趙明明，余 強，王 輝，向全丹，聶少平，謝明勇,*

（1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學生命科學學院，江西 南昌 330047）

腸道是將機體內(nèi)部與外界環(huán)境分隔開的生物屏障，是機體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，同時也是機體最大的免疫器官[1]。腸上皮是機體最大的黏膜表面，上皮細胞減少，腸絨毛變短，導致腸道黏膜面積減少，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[2]。腸道黏膜系統(tǒng)受損導致內(nèi)部環(huán)境紊亂，不利于微生物定植，增加腸道疾病的風險。細胞因子分泌于免疫應答效應階段，介導免疫應答、炎癥反應并進行有效的調(diào)節(jié)，決定T、B細胞的分化[3]。腸道黏膜的免疫活性主要通過分泌細胞因子及其他途徑發(fā)揮體液免疫及細胞免疫的功能。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素（interlrukin，IL）-6、IL-10是幾種重要的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子，TNF-α、IFN-γ主要由參與機體細胞免疫的T細胞亞群分泌，IL-6、IL-10主要由介導機體體液免疫的T細胞亞群分泌，通過檢測不同細胞因子的分泌水平可間接衡量機體不同T細胞亞群的平衡狀態(tài)[4-5]。嚴勝澤等[6]發(fā)現(xiàn)太子參多糖能顯著提高免疫抑制小鼠小腸組織中IL-6含量。Xu Xiaofei等[7]通過建立體外模擬小腸模型，發(fā)現(xiàn)香菇多糖能顯著促進TNF-α、IFN-γ的分泌。

靈芝作為一種藥食兩用資源，在中國、韓國、日本等國家已經(jīng)有兩千多年的使用歷史[8]。黑靈芝又稱玄芝，是靈芝中的極品，長期食用可調(diào)節(jié)機體多種機能，其中多糖被證明是靈芝的主要活性成分，而靈芝多糖的免疫調(diào)節(jié)活性被認為是多種藥理學作用的基礎(chǔ)。靈芝多糖通過活化胸腺、脾臟等免疫器官改善機體免疫力；通過促進脾淋巴細胞增殖、提高自然殺傷細胞活性，發(fā)揮免疫抑制腫瘤作用；通過提高腹腔巨噬細胞中環(huán)磷腺苷濃度引起蛋白激酶活化，增加蛋白激酶C的活性；通過提高三磷酸肌醇含量促進二?；视偷暮铣?，激活巨噬細胞[9-10]，誘導NO、活性氧及細胞因子的產(chǎn)生，進而增強先天免疫和適應性免疫。本實驗室前期采集江西贛南地區(qū)人工栽培的黑靈芝，分離純化其多糖組分，證明其具有抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、心肌保護[13]、降血糖[14]等生物活性。前期研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖可有效促進環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠T、B淋巴細胞增殖，提高機體血清IL-2、TNF-α分泌水平，通過體液免疫和細胞免疫功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[15-16]。但目前黑靈芝多糖對腸道黏膜免疫的損傷修復作用還鮮有相關(guān)研究，因此本實驗以腹腔注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫抑制小鼠模型，探究黑靈芝多糖對免疫抑制小鼠腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用，為進一步研究其可能機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

48 只SPF級BALB/c雌性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，周齡6～8 周，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。實驗過程中所有動物實驗嚴格遵守南昌大學動物管理條例，倫理委員會鑒定許可。實驗墊料、飼料經(jīng)過輻照殺菌處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，符合SPF級動物使用標準。

黑靈芝多糖由食品科學與技術(shù)國家重點實驗室提取，原料采自江西贛州贛南靈芝基地，分離純化得到的黑靈芝多糖的主要單糖組分為葡萄糖、半乳糖、甘露糖及半乳糖醛酸，其物質(zhì)的量比為4.91∶1.28∶1∶0.71，平均分子質(zhì)量1 013 kDa[17]。

環(huán)磷酰胺一水合物 美國Sigma公司；鹽酸左旋咪唑 山東仁和堂藥業(yè)有限公司；小鼠IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex Taq? II （Tli RNaseH Plus） 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

自動組織脫水機、組織包埋機、生物組織攤烤片機、輪轉(zhuǎn)式切片機 金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；3K15冷凍離心機 德國Sigma公司；Primo Vert倒置顯微鏡德國Carl Zeiss公司；Varioskan Flash多功能酶標儀美國Thermo公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；V123530聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；7900 HT實時定量PCR儀 日本Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

小鼠在SPF級動物房自由飲食、飲水適應環(huán)境一周后，苦味酸標記，8 只一組，隨機分為：正常對照組、模型組、陽性對照組及黑靈芝多糖低、中、高劑量組。黑靈芝多糖劑量組及陽性對照組小鼠按1%體質(zhì)量連續(xù)3 d于上午9：30腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/（kg·d），正常對照組注射等量生理鹽水，建立免疫抑制小鼠模型，造模結(jié)束后從正常對照組及模型組各隨機選擇3 只小鼠計算脾臟指數(shù)、檢測血清中IFN-γ的含量，結(jié)果顯示模型組小鼠脾臟指數(shù)、血清中IFN-γ的含量均顯著低于正常對照組小鼠，確定模型建造成功。依據(jù)本實驗室前期黑靈芝多糖的實驗研究[15-16]，造模結(jié)束24 h后黑靈芝多糖低、中、高劑量組分別灌胃25、50、100 mg/（kg·d）的黑靈芝多糖，陽性對照組灌胃40 mg/（kg·d）的鹽酸左旋咪唑，正常對照組、模型組灌胃等體積的生理鹽水，每天上午9：30開始灌胃，連續(xù)灌胃7 d。小鼠飼喂環(huán)境：溫度（21±1）℃、相對濕度（50±10）%，12 h光照12 h黑暗交替，自由飲水、飲食，籠子、水瓶定期換洗消毒。

1.3.2 體質(zhì)量測定

小鼠造模及灌胃前半個小時每天觀察小鼠狀態(tài)、稱取并記錄體質(zhì)量變化。

1.3.3 空腸組織病理學觀察

取適量空腸組織用生理鹽水沖洗后，按照體積比1∶10在體積分數(shù)10%的中性福爾馬林溶液中充分固定，參照Chen Changying等[18]的方法，空腸組織經(jīng)脫水、包埋、切片及HE染色處理后，使用100 倍倒置光學顯微鏡選取視野范圍內(nèi)5 根最長腸絨毛拍照觀察并比較空腸黏膜形態(tài)的變化，應用圖像分析系統(tǒng)，測量空腸絨毛長度（絨毛頂部到腸腺絨毛連接處）和隱窩深度（腸腺絨毛連接處到腸腺基底），取平均值，并計算絨毛長度/隱窩深度比值（V/C值）。

1.3.4 小腸組織細胞因子含量測定

以預冷磷酸鹽緩沖液為勻漿液，取適量小腸組織，在冰浴條件下制成10%組織勻漿液，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，收集并分裝小腸組織上清液，于－80 ℃保存?zhèn)溆?。分別按照IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ ELISA試劑盒操作說明，檢測相應細胞因子的含量。

1.3.5 小腸組織RT-qPCR分析

表1 RT-qPCR引物序列Table1 Primer sequences used for RT-qPCR

取適量小腸組織樣品，參照Trizol提取法的詳細說明提取總RNA并定量，瓊脂糖凝膠電泳對總RNA質(zhì)量進行檢測后，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR）擴增，擴增程序為：95 ℃預變性1 min 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共40 次循環(huán)，引物序列見表1。同時檢測SYBR Green Ⅱ和校正染料ROX Reference Dye的熒光信號。

以β-actin為內(nèi)參基因，使用2－△△Ct計算T-bet和GATA-3 mRNA的相對表達水平，△△Ct按下式計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量的變化

表2 小鼠體質(zhì)量變化Table2 Change in body mass g

實驗期間，腹腔注射環(huán)磷酰胺后小鼠食欲下降，毛色暗淡且伴有脫毛現(xiàn)象，精神不佳，糞便干澀，說明免疫抑制模型建造成功。體質(zhì)量變化如表2所示，腹腔注射環(huán)磷酰胺第2天開始，所有免疫抑制組小鼠體質(zhì)量急劇下降。末次腹腔注射環(huán)磷酰胺24 h后（第4天），相比正常對照組，各組免疫抑制小鼠體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05）；相比腹腔注射第1天，各組免疫抑制小鼠末次腹腔注射環(huán)磷酰胺24 h后，體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05）。第5天開始，各組小鼠體質(zhì)量基本停止下降，相比模型組，灌胃黑靈芝多糖劑量組及陽性對照組小鼠體質(zhì)量回升速度較快。

2.2 免疫抑制小鼠空腸組織病理學觀察

圖1 小鼠空腸組織切片病理學觀察（×100）Fig.1 Pathological observation of jejunal tissue sections from mice （× 100）

絨毛長度、隱窩深度及絨毛長度/隱窩深度（V/C值）是反映小腸消化吸收功能和機體健康狀況的重要指標[19]。倒置顯微鏡下觀察并比較空腸組織黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，相比正常對照組（圖1A），模型組（圖1B）腸絨毛較短且伴有腫脹現(xiàn)象，隱窩變淺。相比模型組（圖1B），黑靈芝多糖劑量組小鼠（圖1C、D、E）絨毛較為細長，腫脹現(xiàn)象得以改善。

圖2 小鼠空腸絨毛長度、隱窩深度（A）和V/C值（B）Fig.2 Villus length, crypt depth （A） and V/C value （B） in the jejunum of mice

對各組小鼠空腸組織黏膜形態(tài)進行統(tǒng)計學分析，如圖2A所示，相比模型組，黑靈芝多糖劑量組與陽性對照組絨毛長度均有顯著性增加（P＜0.05），隱窩深度有上升趨勢，除黑靈芝多糖高劑量組有顯著性增加外（P＜0.05），其余各組與對照組均無顯著性差異。如圖2B所示，相比模型組，黑靈芝多糖中、高劑量組小鼠V/C值顯著性增加（P＜0.05），低劑量組V/C值無顯著性增加，V/C值呈劑量依賴性增加。

2.3 黑靈芝多糖對免疫抑制小鼠細胞因子水平的影響

表3 各組小鼠小腸細胞因子質(zhì)量濃度Table3 Levels of small intestinal cytokines in mice

由表3可知，與正常對照組相比，模型組小腸組織IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ分泌水平都顯著降低（P＜0.05）。相比模型組，黑靈芝多糖低、中、高劑量組IL-10和IFN-γ質(zhì)量濃度均顯著增加（P＜0.05）；黑靈芝多糖中、高劑量組的IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度相比模型組顯著增加（P＜0.05），但低劑量組并無顯著性差異。

2.4 小腸中T-bet和GATA-3 mRNA的表達水平

圖3 小腸T-bet和GATA-3的mRNA相對表達水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of T-bet and GATA-3 in small intestine of mice

T-bet、GATA-3是不同T細胞亞群細胞核內(nèi)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。如圖3所示，相比模型組，灌胃黑靈芝多糖劑量組T-bet和GATA-3基因的相對表達水平均顯著增加（P＜0.05），GATA-3基因的相對表達呈劑量依賴性增加。相對模型組，灌胃不同劑量的黑靈芝多糖T-bet/GATA-3比值均有所提高，且低、高劑量組呈顯著性增加（P＜0.05）。

3 討 論

環(huán)磷酰胺屬化療類抗腫瘤藥物，目前作為免疫毒理學中常用的陽性藥物，其介導的細胞毒作用會損傷DNA，對機體具有免疫抑制效果[20-21]。正常小鼠過量攝入環(huán)磷酰胺導致免疫抑制，表現(xiàn)為體質(zhì)量下降，精神萎靡，食欲下降[22]。本實驗結(jié)果顯示，相比模型組，灌胃黑靈芝多糖后各劑量組小鼠體質(zhì)量回升顯著，表明黑靈芝多糖對免疫抑制小鼠體質(zhì)量下降有改善作用。

腸道作為機體最大的免疫器官，小腸是機體消化吸收的最大場所，絨毛是小腸的特有結(jié)構(gòu)，良好的黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)能夠保障營養(yǎng)物質(zhì)的充分消化吸收[23]。腸絨毛上的杯狀細胞分泌的黏蛋白構(gòu)成防止微生物入侵的第一道防線，腸上皮細胞不斷從隱窩深處分化，向絨毛頂部遷徙，彌補正常的細胞凋亡，具有吸收功能，在介導腸道微生物和免疫平衡中具有重要作用[2,24]。石玉祥等[25]通過連續(xù)7 d給小鼠灌胃枸杞多糖發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可有效改善小腸黏膜屏障，促進屏障結(jié)構(gòu)趨于完整。陳凌鋒等[26]研究發(fā)現(xiàn)太子參莖葉多糖能夠增加斷奶仔豬腸絨毛長度，維持腸道微生態(tài)平衡。小腸絨毛腫脹、變短，不利于機體的消化吸收功能，本實驗結(jié)果表明，黑靈芝多糖能在一定程度上增長環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的腸絨毛長度，提高V/C值，改善腸道絨毛形態(tài)，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

黏膜免疫系統(tǒng)是機體免疫的重要組成部分，細胞因子廣泛存在腸道黏膜中，參與機體的免疫調(diào)節(jié)作用，細胞因子的質(zhì)量濃度與腸黏膜的免疫狀態(tài)息息相關(guān)。IL-6是重要的促炎因子，分泌途徑多樣，T淋巴細胞和單核巨噬細胞的活化，促進IL-6的分泌，進而反饋調(diào)節(jié)活化的T細胞增殖[27]。IL-10是重要的抗炎因子，通過抑制抗原提呈細胞降低免疫應答，防止機體過度免疫[28]。TNF-α屬重要的促炎因子，是TNF超家族成員，來源單核細胞、巨噬細胞及T淋巴細胞，調(diào)節(jié)自身免疫[29-30]。IFN-γ由活化的T淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生，是巨噬細胞的激活劑，在適應性細胞介導的免疫應答中起重要作用[31]。王君巧等[16]的研究表明，黑靈芝多糖能有效提高免疫抑制小鼠脾細胞TNF-α質(zhì)量濃度。孫曉雨等[32]的研究也表明枸杞多糖和茯苓多糖對提高免疫抑制小鼠小腸及血清中IFN-γ的質(zhì)量濃度有明顯促進作用。本實驗結(jié)果顯示，相比模型組，灌胃黑靈芝多糖小鼠的IL-10和IFN-γ質(zhì)量濃度均顯著升高，且呈劑量依賴性；黑靈芝多糖高、中劑量組IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度顯著增加，低劑量組質(zhì)量濃度有上升趨勢，表明黑靈芝多糖能通過增加IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ等細胞因子的分泌正向調(diào)節(jié)機體的免疫活性，對維持腸道黏膜免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)有促進作用。

T細胞參與機體適應性免疫應答，是淋巴細胞中具有復雜功能的一類細胞，根據(jù)功能的不同分為眾多亞群，Th1、Th2是免疫功能下T淋巴細胞分化的兩個重要亞群。Th1細胞主要介導細胞免疫，分泌TNF-α和IFN-γ等細胞因子；Th2細胞刺激B細胞增殖，主要介導體液免疫，分泌IL-6和IL-10等細胞因子[33]。機體在正常情況下Th1/Th2細胞維持動態(tài)平衡狀態(tài)，T-bet和GATA-3分別為Th1型細胞和Th2型細胞核內(nèi)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，T-bet/GATA-3的比值可用來衡量機體Th1/Th2細胞的平衡狀態(tài)[34]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖能顯著提高T-bet和GATA-3相對表達水平，且低、中、高劑量組T-bet/GATA-3的比率均高于模型組，提示黑靈芝多糖可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞的平衡來調(diào)控機體免疫應答。

綜上所述，黑靈芝多糖有利于環(huán)磷酰胺誘導的免疫低下小鼠體質(zhì)量的恢復，改善腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進腸道組織中重要細胞因子分泌，提高Th1和Th2細胞核轉(zhuǎn)錄因子基因相對表達水平，表明黑靈芝多糖能夠調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺導致的小鼠腸道黏膜免疫。本實驗結(jié)果可為進一步研究黑靈芝多糖對腸道黏膜免疫的機制提供理論依據(jù)。