吳曉娟，吳 偉*

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

中國(guó)是世界上最大的水稻生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，全國(guó)65%以上的人口以大米為主食[1]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)大米的品質(zhì)尤其是食味品質(zhì)提出了更高的要求[2]。但大米在儲(chǔ)藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、化學(xué)成分改變、營(yíng)養(yǎng)組分流失等一系列變化，導(dǎo)致加工特性和食味品質(zhì)的下降。長(zhǎng)期以來(lái)，淀粉的組成和結(jié)構(gòu)變化被認(rèn)為是影響大米及其制品糊化特性和食味品質(zhì)的主要因素[3-4]。但越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，大米中蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)在儲(chǔ)藏過(guò)程中也會(huì)發(fā)生顯著變化，如清蛋白和球蛋白含量顯著下降，米谷蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，蛋白質(zhì)平均分子質(zhì)量顯著增加等[5-8]。這可能是由于大米中脂肪氧合酶產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基和部分揮發(fā)性羰基化合物具有高度的氧化活性，使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化聚集和結(jié)構(gòu)變化[9]。大米胚乳中淀粉顆粒由支鏈淀粉分子以疏密相間結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形非結(jié)晶區(qū)組成，中間摻雜螺旋結(jié)構(gòu)直鏈淀粉分子，蛋白質(zhì)則分布在淀粉顆粒的外周，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的共價(jià)交聯(lián)必定會(huì)影響大米淀粉糊化特性和米飯的食味品質(zhì)[10]?！饍?yōu)207’是中國(guó)長(zhǎng)江中下游稻區(qū)的主栽優(yōu)質(zhì)晚秈稻品種[11]，‘吉粳88’是中國(guó)東北稻區(qū)的主栽優(yōu)質(zhì)粳稻品種[12]，都具有較好的食味品質(zhì)。本研究以新收獲大米‘金優(yōu)207’和‘吉粳88’為原料，采用溫度37 ℃、相對(duì)濕度85%的條件進(jìn)行加速陳化儲(chǔ)藏，測(cè)定儲(chǔ)藏過(guò)程中大米蛋白羰基、巰基和二硫鍵含量等氧化特征指標(biāo)的變化，并將這些氧化特征指標(biāo)與米粉糊化特性、米飯質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，研究蛋白質(zhì)氧化對(duì)大米蒸煮食用品質(zhì)的影響，以期為大米及其制品的保鮮儲(chǔ)藏提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新收獲大米（‘金優(yōu)207’、‘吉粳88’） 湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白 上海源葉生物科技有限公司；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽（5,5’-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RXZ-128A型人工氣候箱 寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；FA25型高速分散均質(zhì)機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；Sorvall LYNX6000型高速落地冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；LGJ-18型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)有限公司；722s型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RVA-Super4型快速粘度分析儀 瑞典波通儀器公司；TA.XT Express質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 大米加速陳化儲(chǔ)藏

參考張珅鋮等[13]的方法，取適量‘金優(yōu)207’和‘吉粳88’大米分別置于直徑200 mm的無(wú)蓋玻璃培養(yǎng)皿中，米粒厚度為10 mm，放入人工氣候箱中加速陳化儲(chǔ)藏，儲(chǔ)藏條件為溫度37 ℃、相對(duì)濕度85%，每周取樣。

1.3.2 大米蛋白制備

將儲(chǔ)藏不同時(shí)間的大米磨粉過(guò)80 目篩，按料液比1∶7（m/V）加入去離子水中，再用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下攪拌反應(yīng)4 h，然后將懸浮液4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，靜置20 min，在4 ℃、8 000 r/min下離心15 min得到蛋白沉淀，用去離子水洗滌3 次后，再將蛋白沉淀分散于4 倍體積的去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后冷凍干燥得到大米蛋白。

1.3.3 大米蛋白羰基含量的測(cè)定

參考Huang Youru等[14]的方法，采用2,4-二硝基苯肼比色法在367 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以22 000 L/（mol·cm）摩爾消光系數(shù)計(jì)算每毫克大米蛋白中羰基物質(zhì)的量。

1.3.4 大米蛋白總巰基、游離巰基及二硫鍵含量測(cè)定

參考Beveridge等[15]的方法，采用Ellman’s試劑比色法在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以13 600 L/（mol·cm）摩爾消光系數(shù)計(jì)算每毫克大米蛋白中總巰基和游離巰基物質(zhì)的量，總巰基與游離巰基含量差值的1/2即為二硫鍵含量。

1.3.5 米粉糊化特性的測(cè)定

將儲(chǔ)藏不同時(shí)間的大米磨粉過(guò)80 目篩，再依據(jù)GB/T 24852—2010《大米及米粉糊化特性測(cè)定 快速粘度儀法》[16]測(cè)定米粉糊化特性。

1.3.6 米飯質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g大米，洗凈后置于直徑70 mm、高38 mm的加蓋鋁盒中，加入相當(dāng)于米粒質(zhì)量2倍的蒸餾水，浸泡20 min后瀝干，然后加入相當(dāng)于米粒質(zhì)量1.4 倍的蒸餾水，蓋上鋁盒蓋后蒸汽蒸煮20 min，再靜置保溫10 min，得到米飯。采用質(zhì)構(gòu)儀在TPA模式下測(cè)定米飯的硬度、黏著性、彈性、咀嚼性、黏聚性和回復(fù)性。測(cè)定模式：選用P/0.5圓柱塑料探頭，測(cè)前速率1 mm/s，測(cè)試速率1 mm/s，測(cè)后速率10 mm/s；壓縮程度10 mm；保持時(shí)間5 s；觸發(fā)力5 g。

1.3.7 大米蒸煮食用品質(zhì)感官評(píng)價(jià)

依據(jù)GB/T 15682—2008《糧油檢驗(yàn) 稻谷、大米蒸煮食用品質(zhì)感官評(píng)價(jià)方法》[17]進(jìn)行大米蒸煮食用感官評(píng)價(jià)。首先參照附錄A的“評(píng)價(jià)員挑選辦法”，通過(guò)培訓(xùn)和鑒別實(shí)驗(yàn)挑選了10 名感官靈敏度高的人員作為評(píng)價(jià)員；然后，10 名評(píng)價(jià)員參照附錄B的“米飯感官評(píng)價(jià)規(guī)則和記錄表（評(píng)分方法一）”分別對(duì)不同儲(chǔ)藏時(shí)間的2 個(gè)品種米飯的氣味、外觀結(jié)構(gòu)、適口性、滋味和冷飯質(zhì)地5 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，再根據(jù)每個(gè)評(píng)價(jià)員的綜合評(píng)分結(jié)果計(jì)算平均值，計(jì)算結(jié)果取整數(shù)。每次品評(píng)，都會(huì)由10 名評(píng)價(jià)員共同選取1 份標(biāo)準(zhǔn)三等精度，綜合評(píng)分75 分左右的新鮮大米作為參照樣品。米飯感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 米飯感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table1 Criteria for sensory evaluation of cooked rice

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003、SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，除感官評(píng)分，其余結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Origin 7.5軟件作圖，采用Pearson雙變量進(jìn)行數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析，采用方差分析法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米在儲(chǔ)藏過(guò)程中蛋白氧化程度的變化

大米蛋白氨基酸分子中自由氨基和亞氨基極易受到活性氧攻擊，經(jīng)反應(yīng)最終生成氨氣和相應(yīng)的羰基衍生物[18]。同時(shí)，L-半胱氨酸（L-cysteine，Cys）巰基是最容易被自由基攻擊的氨基酸殘基，巰基轉(zhuǎn)變成二硫鍵或者其他物質(zhì)是自由基引發(fā)的蛋白氧化過(guò)程中最早發(fā)現(xiàn)的變化之一[19-20]。因此羰基、總巰基、游離巰基和二硫鍵含量是目前最常用的衡量蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)。如表2所示，加速陳化過(guò)程中，‘金優(yōu)207’和‘吉粳88’大米蛋白的羰基含量在1～4 周增加比較緩慢，4～12 周則顯著增加，12 周以后增加幅度又趨于平緩。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，‘吉粳88’大米產(chǎn)生的羰基含量逐漸高于‘金優(yōu)207’，表明這兩種大米的蛋白氧化程度不斷增加，且‘吉粳88’大米蛋白比‘金優(yōu)207’更容易被氧化。兩種大米蛋白的總巰基和游離巰基含量均呈下降趨勢(shì)，且‘吉粳88’的下降趨勢(shì)更為明顯，也表明‘吉粳88’大米蛋白比‘金優(yōu)207’更容易被氧化?！饍?yōu)207’大米蛋白二硫鍵含量無(wú)顯著變化（P＞0.05），‘吉粳88’二硫鍵含量增加較明顯，依據(jù)氧化環(huán)境和氧化強(qiáng)度的改變，蛋白質(zhì)巰基的氧化可分為可逆氧化和不可逆氧化，可逆氧化主要是形成二硫鍵和次磺酸，不可逆氧化主要是形成亞磺酸和磺酸[21-22]；表明‘金優(yōu)207’大米蛋白的游離巰基主要發(fā)生的是不可逆氧化反應(yīng)，而‘吉粳88’既發(fā)生了可逆氧化也發(fā)生了不可逆氧化反應(yīng)。

表2 儲(chǔ)藏過(guò)程中大米蛋白羰基、總巰基、游離巰基和二硫鍵含量Table2 Protein carbonyl, total sulphydryl, free sulphydryl and disulf i de contents of rice protein during storage nmol/mg

2.2 蛋白質(zhì)氧化程度對(duì)米粉糊化特性的影響

大米及其制品的糊化特性一直是反映其食用品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。兩種米粉的糊化特性參數(shù)如表3所示，儲(chǔ)藏過(guò)程中兩種米粉的峰值黏度均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，‘金優(yōu)207’的峰值黏度在第5周時(shí)達(dá)到最大值（3 610 cP），‘吉粳88’的峰值黏度在第10周時(shí)達(dá)到最大值（4 210 cP）。Indudhara Swamy等[23]在研究糙米和精米儲(chǔ)藏時(shí)也發(fā)現(xiàn)淀粉峰值黏度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這兩種米粉的最低黏度和衰減值隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)沒(méi)有統(tǒng)一的變化趨勢(shì)，但最終黏度、回生值和糊化溫度隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈逐漸上升趨勢(shì)。雷玲等[24]研究?jī)?chǔ)藏過(guò)程中不同品種稻谷的品質(zhì)變化時(shí)也發(fā)現(xiàn)最終黏度和回生值都增大。回生值是最終黏度與最低黏度的差值，可以反映米糊在冷卻過(guò)程中的老化程度，回生值越大，表示米粉老化程度越大[25]。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，‘吉粳88’的回生值增加程度要高于‘金優(yōu)207’，這表明‘吉粳88’容易老化，不適于長(zhǎng)期儲(chǔ)藏。

表3 儲(chǔ)藏過(guò)程中米粉的糊化特性Table3 Pasting properties of rice fl our during storage

Shibuya等[26]研究發(fā)現(xiàn)新鮮米粉和陳米粉的糊化特性有差別，但去除蛋白后的新鮮米淀粉和陳米淀粉卻沒(méi)有差異。Tan Yifang[27]、Zhu Lijia[28]等的研究也發(fā)現(xiàn)大米蛋白質(zhì)含量不同是導(dǎo)致米粉與其對(duì)應(yīng)的淀粉糊化特性差異的主要原因之一。Zhou Zhongkai等[29]研究發(fā)現(xiàn)高溫（37 ℃）儲(chǔ)藏的米粉經(jīng)蛋白酶處理后，其峰值黏度和最終黏度發(fā)生了顯著變化。這些研究從側(cè)面反映了米粉糊化特性的變化主要是由大米的第二大組分蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)變化引起的。米粉糊化特征值與反映大米蛋白氧化程度指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)如表4所示，峰值黏度、最終黏度和回生值與大米蛋白羰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總巰基和游離巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。最低黏度與羰基、二硫鍵含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與游離巰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；這表明，米粉糊化特性與大米蛋白氧化程度密切相關(guān)，且隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加，米粉老化回生程度增加。

表1 米粉糊化特性與蛋白質(zhì)氧化程度的相關(guān)系數(shù)Table1 Correlation coeff i cients between pasting properties and protein oxidation degree of rice fl our

2.3 蛋白質(zhì)氧化程度對(duì)米飯質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表5所示，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種米飯的硬度均呈逐漸上升趨勢(shì)，而咀嚼性、黏聚性、回復(fù)性、黏著性和彈性均呈下降趨勢(shì)?！饍?yōu)207’的硬度、黏聚性和回復(fù)性大于‘吉粳88’，而黏著性小于‘吉粳88’，兩者在咀嚼性和彈性方面差異不大。戰(zhàn)旭梅[30]對(duì)‘汕優(yōu)63’、‘武粳14’、‘揚(yáng)8’等的加速陳化儲(chǔ)藏研究中也發(fā)現(xiàn)質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生了類(lèi)似的變化趨勢(shì)。

米飯質(zhì)構(gòu)特征值與大米蛋白氧化程度的相關(guān)系數(shù)如表6所示。米飯硬度與大米蛋白羰基含量和二硫鍵含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總巰基、游離巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。咀嚼性和彈性與大米蛋白羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與總巰基含量和游離巰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；黏聚性、回復(fù)性與大米蛋白羰基含量和二硫鍵含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.0 1），與總巰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；黏著性與大米蛋白羰基、二硫鍵含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與游離巰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。這表明大米蛋白中氨基和亞氨基的氧化，即羰基含量的增加，對(duì)米飯的硬度、咀嚼性、黏聚性、回復(fù)性、黏著性和彈性等質(zhì)構(gòu)特性均有負(fù)面影響，使米飯食味品質(zhì)逐漸下降；Cys巰基的氧化，即游離巰基含量的下降，主要對(duì)硬度、咀嚼性、黏著性和彈性有極顯著的影響；二硫鍵的形成主要對(duì)米飯的硬度、黏聚性、回復(fù)性和黏著性有影響。儲(chǔ)藏過(guò)程中米飯質(zhì)構(gòu)特性變差的原因可能是，蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致位于淀粉顆粒外周的大米蛋白交聯(lián)度增加，抑制淀粉顆粒吸水膨潤(rùn)，致使淀粉不能充分糊化，此外加熱時(shí)二硫鍵增多，蛋白質(zhì)分子聚合為大分子，導(dǎo)致熟化食品質(zhì)地變硬，咀嚼性、回復(fù)性、彈性等下降[31]。

表5 儲(chǔ)藏過(guò)程中米飯的質(zhì)構(gòu)特性Table5 Texture properties of cooked rice during storage

表6 米飯質(zhì)構(gòu)特征值與蛋白質(zhì)氧化程度的相關(guān)系數(shù)Table6 Correlation coeff i cients between texture properties and protein oxidation degree of cooked rice

2.4 蛋白質(zhì)氧化程度對(duì)大米蒸煮食用品質(zhì)感官評(píng)價(jià)的影響

表7 儲(chǔ)藏過(guò)程中大米蒸煮食用品質(zhì)感官評(píng)價(jià)得分Table7 Sensory evaluation of rice cooking and eating quality during storage

感官評(píng)價(jià)最能夠直接反映人們對(duì)米飯蒸煮品質(zhì)的優(yōu)劣判斷，兩種米飯的感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表7所示，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種米飯的外觀、氣味、適口性、滋味和冷飯質(zhì)地和綜合評(píng)分均降低。儲(chǔ)藏1～12周，‘吉粳88’的外觀、適口性、滋味以及綜合評(píng)分整體上高于‘金優(yōu)207’，但儲(chǔ)藏后期‘金優(yōu)207’的各項(xiàng)指標(biāo)則逐漸優(yōu)于‘吉粳88’；這表明相比于‘金優(yōu)207’，‘吉粳88’在儲(chǔ)藏過(guò)程中感官品質(zhì)劣變程度更大。

表8 大米蒸煮食用品質(zhì)感官評(píng)價(jià)與蛋白質(zhì)氧化程度的相關(guān)系數(shù)Table8 Correlation coeff i cients between sensory evaluation of cooking and eating quality and protein oxidation degree of rice

米飯感官評(píng)分與大米蛋白氧化程度的相關(guān)系數(shù)如表8所示。米飯的外觀、氣味、適口性、滋味、冷飯質(zhì)地和綜合評(píng)分均與大米蛋白羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與總巰基含量和游離巰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；適口性和滋味與大米蛋白二硫鍵含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。已有研究表明，米飯的感官品質(zhì)和質(zhì)構(gòu)特性密切相關(guān)，如：米飯的硬度與感官評(píng)價(jià)指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)，彈性與米飯的口感、形態(tài)和色澤呈正相關(guān)[32]，因而造成米飯質(zhì)構(gòu)特性下降的原因也可能是感官品質(zhì)劣變的關(guān)鍵因素。稻谷儲(chǔ)藏過(guò)程中，大米蛋白發(fā)生最為顯著的氧化修飾是游離巰基轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I，一方面使大米蛋白交聯(lián)度和聚集程度增加，影響淀粉膨潤(rùn)度和米飯質(zhì)地；另一方面導(dǎo)致蒸煮米飯風(fēng)味物中硫化物含量下降，影響米飯?zhí)赜酗L(fēng)味[33]。

3 結(jié) 論

‘金優(yōu)207’和‘吉粳88’在加速陳化儲(chǔ)藏過(guò)程中，大米蛋白羰基含量持續(xù)增加，總巰基和游離巰基含量逐漸下降，表明兩種大米的蛋白氧化程度不斷增加，且‘吉粳88’大米蛋白比‘金優(yōu)207’更容易氧化。米粉糊化特性、米飯質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)均與大米蛋白氧化程度密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在：米粉峰值黏度、最終黏度、回生值和米飯硬度與大米蛋白羰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總巰基和游離巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；米飯的咀嚼性、彈性、外觀、氣味、適口性、滋味、冷飯質(zhì)地均與大米蛋白羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與總巰基含量和游離巰基含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；米粉最低黏度、米飯硬度與大米蛋白二硫鍵含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而米飯黏聚性、回復(fù)性和黏著性等則與大米蛋白二硫鍵含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。這表明大米加速陳化儲(chǔ)藏過(guò)程中，隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加，大米老化回生程度增加，米飯質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)明顯下降。此外，通過(guò)對(duì)兩種大米的蒸煮食用品質(zhì)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)分析還可以看出，新收獲的粳稻品種‘吉粳88’大米的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于秈稻品種‘金優(yōu)207’，但儲(chǔ)藏后期，‘金優(yōu)207’的各項(xiàng)指標(biāo)則逐漸優(yōu)于‘吉粳88’，這表明相比于‘金優(yōu)207’，‘吉粳88’在儲(chǔ)藏過(guò)程中感官品質(zhì)劣變程度更大。