◎ 王乃馨，商學(xué)兵，李 超，李 勇，宋 慧，王 陶，李 文

（徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)試驗(yàn)室，江蘇 徐州 221018）

醬油是我國傳統(tǒng)調(diào)味品，生產(chǎn)方法較多，其中高鹽稀態(tài)法發(fā)酵獲得的產(chǎn)品品質(zhì)較優(yōu)[1]。影響高鹽稀態(tài)醬油風(fēng)味形成的因素諸多，如菌種、原料、大曲質(zhì)量、醬醪發(fā)酵以及巴氏殺菌等，大曲質(zhì)量、醬醪發(fā)酵和巴氏殺菌是影響高鹽稀態(tài)醬油最終風(fēng)味的關(guān)鍵因素[2-4]。目前，評(píng)價(jià)大曲質(zhì)量的主要指標(biāo)為大曲中中性和酸性蛋白酶酶活的高低，這兩種酶的活力越高，對(duì)提高醬油中氨基酸態(tài)氮、總氮含量和醬油風(fēng)味越有利[5-6]。國內(nèi)高鹽稀態(tài)醬油大曲的制備多以米曲霉（Aspergillus oryzae3.042）為發(fā)酵菌種，該菌種產(chǎn)中性蛋白酶能力較強(qiáng)，產(chǎn)酸性蛋白酶能力較弱；酸性蛋白酶屬端肽酶，能夠在酸性環(huán)境中將中性蛋白酶的初步降解產(chǎn)物胨、肽等進(jìn)一步降解成醬油中的主要呈味物質(zhì)－氨基酸[7]。因此，提高大曲中酸性蛋白酶活力對(duì)改善高鹽稀態(tài)醬油的風(fēng)味具有重要意義。黑曲霉（Aspergillus. niger3.350）能夠產(chǎn)生大量酸性蛋白酶、淀粉酶等。以米曲霉和黑曲霉混合制曲是提高大曲酸性蛋白酶，繼而提高醬油風(fēng)味的有效手段。但米曲霉和黑曲霉混合制曲存在生長競(jìng)爭(zhēng)抑制作用；黑曲霉生長占優(yōu)勢(shì)時(shí)，容易使大曲有一種特殊風(fēng)味，會(huì)掩蓋高鹽稀態(tài)醬油的典型風(fēng)味。因此，米曲霉和黑曲霉分別制曲，在后續(xù)發(fā)酵過程中按比例混合發(fā)酵，是保證大曲質(zhì)量和改善高鹽稀態(tài)醬油風(fēng)味的有效方法[8]。本課題通過雙菌發(fā)酵和添加香菇柄粉，期望增加單位體積產(chǎn)品氨基酸含量，且具有香菇特殊風(fēng)味與營養(yǎng)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，優(yōu)化米曲霉和黑曲霉雙菌發(fā)酵高鹽稀態(tài)醬油的條件參數(shù)。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

香菇梗購自湖北襄陽南漳土特產(chǎn)商店；東北大豆、面粉和食鹽分別購買于本地超市；米曲霉和黑曲霉購買于廣東省微生物菌種保藏中心；福林酚試劑購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；硼酸，三氯乙酸，氫氧化鈉，鹽酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，甲醛和碳酸鈉皆為分析純，購買自國藥集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

SHA-C水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市恒農(nóng)儀器廠；101A-2型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠；Sartorius BP211D分析天平，中科院廣州化學(xué)研究所；KND-2C型定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；UV-2100分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；ZJP-A1430培養(yǎng)箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；PHS-3E pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZX-30KBS滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 工藝流程

工藝流程如圖1。

圖1 工藝流程圖

2.2 操作要點(diǎn)

參照SB/T 10312-1999《高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油釀造工藝規(guī)范》，大豆用自來水沖洗3次，浸泡到充分膨脹、無褶皺；浸泡好的大豆放入高壓滅菌鍋中蒸煮，排氣3 min，待溫度上升到120 ℃時(shí)開始計(jì)時(shí)，蒸煮12 min后立刻放蒸汽降壓，取出大豆；降溫至50 ℃。面粉與菇柄粉按9∶1混合，然后種曲與5倍左右的粉混合，再與降溫后的大豆混合，在拌粉的過程中盡量防止大豆破損；制備種曲（指米曲霉或黑曲霉）時(shí)，接種量為干粉與大豆質(zhì)量的0.3%；前期濕度95%，出曲前4 h濕度降至70%；培養(yǎng)至16 h和24 h時(shí)翻曲；大曲盛放在直徑為20 cm的通風(fēng)圓形塑料筐中，以滅菌后的濕紗布（經(jīng)121 ℃、20 min滅菌）覆蓋表面；最后放入恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本試驗(yàn)在5 L中試發(fā)酵罐（不銹鋼）中進(jìn)行，根據(jù)試驗(yàn)需要，在達(dá)到計(jì)劃時(shí)間后，取發(fā)酵液過濾除渣，測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量。

2.3 單因素試驗(yàn)

以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，分別考察米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比（2、3、4、5和6）、鹽水濃度（14%、16%、18%、20%以及22%）、鹽水與大曲的質(zhì)量比（2.0、2.1、2.2、2.3和2.4）以及發(fā)酵時(shí)間（6、8、10、12 d以及14 d）。

2.4 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)以米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比、鹽水濃度、鹽水與大曲的質(zhì)量比以及、發(fā)酵時(shí)間為四個(gè)考察因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以產(chǎn)生的氨基酸態(tài)量為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。正交因素水平表見表1。

表1 醬油發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.5 檢測(cè)方法

依據(jù)國標(biāo)GB/T 5009.39-2003要求，測(cè)定醬油中的氨基酸態(tài)氮含量。采用甲醛滴定法，利用所消耗NaOH溶液的體積來計(jì)算醬油發(fā)酵液中基酸態(tài)氮量。產(chǎn)氨基酸態(tài)氮量的計(jì)算見公式（1）。

式（1）中X—樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，10-2g·mL-1；V1—測(cè)定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V2—試劑空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V3—樣品稀釋液取用量，mL；C—NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；0.014表示與1.00 mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)氮的影響

菌種是影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一，菌種的好壞直接影響氨基酸態(tài)氮的含量。試驗(yàn)結(jié)果以氨基酸態(tài)氮的含量來確定兩種曲霉的最適接種比。根據(jù)圖2，產(chǎn)氨基酸態(tài)氮的量隨著米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比的增加，呈先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)米曲霉和黑曲霉的質(zhì)量比為4∶1時(shí)，產(chǎn)量最高，為3.36 g·L-1。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是米曲霉和黑曲霉之間存在抑制作用，當(dāng)質(zhì)量比大于4時(shí)，發(fā)酵液中用于曲霉生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)減少而使發(fā)酵減緩，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮的含量下降。

圖2 米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)氮的影響圖

3.1.2 鹽水濃度對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)氮量的影響

鹽水濃度對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)氮量的影響如圖3。

根據(jù)圖3，曲霉產(chǎn)氨基酸態(tài)氮量隨著鹽水濃度增加呈先增后降的趨勢(shì)，鹽水濃度為20%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大值，為2.73 g·L-1。產(chǎn)生這一趨勢(shì)的原因是鹽水濃度不斷增加，發(fā)酵液的滲透壓增大，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)很難進(jìn)入曲霉細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而降低了氨基酸態(tài)氮的量。

3.1.3 鹽水和大曲的質(zhì)量比對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)氮含量的影響鹽水和大曲的質(zhì)量比對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)氮含量的影響如圖4。

圖4 鹽水與大曲的質(zhì)量比對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)氮的影響圖

根據(jù)圖4，氨基酸態(tài)氮的含量呈先緩慢上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)鹽水與大曲的質(zhì)量比達(dá)到2.2時(shí)，氨基酸態(tài)氮的含量達(dá)到最大值，為8.54 g·L-1。鹽水與大曲質(zhì)量比不斷增加，使氨基酸態(tài)氮酶活力和曲酶的蛋白酶活力下降，從而影響氨基酸態(tài)氮產(chǎn)量。

3.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)量的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)量的影響如圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)氨基酸態(tài)量的影響

根據(jù)圖5，氨基酸態(tài)氮隨時(shí)間的延長呈緩慢增加的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為14 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮的產(chǎn)量達(dá)到最大值13.09 g·L-1。在第12 d以后氨基酸態(tài)氮的含量趨向平穩(wěn)。隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷增加，營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，曲霉的生長狀況基本穩(wěn)定，最終使氨基酸態(tài)氮的產(chǎn)量在發(fā)酵后期平穩(wěn)。進(jìn)一步發(fā)酵并不能顯著增加目標(biāo)物含量，還有可能因微生物消耗導(dǎo)致降低。

3.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)以米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比、鹽水濃度、鹽水與大曲的質(zhì)量比、發(fā)酵時(shí)間為4個(gè)考察因素，各取最佳3個(gè)水平。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

據(jù)表2可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮的產(chǎn)量影響最大，為最重要的因素，其次是鹽水與大曲的質(zhì)量比和米曲霉與黑曲霉的質(zhì)量比，鹽水濃度為對(duì)氨基酸態(tài)氮的形成影響最小。最佳組合為A2B2C2D3，即米曲霉和黑曲霉的質(zhì)量比為4，鹽水濃度為20%，鹽水與大曲質(zhì)量比為2.2，發(fā)酵時(shí)間為12 d時(shí)發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮的含量最高，為最佳的工藝配方。在此工藝條件下，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，氨基酸態(tài)氮最高可達(dá)13.53 g·L-1。理論分析與試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)高鹽稀態(tài)香菇梗醬油生產(chǎn)工藝的研究，改進(jìn)了工藝流程，解決醬油生產(chǎn)中存在的發(fā)酵周期長、成本高等問題。提高生產(chǎn)效率，為提升傳統(tǒng)調(diào)味品的感官和種類奠定理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)米曲霉和黑曲霉的質(zhì)量比為4，鹽水濃度為20%，鹽水與大曲的質(zhì)量比為2.2，發(fā)酵時(shí)間為12 d時(shí)，醬油產(chǎn)品中氨基酸態(tài)氮的含量最高。