B組顯著減少（P＜0.05），A組中Corynebacterium相對豐度比B組顯著增加（P＜0.05）（表2）。

2.4 樣品的PCA與聚類分析

2.4.1 PCA分析

采用QIIME進行PCA分析，其中一個點代表一個樣本，相同的顏色表示是同一組的樣本，2 個點之間的距離越近，說明2 個樣品的微生物群落差異越小。由PCA結(jié)果可知，2 組樣本均比較分散，主成分區(qū)分度不是特別明顯，但在各自象限均占主要優(yōu)勢（圖5），說明2 組樣本的主成分有一定差異，但沒有顯著差異。這可能與本研究的采樣對象均為健康大學生群體有關(guān)，還需要擴大取樣人群范圍進一步研究。

圖5 A組和B組樣品的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of salivary microbial communities in two groups

2.4.2 聚類分析

物種分類heatmap圖用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來。將屬水平上的分類信息進行組間豐度相似性聚類，將聚類后數(shù)據(jù)表示在熱圖上，將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

圖6 A組和B組樣品的菌群組成熱圖Fig.6 Heat map analysis of salivary microbial community structures in two groups

由菌群組成的熱圖（圖6）可知，紅色代表細菌豐度高，藍色代表細菌豐度低，2 組樣本的菌落組成存在差異，如Haemophilus、Gemella、Rothia等在A組中豐度較高，Peptostreptococcus、Neisseria、Saccharibacteria、Fusobacterium等在B組中豐度較高，而Streptococcus在2 組中沒有明顯變化。

3 討 論

學者們普遍認為口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展是由口腔中微生物群落結(jié)構(gòu)所調(diào)控，而其中唾液微生物有重要的影響[24-25]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及微生態(tài)的興起，人們越來越關(guān)注口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性對健康的潛在影響[26]。從微生物群落結(jié)構(gòu)差異的角度來探索個人飲食習慣與健康的關(guān)聯(lián)是微生態(tài)研究的切入點。

本研究關(guān)注大學生這一群體，實驗研究對象選擇在校大學生，飲食與生活習慣相對一致，且學校生活較為規(guī)律，其他環(huán)境因素影響較小，所選用的個體均經(jīng)過嚴格篩選，盡可能選擇在其他方面統(tǒng)一的志愿者，保證樣本的可靠性。通過對葷素飲食不同的兩組大學生口腔內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本有著相似的菌群多樣性指數(shù)，但部分菌群的豐度，在門水平和屬水平上存在顯著組間差異；其中，還有值得關(guān)注的潛在致病菌或條件致病菌，如Corynebacterium、Streptococcus等菌屬[27-28]。

口腔唾液有著復雜的微生物群落結(jié)構(gòu)，本研究結(jié)果表明口腔唾液中Corynebacterium、Streptococcus等潛在致病或條件致病菌的屬與常吃葷食呈正相關(guān)，而Peptostreptococcus、Eubacterium等無害菌屬與常吃葷食呈負相關(guān)。這種微生物種群差異也說明，飲食習慣對口腔微生物存在一定影響，合理飲食結(jié)構(gòu)，多吃蔬菜水果，控制肉類的攝入，將有助于人們的身體健康[29]。需要指出的是，本研究結(jié)果還需要后續(xù)加大樣本數(shù)量，設置重復樣品，并通過收取志愿者不同時間周期的樣品[30]，研究口腔的微生物菌群動態(tài)變化，進一步研究飲食習慣與菌群結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，對于指導在校學生合理膳食具有現(xiàn)實意義。