田 勇，周 督，鄒雙憶，孫星宇，郅 琦，李福香，明 建,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)附屬中學(xué)，重慶 400715；3.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

衰老是導(dǎo)致正常細(xì)胞調(diào)節(jié)功能障礙的重要因素，影響神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)[1]，是多種慢性疾病的致病風(fēng)險(xiǎn)因素，包括癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等[2]。衰老相關(guān)疾病中腦老化問(wèn)題日益突出，越來(lái)越受到人們關(guān)注。腦老化是一種正常的生理現(xiàn)象，若腦老化急劇惡化，會(huì)導(dǎo)致病理性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，最典型的是阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD），主要癥狀為智力、記憶力、感官定向能力、判斷力、語(yǔ)言思維能力不可逆地進(jìn)行性退化，并常伴有認(rèn)知和行為障礙[3-4]。因此，不斷探索具有預(yù)防腦老化、改善記憶認(rèn)知能力的抗衰老功能性食品，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的防治具有重大意義。

昆侖雪菊，又名兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria），屬菊科金雞菊屬類(lèi)一年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲，現(xiàn)分布于世界各地。在中國(guó)廣泛種植于新疆維吾爾自治區(qū)的高原積雪地區(qū)（海拔3 000 m以上），又被稱(chēng)為“雪菊”[5]。昆侖雪菊含有黃酮、有機(jī)酸、萜類(lèi)、皂苷等多種生物活性成分，其中黃酮類(lèi)化合物含量最為豐富[5-6]。昆侖雪菊用作茶飲主要的生物活性集中水溶性部分，且黃酮類(lèi)化合物是其水提取物中的主要生物活性成分[7]。昆侖雪菊黃酮具有降血脂[8]、降血糖[9]、抗氧化[10-11]、抗炎[12-13]、降血壓和舒張血管[14-15]等生物活性；同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)昆侖雪菊黃酮具有良好的抗衰老[16-17]和抗神經(jīng)退行性病變的功效[18]，但作用機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖致衰老小鼠模型，研究昆侖雪菊水溶性黃酮提取物（water soluble flavonoids from Coreopsis tinctoria flowers，CTWF）對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并從膽堿能系統(tǒng)功能和氧自由基損傷方面探討其作用機(jī)制，以期為昆侖雪菊藥食功能的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)昆明種小鼠：雌、雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自重慶中藥研究院（動(dòng)物合格證號(hào)：0005580）。動(dòng)物全程飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（渝）2014-0002）。

昆侖雪菊（Coreopsis tinctoria）采摘于新疆昆侖山海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院藥劑科趙生俊主任醫(yī)師鑒定。

乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘆丁、綠原酸、兒茶素、花旗松素、D-半乳糖美國(guó)Sigma公司；黃諾馬苷、馬里苷 法國(guó)Extrasynthése公司；PH1714印度墨汁 福州飛凈生物科技有限公司；VE、生理鹽水、無(wú)水乙醇等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Morris MT-200型水迷宮 成都泰盟科技有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；JS10型手持勻漿機(jī) 揚(yáng)州均瑞機(jī)械設(shè)備有限公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；synegyH1MG型酶標(biāo)儀 美國(guó)基因公司；VIS-722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CTWF的制備與組分分析

1.3.1.1 CTWF的制備

參照Z(yǔ)hang Weixin等[17]的方法制備CTWF，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件稍作修改。在裝有10 g昆侖雪菊的燒杯中加入100 mL蒸餾水并在沸騰的水浴鍋中浸提3 次，每次30 min。所有浸提液抽濾后合并，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后凍干成粉。CTWF凍干粉的得率為（43.60±1.78）%。CTWF為膠狀棕褐色固體，經(jīng)鑒定其主要活性成分為黃酮類(lèi)化合物[19]。

1.3.1.2 CTWF中總黃酮含量測(cè)定

參照吳瑛等[20]的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)溶液，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x/（μg/mL））為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

CTWF中總黃酮含量的測(cè)定：移取1 mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的樣品溶液，以不加樣品溶液為空白，按制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟處理后，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出CTWF中總黃酮含量。

1.3.1.3 HPLC法鑒定分析CTWF中的活性成分

參照Liang Qiang等[21]的方法，稍作修改。采用BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為乙腈、B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，梯度洗脫（0～5 min，10% A；5～50 min，10%～40% A；50～55 min，40%～10% A；55～60 min，10% A）；流速0.7 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃；檢測(cè)器為L(zhǎng)C-20A二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）；色譜數(shù)據(jù)在200～600 nm范圍內(nèi)掃描，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。根據(jù)保留時(shí)間、液相紫外色譜圖和外標(biāo)法定性定量分析CTWF中的活性成分。

1.3.2 動(dòng)物分組及給藥處理

小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±3）℃，相對(duì)濕度（40±10）%，12 h晝夜交替，自由飲食飲水。60 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組（每組12 只，雌、雄各半）：正常對(duì)照組（normal control，NC）、模型組（model control，MC）、VE陽(yáng)性對(duì)照組（VE positive control，PC）、CTWF低劑量組（low dose of CTWF-treated group，CTWF-L）和CTWF高劑量組（high dose of CTWF-treated group，CTWF-H）。除NC組外，其余各組小鼠頸背部皮下注射滅菌D-半乳糖液（CTWF灌胃劑量300 mg/kg，灌胃體積0.2 mL/10 g）構(gòu)建衰老模型[16]，NC組注射等體積量的滅菌生理鹽水，連續(xù)注射42 d。造模1 h后，藥物組（CTWF-L、CTWF-H）分別以150、600 mg/（kg·d）劑量灌胃CTWF，灌胃體積為0.2 mL/10 g；PC組以50 mg/（kg·d）劑量等體積灌胃VE溶液；NC、MC組灌胃等體積量滅菌生理鹽水，連續(xù)灌胃42 d。實(shí)驗(yàn)期間每7 d稱(chēng)質(zhì)量1次，按體質(zhì)量變化調(diào)整注射及灌胃劑量。

1.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

小鼠末次給藥后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮主要由圓形水池（直徑80 cm、高度30 cm）和可移動(dòng)平臺(tái)（直徑10 cm、高度28 cm）組成，水池連接著一個(gè)數(shù)字?jǐn)z像機(jī)和一臺(tái)計(jì)算機(jī)用于記錄和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將迷宮均等分為4 個(gè)象限，平臺(tái)固定放置在第一象限中央，注入水后加入對(duì)小鼠無(wú)害的印度墨汁，使小鼠看不到隱藏在水中的平臺(tái)，水面高出平臺(tái)1～2 cm，水溫保持25 ℃左右。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括2部分：定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)[22]。

定位航行實(shí)驗(yàn)：評(píng)價(jià)衰老小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。第一次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，讓小鼠自由游泳2 min以適應(yīng)周?chē)h(huán)境。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，選擇第二、三、四象限的池壁中點(diǎn)作為入水點(diǎn)，將動(dòng)物面朝池壁輕輕放入水中，避免應(yīng)激和將小鼠頭部浸入水中。小鼠有120 s的時(shí)間尋找平臺(tái)，小鼠在平臺(tái)上停留超過(guò)2 s判斷為尋找平臺(tái)成功，所需的時(shí)間記作潛伏期。若小鼠在120 s內(nèi)找到平臺(tái)，使其在平臺(tái)上停留30 s記憶平臺(tái)位置，并記錄其潛伏期；若小鼠在120 s內(nèi)未成功找到平臺(tái)，則用手將其引至平臺(tái)，放置30 s，使得小鼠記憶平臺(tái)位置，記錄其潛伏期為120 s。每天上下午各進(jìn)行1 次訓(xùn)練，每次為1 個(gè)時(shí)段，進(jìn)行3 d，共6 個(gè)時(shí)段。記錄每個(gè)時(shí)段小鼠找到平臺(tái)所需的潛伏期。

空間探索實(shí)驗(yàn)：評(píng)價(jià)衰老小鼠空間位置記憶保持能力。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，移去平臺(tái)，將小鼠從第二、三、四象限的某一點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄其在120 s內(nèi)穿越目標(biāo)象限（原平臺(tái)所在第一象限）的次數(shù)，即穿越次數(shù)。

1.3.4 腦組織SOD、GSH-Px、AchE活力及MDA、Ach含量的測(cè)定

Morris測(cè)試完成后，小鼠禁食不禁水24 h，頸椎脫臼處死，取腦組織以1∶9（m/V）的比例加入預(yù)凍滅菌生理鹽水，用手持勻漿機(jī)反復(fù)勻漿制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所示，測(cè)定腦組織AchE、SOD、GSH-Px活力及Ach、MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果表示為±s，并采用單因素ANOVA和Duncan多重比較分析，P＜0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTWF的HPLC分析

2.1.1 CTWF主要成分的定性分析

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與CTWF色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substances and CTWF

通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的保留時(shí)間和液相紫外色譜圖定性分析CTWF的主要成分[21]。如圖1所示，CTWF包含綠原酸、黃諾馬苷、兒茶素、花旗松素和馬里苷，說(shuō)明CTWF的主要活性成分由酚酸和黃酮類(lèi)化合物組成，其中黃酮類(lèi)化合物種類(lèi)更多。同時(shí)，CTWF的色譜峰還有較多未被鑒定出來(lái)，仍需進(jìn)一步研究。

2.1.2 CTWF主要成分的定量分析

表1 CTWF中各組分的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和含量Table1 Retention times, linear equations, correlation coeff i cients and contents of CTWF

通過(guò)外標(biāo)法定量分析CTWF的主要成分[13]。如表1所示，CTWF中黃諾馬苷含量最高，為（74.40±3.27）mg/g，其次是馬里苷（（5 3.2 5±1.3 1）m g/g）、兒茶素（（6.6 2±0.0 8）m g/g）、花旗松素（（6.3 6±0.1 4）m g/g）和綠原酸（（3.97±0.03）mg/g），說(shuō)明CTWF富含多酚，其中黃酮類(lèi)化合物含量最高。同時(shí)，CTWF的總黃酮含量較高，為（314.97±26.16）mg/g。以上結(jié)果說(shuō)明，CTWF發(fā)揮活性功能的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是黃酮類(lèi)化合物。

2.2 CTWF對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表2 CTWF對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠體質(zhì)量的影響（n＝12）Table2 Effect of CTWF on body mass of D-galactose-induced aging mice （n= 12）

在衰老造模期間，小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)變化情況是反映其生長(zhǎng)發(fā)育及健康狀況的重要指標(biāo)之一[23]。如表2所示，各組小鼠之間初始體質(zhì)量無(wú)顯著差異（P＞0.05），而隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組小鼠體質(zhì)量均有所增加。通過(guò)灌胃CTWF后，對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明：從第7天開(kāi)始，MC組小鼠體質(zhì)量顯著低于NC組（P＜0.05），并且差異隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸增大的趨勢(shì)。從第7天開(kāi)始，CTWF-L組小鼠體質(zhì)量與NC組相比出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，PC、CTWF-H組小鼠體質(zhì)量與NC組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明CTWF對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響。

2.3 CTWF對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.3.1 CTWF對(duì)小鼠Morris水迷宮尋找平臺(tái)潛伏期的影響

圖2 CTWF對(duì)小鼠在訓(xùn)練過(guò)程中尋找平臺(tái)潛伏期的影響Fig.2 Effect of CTWF on escape latency of mice during training

Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組小鼠找到隱蔽平臺(tái)所需的時(shí)間（即潛伏期）逐漸縮短。從第2次訓(xùn)練開(kāi)始，MC組小鼠潛伏期顯著長(zhǎng)于NC組（P＜0.01），說(shuō)明D-半乳糖致衰老小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷，即造模成功。而PC組和CTWF-H組小鼠較MC組，其潛伏期在時(shí)段2～6期間均顯著縮短（P＜0.01，P＜0.05），并在時(shí)段6時(shí)效果最明顯（P＜0.01）。CTWF-L對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有一定的改善作用（P＜0.01，P＜0.05），但效果比CTWF-H差。以上結(jié)果說(shuō)明CTWF具有改善衰老模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的作用。

2.3.2 CTWF對(duì)小鼠Morris穿越目標(biāo)象限次數(shù)的影響

圖3 CTWF對(duì)小鼠穿越目標(biāo)象限次數(shù)的影響Fig.3 Effect of CTWF on crossing number of mice during training

小鼠水迷宮訓(xùn)練6 次以后撤掉平臺(tái)，測(cè)試各組小鼠的空間探索能力，從而反映小鼠的記憶保持能力。如圖3所示，小鼠穿越目標(biāo)象限次數(shù)具有組間差異。與NC組小鼠相比，MC組穿越次數(shù)顯著減少（P＜0.05），說(shuō)明D-半乳糖致衰老模型小鼠空間位置記憶保持能力受損，即造模成功。PC組、CTWF-L組和CTWF-H組小鼠穿越目標(biāo)象限的次數(shù)均比MC組顯著增多（P＜0.05），說(shuō)明CTWF具有提升衰老模型小鼠記憶保持能力的作用。

2.4 CTWF對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織膽堿能系統(tǒng)功能的影響

表3 CTWF對(duì)衰老小鼠腦組織Ach含量及AchE活力的影響（n＝ 12）Table3 Effect of CTWF on Ach content and AchE activity in brain tissues of aging mice （n= 12）

如表3所示，與NC組相比，D-半乳糖處理導(dǎo)致MC組小鼠腦組織中Ach含量顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。與MC組相比，CTWF-H及VE處理組小鼠腦組織內(nèi)Ach含量顯著增加（P＜0.05），而CTWF-L處理對(duì)腦組織中Ach含量有一定提升作用但不顯著（P＞0.05）。

此外，與NC組相比，MC組小鼠AchE活力顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。與MC組相比，CTWF-H組小鼠腦組織AchE活力顯著降低并恢復(fù)到正常水平（P＜0.05）。CTWF-L和VE處理使得衰老小鼠腦組織中AchE活力呈降低趨勢(shì)，但不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明CTWF的抗衰老作用與提升衰老小鼠腦組織膽堿能系統(tǒng)功能有關(guān)。

2.5 CTWF對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織抗氧化指標(biāo)的影響

表1 CTWF對(duì)衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響（n＝12）Table1 Effect of CTWF on SOD and GSH-Px activities and MDA content in brain tissues of aging mice （n= 12）

如表4所示，與NC組相比，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型組小鼠腦組織中SOD和GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。與MC組相比，PC組和CTWF-L組的SOD活力有所增加但不顯著（P＞0.05），CTWF-H組的SOD活力顯著增加（P＜0.05）；與MC組相比，VE和CTWF藥物處理均能顯著增加衰老小鼠腦組織GSH-Px活力（P＜0.05），且CTWF呈劑量依賴(lài)關(guān)系；與MC組相比，PC、CTWF-L和CTWF-H組小鼠腦組織MDA含量均顯著降低（P＜0.05），且CTWF呈劑量依賴(lài)關(guān)系。以上結(jié)果說(shuō)明CTWF的抗衰老作用與提升衰老小鼠腦組織抗氧化酶活力和降低脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)。

3 討 論

小鼠長(zhǎng)期注射D-半乳糖（50～500 mg/（kg·d），6～8 周）會(huì)導(dǎo)致其體內(nèi)過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積，抗氧化酶活力降低，線粒體和神經(jīng)元損傷，并常伴隨有認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)記憶障礙，引起與自然衰老和正常腦老化相似的衰老現(xiàn)象[24-25]。因此，D-半乳糖注射已被逐漸接受為腦老化研究或抗衰老藥理學(xué)研究中建立衰老模型的方法[23-26]。本研究選用昆明小鼠皮下注射D-半乳糖（300 mg/（kg·d））造模，造模時(shí)間為42 d。在造模期間，空白對(duì)照組和藥物處理組小鼠精神狀態(tài)良好、毛色光滑、皮膚有彈性、活動(dòng)敏捷、食欲良好且體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，模型組小鼠造模后出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、皮膚松弛、毛色灰暗粗糙、脫毛炸毛現(xiàn)象且體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢；同時(shí)，D-半乳糖致衰老模型組小鼠的各評(píng)價(jià)指標(biāo)均顯著區(qū)別于正常組（P＜0.05），表明構(gòu)建衰老模型成功。

Morris水迷宮是由Richard Morris于1984年開(kāi)發(fā)并逐步完善，用于研究腦損傷動(dòng)物模型學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知能力的一種行為學(xué)測(cè)試方法[27]。本研究采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)CTWF對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，衰老模型組小鼠的潛伏期在6 次訓(xùn)練過(guò)程中的縮短程度和撤去平臺(tái)后穿越目標(biāo)象限的次數(shù)均顯著低于正常組（P＜0.05），說(shuō)明D-半乳糖造模導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力嚴(yán)重受損。通過(guò)藥物處理干預(yù)后，VE陽(yáng)性對(duì)照組和CTWF高、低劑量組小鼠較衰老模型組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05，P＜0.01），穿越目標(biāo)象限的次數(shù)顯著增加（P＜0.05），表明CTWF可以起到改善衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用，減緩腦老化。

人和動(dòng)物的大腦學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知能力與膽堿能系統(tǒng)功能密切相關(guān)，腦組織中的Ach在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能中發(fā)揮主要作用[1,4,28]。隨著老化的發(fā)生，腦內(nèi)Ach含量也隨著減少，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的減退。AchE是反映膽堿能系統(tǒng)功能的一種特定蛋白酶，它能把突觸間隙中的Ach降解使其含量降低[29]。因此，提高腦內(nèi)Ach水平和降低AchE活力，從而提升腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能可能是抗衰老和改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)理之一。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠腦組織中的Ach含量和AchE活力均顯著區(qū)別于正常組（P＜0.05），說(shuō)明D-半乳糖致衰老小鼠膽堿能系統(tǒng)功能降低。長(zhǎng)期灌胃適當(dāng)濃度的CTWF可提高衰老小鼠腦組織中Ach含量（P＜0.05），降低AchE活力（P＜0.05），表明CTWF可能通過(guò)改善膽堿能系統(tǒng)功能而發(fā)揮減緩腦老化的作用。

大量研究表明，氧化應(yīng)激在腦老化、衰老相關(guān)性或神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1,3,30]。隨著衰老的加劇，體內(nèi)ROS積聚，導(dǎo)致細(xì)胞大分子物質(zhì)如DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生氧化損傷[31]。腦組織具有高氧需求、高水平不飽和脂質(zhì)和抗氧化防御機(jī)制相對(duì)缺乏的特點(diǎn)，更容易受到ROS的攻擊，從而加劇腦老化[1]。因此，抗氧化干預(yù)可能是防治神經(jīng)退行性疾病的重要途徑。SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的天然抗氧化酶，發(fā)揮機(jī)體抗氧化防御體系功能，可以有效抑制機(jī)體ROS的生成，間接反映機(jī)體清除自由基、免受氧化損傷的能力[32]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量的高低直接反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化水平，代表組織受自由基損傷程度[33]。本研究結(jié)果表明，D-半乳糖致衰老小鼠腦內(nèi)SOD、GSH-Px活力明顯降低（P＜0.05），MDA含量顯著增加（P＜0.05）；CTWF灌胃處理能不同程度提高衰老小鼠腦組織SOD和GSH-Px活力，顯著降低MDA含量（P＜0.05），表明CTWF在清除氧自由基和抗氧化方面著發(fā)揮重要作用。

綜上所述，CTWF具有明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，其可能由兩方面共同發(fā)揮作用：一方面提高腦組織Ach含量和降低AchE活力，從而提升膽堿能系統(tǒng)功能；另一方面提高腦組織SOD、GSH-Px活力和降低MDA含量，從而減少自由基氧化損傷。

4 結(jié) 論

本研究探討了CTWF對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其作用機(jī)制。結(jié)果表明CTWF對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響；CTWF能顯著改善D-半乳糖致衰老小鼠的空間探索能力及學(xué)習(xí)記憶能力（P＜0.05，P＜0.01）；CTWF能有效改善衰老小鼠腦組織膽堿能系統(tǒng)功能（顯著提高Ach含量，顯著降低AchE活力（P＜0.05）），顯著抑制腦組織氧化應(yīng)激水平（顯著提高SOD和GSH-Px活力，顯著降低MDA含量（P＜0.05））。以上結(jié)果可以得出結(jié)論：CTWF具有明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，其機(jī)制可能與提高腦組織膽堿能系統(tǒng)功能和減少自由基損傷有關(guān)，同時(shí)說(shuō)明昆侖雪菊可以作為一種潛在的抗衰老和益智食品，具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。