王澤顥，顧 雙，王向陽*，潘 炎，王煌明，陳顏龍

（1.浙江大學(xué)信息與電子工程學(xué)院，浙江 杭州 310012；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310012；3.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；4.浙江省杭州市第二中學(xué)，浙江 杭州 330100）

甲殼素是從蝦蟹、真菌等提取，經(jīng)脫乙酰變成殼聚糖，已用作食品添加劑、水處理劑、飼料添加劑、醫(yī)學(xué)上創(chuàng)傷敷料等。殼聚糖作為天然抑菌劑，已廣泛應(yīng)用于食品防腐保鮮[1]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]規(guī)定殼聚糖在西式火腿類、肉灌腸類中最大使用量為6 g/kg。李冬等[3]開展殼聚糖微球?qū)π∈蠹毙远拘耘c長期毒性實驗，發(fā)現(xiàn)小鼠全部存活，未見異常及死亡，進(jìn)而對家兔進(jìn)行急性毒性實驗、皮膚刺激實驗和長期毒性實驗，均未發(fā)現(xiàn)兔的采食量、行為外觀及糞便異常。張榮等[4]開展殼聚糖對小鼠長期毒性實驗、小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核實驗、Ames實驗和小鼠精子畸變實驗，均沒有發(fā)現(xiàn)任何毒性反應(yīng)。

然而，本實驗室偶然發(fā)現(xiàn)殼聚糖會導(dǎo)致泥鰍快速死亡，目前鮮有報道殼聚糖會致死泥鰍或其他動物。預(yù)實驗選用蝦、鯽魚、泥鰍和黃顙魚，發(fā)現(xiàn)殼聚糖能引起泥鰍急性死亡，黃顙魚死亡提早，而蝦、鯽魚對殼聚糖不敏感。泥鰍是食品原料，在生物分類學(xué)上屬鯉形目、鰍科、泥鰍屬，具有適應(yīng)性強(qiáng)、疾病少、成活率高等特點，適合做生物安全性研究，常被用于水體污染物監(jiān)測實驗[5]。劉安軍等[6]選用水溶性低分子質(zhì)量殼聚糖對小鼠做腹腔注射致脫毛實驗，得出殼聚糖導(dǎo)致鼠脫毛與腎毒性相關(guān)。

目前公認(rèn)殼聚糖能夠抑制細(xì)菌、真菌生長，且對植物和動物的細(xì)胞是安全的，但殼聚糖抑菌和對動植物安全性機(jī)制還未完全清楚。殼聚糖能夠引起泥鰍急性死亡，說明殼聚糖對動物的安全性可能還有漏洞，通過找出殼聚糖致死泥鰍原因，有利于減輕對殼聚糖副作用的擔(dān)憂，并了解其是否會在特殊狀態(tài)下對人類產(chǎn)生危害。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泥鰍（每尾約15 g，體長約11.6 cm），體質(zhì)量差異在1.5 g以內(nèi)，購自杭州文二街農(nóng)貿(mào)市場、杭州下沙農(nóng)貿(mào)市場等。

水溶性殼聚糖（脫乙酰度≥90%）、高分子質(zhì)量殼聚糖（脫乙酰度≥90%）、低分子質(zhì)量殼聚糖（脫乙酰度≥80%） 青島弘海生物技術(shù)有限公司；海藻酸鈉青島明月海藻集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SO-200-D紅外線二氧化碳分析儀 北京金信誠有限責(zé)任公司；RSS-5100溶解氧儀 華辰樂天生物實驗設(shè)備（北京）有限公司；XSH-1A倒置顯微鏡 上海碩光電子科技有限公司；ZDJ-5自動滴定儀（配備檢測電極和參比電極） 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HI2300電導(dǎo)率儀 意大利HANNA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

泥鰍購買后置于塑料培養(yǎng)箱中，用經(jīng)過曝氣處理的自來水常溫馴養(yǎng)7 d，每天換水并去除不活潑或生病狀態(tài)的泥鰍。所用批次的泥鰍死亡率不超過5%。

除特殊說明外，殼聚糖均采用水溶性殼聚糖，以去離子水溶解，0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 6.0，水溫28 ℃，每組泥鰍為20 尾，置于1 L殼聚糖溶液中，對照組采用曝氣處理的自來水。實驗重復(fù)3 次。

1.3.2 殼聚糖種類、質(zhì)量濃度及溫度對泥鰍死亡時間的影響

1.3.2.1 殼聚糖種類

處理組分別取5 g/L水溶性殼聚糖溶液、低分子質(zhì)量殼聚糖溶液、高分子質(zhì)量殼聚糖溶液，后2 種殼聚糖以體積分?jǐn)?shù)0.3%醋酸溶液溶解，并調(diào)至pH 6.0。將泥鰍分別置于上述溶液，其他處理同1.3.1節(jié)。

1.3.2.2 殼聚糖質(zhì)量濃度

處理組分別取0、1、5、10 g/L殼聚糖溶液，將泥鰍分別置于上述溶液，其他處理同1.3.1節(jié)。

1.3.2.3 殼聚糖溶液溫度

處理組取5 g/L殼聚糖，水溫設(shè)為12 ℃和28 ℃，將泥鰍分別置于上述溶液，其他處理同1.3.1節(jié)。

1.3.3 殼聚糖對泥鰍毒性評價實驗

每組20 尾泥鰍放入1 L梯度質(zhì)量濃度（0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 mg/L）殼聚糖溶液，每24 h更換一次處理液，實驗期間曝氣，但不喂食。觀察并記錄96 h后各組泥鰍死亡和中毒癥狀，得到96 h泥鰍的絕對死亡濃度（absolute lethal concentration，LC100）和全部存活的最大濃度（即最大耐受濃度）。根據(jù)所得LC100和最大耐受濃度，設(shè)置質(zhì)量濃度：2、4、8、16、32、64 mg/L和128 mg/L[7]。于96 h后統(tǒng)計死亡率，用寇氏法[8]計算96 h半致死濃度（half lethal concentration，LC50）。

1.3.4 非殼聚糖因素排除實驗

1.3.4.1 雜質(zhì)的影響

將5 g殼聚糖以100 mL體積分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液浸泡1 h后，5 000 r/min、4 ℃離心10 min取沉淀，重復(fù)提取3 次。沉淀揮發(fā)乙醇后，65 ℃烘干，得到提純后的殼聚糖。500 mL的1%殼聚糖溶液中加入1 mol/L NaOH溶液以沉淀殼聚糖，調(diào)pH值至9.0，5 000 r/min、4 ℃離心10 min取上清液，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)上清液pH值至6.0，得到去除殼聚糖的雜質(zhì)溶液。將泥鰍分別置于5 g/L未提純殼聚糖、5 g/L提純后的殼聚糖、去除殼聚糖的雜質(zhì)溶液。將泥鰍分別置于上述溶液，其他處理同1.3.1節(jié)。

1.3.4.2 pH值的影響

市售水溶性殼聚糖常含有少量H C l。處理組分別為未調(diào)pH值（pH 4.7）、pH 5.5、pH 6.0（以0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值）的5 g/L殼聚糖溶液，對照組分別為pH 4.7、pH 5.5、pH 6.0的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液及相同pH值梯度的0.05 mol/L HCl溶液（以0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值）。將泥鰍分別置于上述溶液，其他處理同1.3.1節(jié)。

1.3.4.3 聚合物對魚鰓的影響

分別配制5 g/L殼聚糖、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠溶液，以0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 6.0，并采用黏度計測定溶液黏度。將泥鰍分別置于上述溶液，其他處理同1.3.1節(jié)。

1.3.4.4 溶解氧的影響

將泥鰍分別置于5 g/L殼聚糖和曝氣處理的自來水中，水溫12 ℃，觀察溶液外觀變化，測定0、0.5、2.5、4.0 h時溶解氧質(zhì)量濃度。

充氣處理實驗：將泥鰍置于5 g/L殼聚糖溶液中，處理組接入空氣泵，持續(xù)充氣，對照組不充氣，水溫28 ℃，記錄泥鰍死亡時間。

1.3.5 殼聚糖對泥鰍生理指標(biāo)的影響

1.3.5.1 泥鰍器官損傷觀察

5 g/L殼聚糖處理泥鰍1 h。取瀕臨死亡的泥鰍和未處理對照。對泥鰍進(jìn)行解剖，顯微觀察魚鰓、內(nèi)臟、頭部組織，并對魚鰓顯微拍照。剪斷泥鰍尾部，取血滴于載玻片上，觀察血液色澤和凝血時間。

1.3.5.2 泥鰍體表黏液殘余率的測定

各取6 尾泥鰍投入1、5、10 g/L殼聚糖溶液和曝氣處理的自來水，3 h后取出，紗布吸干泥鰍體表水分，稱體質(zhì)量（m0），用固體NaCl擦拭泥鰍體表去除黏液，用水沖洗3 次，紗布吸干體表水分，稱體質(zhì)量（m）。泥鰍體表黏液殘余率按公式（1）計算。

1.3.5.3 泥鰍呼吸強(qiáng)度的測定

將泥鰍置于5 g/L殼聚糖溶液和曝氣處理的自來水中0.5 h，各取2 尾（體質(zhì)量差異0.5 g之內(nèi)）置于密封的2 L透明塑料容器中，放入CO2含量測定儀，開機(jī)后蓋上容器蓋子，每隔0.5 min記錄CO2含量，持續(xù)4 min。泥鰍呼吸強(qiáng)度按公式（2）計算。

1.3.5.4 泥鰍魚肉pH值的測定

將泥鰍分別置于5 g/L殼聚糖溶液和曝氣處理后的自來水中1 h，水溫12 ℃，處理組和對照組泥鰍各3 尾。處死0.5 h后去內(nèi)臟，取5 g肌肉加3 倍質(zhì)量蒸餾水打漿，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。取上清液測定pH值。

1.3.5.5 泥鰍紅細(xì)胞核異常率的測定

參考文獻(xiàn)[5,9]的方法，將泥鰍分別置于0、5、10、15、20、25 mg/L殼聚糖溶液中，水溫25 ℃，不投食，每24 h更換溶液。分別于24、48、72 h和96 h，各組隨機(jī)取出3 尾，擦干體表水分，斷尾取血，晾干，純甲醇固定10 min，清水沖洗，晾干，Giemsa染液（0.2 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液10 倍體積稀釋）染色15～20 min，清水沖洗，晾干，油鏡觀察。每張血涂片觀察2 000 個細(xì)胞，記錄具有核異常的紅細(xì)胞數(shù)量。紅細(xì)胞核異常率按公式（3）計算。

1.3.5.6 溶液電導(dǎo)率、pH值、NH3溶出率以及泥鰍離子溶出率的測定

將泥鰍分別置于150 mL5 g/L殼聚糖、去離子水中，每組3 尾，磁力攪拌，速率為1檔。用電導(dǎo)儀測定溶液電導(dǎo)率[10]；鑒于殼聚糖可能會對離子有吸收作用，不進(jìn)行相對電導(dǎo)率計算。pH計測定溶液pH值。泥鰍K＋、Ca2＋、Na＋、Cl－離子和NH3溶出率測定樣品處理同上，測定方法參考顧雙[11]、Vardar[12]、Zhou Li[13]等的方法。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定去離子水電位和殼聚糖溶液電位。在0～2 h內(nèi)測定處理和對照液體中K＋、Ca2＋、Na＋、Cl－、NH3電位。測完后，將所有液體和泥鰍合并打漿研磨，再用電極測定各離子總量。測定時發(fā)現(xiàn)偶然有電位尖銳的峰，屬泥鰍觸碰引起。測定值扣掉水電位后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算X值。處理組還要減去殼聚糖中的離子和氨。泥鰍離子溶出量按公式（4）計算。

式中：X為電位值對應(yīng)各離子標(biāo)準(zhǔn)曲線上物質(zhì)的量濃度對數(shù)值；M為離子相對分子質(zhì)量；V為溶液體積/L；mf為樣品質(zhì)量/g。

泥鰍離子溶出率按公式（5）計算。

殼聚糖對鈣離子有絡(luò)合作用，會產(chǎn)生沉淀。2 h后所檢的總鈣離子含量很低，因此鈣離子總量為殼聚糖原初溶液鈣離子含量與泥鰍鈣離子含量之和。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進(jìn)行分析處理，計算數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，處理與對照進(jìn)行t檢驗，當(dāng)P＜0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖種類、質(zhì)量濃度及溶液溫度對泥鰍死亡時間的影響

圖1 殼聚糖種類（a）、質(zhì)量濃度（b）和溶液溫度（c）對泥鰍死亡時間的影響Fig.1 Effects of different kinds （a） and concentrations （b） of chitosan and different treatment temperatures （c） on death time of loach

泥鰍在無殼聚糖的對照溶液中很正常，在24 h內(nèi)無死亡。28 ℃下，將泥鰍放置于3種質(zhì)量濃度均為5 g/L的殼聚糖中，發(fā)現(xiàn)4 h內(nèi)全部急性死亡，說明不同種類的殼聚糖都會引起泥鰍急性死亡（圖1a）。泥鰍在1 g/L殼聚糖溶液中竄動加快；在5、10 g/L殼聚糖中急速竄動。殼聚糖質(zhì)量濃度越高，泥鰍死亡時間越早（圖1b）。泥鰍在12 ℃和28 ℃下的5 g/L殼聚糖溶液中，全部急性死亡，說明溫度越高泥鰍死亡越快（圖1c）。

2.2 殼聚糖對泥鰍毒性評價結(jié)果

毒性評價實驗顯示殼聚糖對泥鰍的96 h L C100為12 0 m g/L，最大耐受濃度為2 m g/L，96 h L C50為16 m g/L。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》，96 h LC50低毒范圍為LC50＞10 mg/L；因此，殼聚糖對泥鰍的毒性為低毒，數(shù)值接近中毒。根據(jù)GB/T 21281—2007《危險化學(xué)品魚類急性毒性分級試驗方法》，水環(huán)境毒性急性III的LC50為10＜LC50≤100 mg/L，因此，殼聚糖對泥鰍急性毒性分級屬于急性III，數(shù)值接近急性II。

2.3 干擾因素對泥鰍死亡時間的影響

2.3.1 雜質(zhì)的影響

為判斷殼聚糖對泥鰍的毒性是否由殼聚糖中雜質(zhì)引起，故對殼聚糖進(jìn)行純化。排除雜質(zhì)影響實驗顯示泥鰍在去除殼聚糖的雜質(zhì)液體24 h內(nèi)沒有死亡，而在未純化的殼聚糖、純化的殼聚糖中的死亡時間分別為（2.37±0.43）、（2.38±0.42）h。雜質(zhì)對泥鰍死亡無影響。

2.3.2 pH值的影響

市售殼聚糖的pH值常較低，需要了解低pH值是否引起泥鰍死亡。實驗結(jié)果顯示泥鰍在磷酸對照、HCl對照中24 h均沒有死亡，而在pH 4.7、5.5、6.0的5 g/L殼聚糖中，死亡時間分別為（1.03±0.12）、（2.00±0.52）、（2.34±0.42）h。實驗表明，低pH值加速殼聚糖致泥鰍死亡。

2.3.3 聚合物對魚鰓的影響

殼聚糖是高分子物質(zhì)，為判斷是否為殼聚糖堵塞泥鰍魚鰓，造成其呼吸障礙，導(dǎo)致死亡，比較不同高分子物質(zhì)對泥鰍的影響。實驗結(jié)果顯示，泥鰍在海藻酸鈉、阿拉伯樹膠溶液中24 h均沒有死亡，在殼聚糖溶液中死亡時間為（2.34±0.42）h。殼聚糖、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠溶液黏度分別為4.0、16.8、3.9 mPa·s。海藻酸鈉黏度遠(yuǎn)高于殼聚糖，阿拉伯樹膠黏度與殼聚糖類似，高分子聚合物中僅殼聚糖導(dǎo)致泥鰍死亡，說明殼聚糖致死作用具有專一性。

2.3.4 溶解氧的影響

圖2 充氣處理對泥鰍死亡時間的影響Fig.2 Effect of oxygen supply on death time of loach

由圖2可見，泥鰍在充氣處理或不充氣的5 g/L殼聚糖溶液中都出現(xiàn)急性死亡，二者沒有顯著差異，說明提高溶液氧氣含量不能明顯減少泥鰍死亡，其原因可能是殼聚糖已經(jīng)損害了泥鰍呼吸系統(tǒng)。

2.4 殼聚糖對泥鰍的毒性原因分析

2.4.1 殼聚糖對泥鰍器官的影響

泥鰍放入殼聚糖溶液中后，體表滑液立即變白且大量脫落，出現(xiàn)輕微血絲。后期泥鰍沉于水底，死前偶然跳動。解剖后泥鰍中未觀察到處理組和對照組內(nèi)臟器官的差異，也未見血液色澤和凝血時間差異。殼聚糖處理的泥鰍魚鰓表面有許多黏附物（圖3a），對照魚鰓則較干凈（圖3b）。

圖3 殼聚糖處理對泥鰍魚鰓的影響Fig.3 Effect of chitosan treatment on gills of loach

2.4.2 殼聚糖對泥鰍及其養(yǎng)殖環(huán)境的影響

圖1 殼聚糖處理對泥鰍體表黏液殘余率（a）、呼吸強(qiáng)度（b）、溶液中溶解氧質(zhì)量濃度（c）的影響Fig.1 Effect of chitosan treatment on mucilage residue （a）, respiration intensity （b） and dissolved oxygen concentration （c）

泥鰍未經(jīng)殼聚糖處理，體表黏液殘余率為7.1%，經(jīng)過1、5、10 g/L殼聚糖處理3 h后，與對照相比體表黏液殘余率顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），分別下降至5.0%、2.3%和3.0%。這與觀察到的泥鰍體表黏液脫落現(xiàn)象相符，可能會抑制泥鰍皮膚呼吸（圖4a）。

泥鰍在殼聚糖溶液中0.5 h時的呼吸強(qiáng)度顯著高于對照組（P＜0.01），3 種質(zhì)量濃度殼聚糖處理泥鰍的呼吸強(qiáng)度均上升2 倍以上，處理組之間差異不顯著。說明殼聚糖可能通過刺激泥鰍運動，加劇了泥鰍呼吸作用（圖4b）。

溶解氧質(zhì)量濃度開始時為4.6 mg/L，殼聚糖處理的泥鰍運動劇烈，2.5 h后溶解氧質(zhì)量濃度低于0.50 mg/L；對照組在4 h時，溶解氧質(zhì)量濃度為0.65 mg/L。魚類一般無法在溶解氧質(zhì)量濃度低于0.50 mg/L的水中生活。但泥鰍可以用魚鰓、皮膚和腸呼吸；如果水體缺氧，泥鰍會時常鉆到水面快速吸氣，進(jìn)行腸呼吸。殼聚糖處理的泥鰍后期沉于水底，無力到水面呼吸（圖4c）。

圖5 殼聚糖處理對泥鰍肌肉（a）和溶液pH值（b）的影響Fig.5 Effect of chitosan treatment on pH of loach （a） and pH of loach raising water （b）

殼聚糖處理的泥鰍pH值為7.22，顯著高于對照（pH 7.05）（圖5a）。一般活魚pH值為7.2～7.4，魚死后pH值會暫時下降，其原因是魚死后隨著糖原酵解成乳酸，pH值下降，達(dá)到低點后，因為堿性物質(zhì)生成，pH值重新上升。殼聚糖處理的泥鰍可能在死前大量消耗掉糖原，因此泥鰍死后肌肉pH值只有輕微下降。泥鰍糖原被消耗，將導(dǎo)致泥鰍無力浮出水面進(jìn)行腸呼吸。這與殼聚糖處理的泥鰍后期沉在水底癥狀相符合。

對照泥鰍溶液pH值從6.41緩慢上升到7.08，其溶液一直澄清。殼聚糖處理溶液呈酸性，開始時pH 4.75，其pH值上升較快，4 h時達(dá)到7.05（圖5b）。處理組溶液在0.5 h稍有渾濁，2.5 h渾濁程度較強(qiáng)，4 h時渾濁程度強(qiáng)，伴有大量泡沫。殼聚糖在中堿性條件下易產(chǎn)生凝絮。沒有泥鰍的pH 6.0水溶性殼聚糖溶液是澄清的。說明該渾濁情況除了與pH值上升有關(guān)，還可能與泥鰍黏液脫落等有關(guān)。殼聚糖處理的泥鰍魚鰓有黏附物，可能與溶液渾濁有關(guān)。

2.4.3 殼聚糖對泥鰍紅細(xì)胞核的影響

表1 殼聚糖處理對泥鰍紅細(xì)胞核異常率的影響Table1 Effect of chitosan treatment on erythrocyte cell nucleus abnormality in loach

泥鰍紅細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色。殼聚糖處理和對照處理的泥鰍均觀察到血紅細(xì)胞的核異?，F(xiàn)象，主要有微核、雙核、核質(zhì)外凸和核質(zhì)內(nèi)凹4 種。但是24、48、72 h和96 h的處理組與對照之間的核異常率均沒有顯著差異（表1），因此殼聚糖可能沒有進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)。

2.4.4 殼聚糖對溶液電導(dǎo)率、pH值、NH3溶出率以及泥鰍離子溶出率的影響

殼聚糖本身帶有電解質(zhì)，導(dǎo)致溶液的電導(dǎo)率顯著較高。殼聚糖促進(jìn)泥鰍電解質(zhì)滲出，其電導(dǎo)率上升速率為3.45 S/（m·min），顯著快于對照0.86 S/（m·min）。在2 h時，處理組溶液中NH3溶出率為5.34%，而對照組為0.89%。總氨氮由NH3和NH4＋組成，兩者比例與pH值有關(guān)。酸性條件下以NH4＋為主，pH值升高，說明NH3比例升高。如果考慮殼聚糖處理pH值較低，殼聚糖處理泥鰍的NH3溶出率遠(yuǎn)高于對照（圖6）。

圖6 殼聚糖對養(yǎng)殖泥鰍溶液電導(dǎo)率（a）、pH值（b）和NH3溶出率（c）的影響Fig.6 Effect of chitosan treatment on conductivity （a）, pH （b） and leaching rate of NH3 （c） in loach raising water

圖7 殼聚糖對泥鰍中Na＋（a）、K＋（b）、Ca2＋（c）、Cl－（d）溶出率的影響Fig.7 Effect of chitosan treatment on leaching rate of Na+ （a）, K+ （b）,Ca2+ （c） and Cl- （d） in loach raising water

殼聚糖在0～7 min和40～120 min促進(jìn)泥鰍鈉離子大量滲出。在2 h時，處理組泥鰍Na＋、K＋、Cl－溶出率為20.84%、7.04%、43.12%，而對照泥鰍Na+、K+、Cl－溶出率僅為2.82%、0.50%、0.69%，殼聚糖處理分別是對照的7.4、14 倍和62 倍（圖7）。殼聚糖導(dǎo)致泥鰍Cl－、Na＋、K＋大量溶出，說明殼聚糖促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)離子滲漏，這可能刺激泥鰍表皮神經(jīng)，以及影響魚鰓細(xì)胞功能。

對照2 h時，Ca2＋溶出率為2.10%，殼聚糖處理2 min，Ca2＋溶出率顯著上升，為63.04%，尚不清楚該上升是來自殼聚糖解吸還是泥鰍外表脫落，之后Ca2＋溶出率迅速下降。30 min后，進(jìn)入緩慢下降階段。2 h時溶液中Ca2＋溶出率為－95.34%，尚不清楚Ca2＋是被殼聚糖吸附沉淀還是被泥鰍吸收（圖7）。膜內(nèi)Ca2＋含量升高會引起快速型心率失常，但是解剖沒有發(fā)現(xiàn)血液異常，說明可能并非心肌異常引起。

3 討 論

動物急性死亡的常見機(jī)制主要是急性心力或循環(huán)衰竭（血液循環(huán)故障）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能障礙（主要是腦損傷）、急性呼吸衰竭（窒息）。殼聚糖是帶正電的高分子物質(zhì)，理論上是會與帶負(fù)電的大分子物質(zhì)結(jié)合，從而影響酶活性、核酸復(fù)制等。帶正電的未改性的殼聚糖不能穿透動物細(xì)胞，對細(xì)胞沒有毒性。季銨化殼聚糖的溶解性和細(xì)胞滲透性增加，有細(xì)胞毒性，會產(chǎn)生活性氧、阻滯細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞增殖，用疏水性基團(tuán)修飾季銨化殼聚糖，能保留細(xì)胞滲透性，明顯減少細(xì)胞毒活性。帶負(fù)電荷的琥珀酰殼聚糖能高效地穿透細(xì)胞，刺激細(xì)胞增殖，具有安全性[14]。田豐等[15]報道，殼聚糖能夠促進(jìn)體外凝血。殼聚糖能夠顯著提高細(xì)菌、酵母細(xì)胞膜透性，造成電解質(zhì)和大分子物質(zhì)外泄，強(qiáng)烈抑制活體乳酸菌還原酶活性，能凝聚酵母菌并抑制酵母菌還原酶，但是幾乎不抑制大腸桿菌的還原酶活性[16]。其原因可能是殼聚糖會進(jìn)入乳酸菌和酵母菌細(xì)胞，而幾乎不進(jìn)入大腸桿菌。因此，殼聚糖是否促進(jìn)細(xì)胞膜滲漏和是否容易會進(jìn)入細(xì)胞，與其是否產(chǎn)生危害或作用有關(guān)。從現(xiàn)有報道看，殼聚糖對動物細(xì)胞膜透性影響較小，也不容易進(jìn)入動物細(xì)胞。王曉芹等[17]研究表明殼聚糖對兔子無皮膚、角結(jié)膜和肌肉刺激性，對角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞無毒性。石玲等[18]報道小鼠的殼聚糖最大耐受灌胃藥量為4.98 g/kg，一次性最大腹腔注射耐受量為1.66 g/kg，且體質(zhì)量、血常規(guī)、肝功能、腎功能、血糖和血脂等生化指標(biāo)均正常。Zhao Yang等[19]認(rèn)為高濃度羧甲基殼聚糖對小鼠的血液系統(tǒng)沒有影響。本研究沒有發(fā)現(xiàn)殼聚糖干擾泥鰍體內(nèi)凝血，也沒有升高紅細(xì)胞核異常率，說明殼聚糖可能沒有進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，其抑制腦部神經(jīng)的可能性較低。另外殼聚糖導(dǎo)致泥鰍運動加劇，有明顯的刺激皮膚神經(jīng)作用。因此，推測殼聚糖很可能造成泥鰍急性呼吸衰竭導(dǎo)致其死亡。

泥鰍在pH 5.0和pH 9.0水中，經(jīng)過50 h左右才全部死亡。而殼聚糖處理泥鰍在4 h內(nèi)死亡，顯然泥鰍不是酸、堿中毒而死亡。高濃度的氨會使魚的次級鰓絲上皮腫脹，使魚從水中獲取氧的能力降低，甚至使魚窒息死亡。鱖魚96 h的LC50為0.193 mg/L[20]。殼聚糖引起泥鰍中毒，可能與氨含量過高有關(guān)，其破壞泥鰍魚鰓，抑制鰓呼吸，殼聚糖帶有大量氨基，與泥鰍黏液結(jié)合，造成泥鰍黏液脫落。泥鰍體表的黏液有防病蟲害，協(xié)調(diào)皮膚滲透壓，保持代謝持穩(wěn)定，維持正常生理作用。泥鰍黏液的主要成分是水和透明質(zhì)酸（haluronic acid，HA），另外還含有少量的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸等[21-22]。HA包覆殼聚糖納米粒，用于抗腫瘤[23]，輸送地塞米松藥物[24]，說明兩者能夠結(jié)合。殼聚糖破壞了HA分子物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)而使黏液脫落，既干擾了皮膚正常滲透壓的調(diào)節(jié)，也可能影響魚鰓的呼吸作用。殼聚糖處理泥鰍溶液的電導(dǎo)率、Cl－、Na＋、K＋溶出率顯著增加，說明殼聚糖影響泥鰍細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，致使膜內(nèi)電解質(zhì)大量滲出。殼聚糖可改變大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)、外膜的滲透性，從而使細(xì)胞膜被破壞，并伴隨大量內(nèi)溶物（DNA和mRNA）的溢出。殼聚糖與細(xì)胞膜間的作用主要是殼聚糖中的—NH3＋和卵磷脂中—C＝O、—P＝O形成了新的化合物引起的[25]。離子大量滲漏可能破壞魚鰓等細(xì)胞的功能，并可能刺激皮膚神經(jīng)，造成泥鰍運動加劇，促進(jìn)泥鰍呼吸強(qiáng)度大幅上升，耗盡體內(nèi)糖原，從而導(dǎo)致泥鰍后期無力浮出水面進(jìn)行腸呼吸，并造成水體氧氣含量過低。殼聚糖對泥鰍本身魚鰓、皮膚、腸呼吸三方面產(chǎn)生的負(fù)面影響，以及對環(huán)境氧氣的消耗，可能造成泥鰍急性死亡。

殼聚糖對口腔癌細(xì)胞Ca9-22有毒，對正常細(xì)胞HaCaT毒性小。殼聚糖處理Ca9-22導(dǎo)致G1/S細(xì)胞周期阻滯和TUNEL法檢測陽性細(xì)胞（細(xì)胞凋亡）增加，有早期凋亡細(xì)胞形態(tài)和胱天蛋白酶活性少量增加[26]，說明殼聚糖對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞具有特異性。

殼聚糖對動植物無毒，可能與動植物含有大量分解殼聚糖的酶有關(guān)。許多微生物、動物及植物中都有幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶都能專一降解殼聚糖。另外還有很多非專一性酶也能降解殼聚糖，例如纖維素酶、蛋白酶、糖苷酶、單寧酶等[27-32]。其水解最適pH值為3.0～5.0[32]，說明pH值影響酶對殼聚糖的降解。各種酶降解殼聚糖的能力大小為：纖維素酶＞胃蛋白酶＞果膠酶＞木瓜蛋白酶[31]。

植物有纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、β-甘露聚糖酶等分解殼聚糖，防止受到其危害。人類等動物的消化道具有胃蛋白酶，胃中環(huán)境為酸性，能夠降解殼聚糖，因此食用殼聚糖具有很高的安全性。但是當(dāng)胃酸偏少、胃蛋白酶等活性受到其他物質(zhì)抑制或非正常生理狀態(tài)導(dǎo)致胃蛋白酶等活力大幅降低，或者聯(lián)合食用其他物質(zhì)促進(jìn)殼聚糖進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，此時殼聚糖對人體是否仍然安全有待進(jìn)一步研究。殼聚糖會引起泥鰍急性死亡，說明殼聚糖對泥鰍具有物種特殊性，殼聚糖會與泥鰍黏液中的HA快速結(jié)合，導(dǎo)致溶液pH值快速上升，從而降低蛋白酶等對殼聚糖的降解，可能加重其危害。殼聚糖引起泥鰍急性死亡主要與損害泥鰍呼吸系統(tǒng)有關(guān)，但殼聚糖一般不會進(jìn)入人類呼吸系統(tǒng)；因此殼聚糖按照食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)使用還是安全的。