◎ 邢新鋒，葉 強(qiáng)

（浙江天草生物科技股份有限公司，浙江 湖州 313300）

蘋果提取物是以蘋果汁經(jīng)水或一定比例的乙醇水溶液提取分離制成的植物提取物，有效成分主要為原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素和根皮苷等，具有排除鹽分、降低血壓、去膽固醇、刺激腸蠕動、利尿通便等作用，也可用作保健食品中，使保健食品香甜可口味道好。目前，天然植物成分提取行業(yè)中已了解的蘋果提取物有效成分有原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、根皮苷等。雖已有不少關(guān)于蘋果提取物成分的研究，但對原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、根皮苷等含量的測定卻未見文獻(xiàn)報道。本文建立了HPLC法測定蘋果提取物中原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、根皮苷的含量的方法，為蘋果提取物的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-15C高效液相色譜儀、DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、PHS-3C型精密pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、HWS24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、MS225DU電子天平（梅特勒-托利多）、UV-1800紫外可見分光光度計（上海美普達(dá)儀器有限公司）。

1.2 試藥

樣品由浙江天草生物科技股份有限公司生產(chǎn)提供的樣品（批號：20180801、20180802、20180803）以及多種市售產(chǎn)品的樣品組成，具體樣品信息見表1。原花青素B1對照品購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（批號：PRF7102743）,含量97.0%；兒茶素對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號：110877-201604），含量99.2%；綠原酸對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號：110753-201716），含量99.3%；原花青素B2對照品購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（批號：PRF9042803），含量98.0%；表兒茶素對照品購于中國藥品生物制品檢定所（批號：110878-200102），含量98.0%；根皮苷對照品購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（批號：PRF7101345），含量98.0%；水為娃哈哈純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司），乙酸（色譜級），乙腈（色譜級），甲醇（色譜級）。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用十八烷基鍵合硅膠填充柱[（C18(2)，100A，4.6×250 mm，5 μm）]；以乙腈-水-乙酸（80∶20∶0.4，v/v/v）為流動相A，2%乙酸水為流動相B，按表2中的要求進(jìn)行梯度洗脫；柱溫25 ℃；檢測波長為280 nm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于5 000。色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫表

圖1 對照品特征圖譜圖(A)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

2.2.1.1 對照品儲備溶液的制備

精密稱取，加甲醇溶解，將原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素和根皮苷分別制備成濃 度 為 0.4、0.4、2.0、0.8、0.8 mg·mL-1和 2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2.2.1.2 對照品溶液的制備

分別精密移取對照品儲備液，合并至50 mL容量瓶，用60%甲醇水稀釋至刻度搖勻待用，最后制成約含原花青素 B10.04 mg·mL-1、兒茶素 0.04 mg·mL-1、綠原酸 0.2 mg·mL-1、原花青素 B20.08 mg·mL-1、表兒茶素 0.08 mg·mL-1、根皮苷 0.2 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取供試品約25 mg于50 mL容量瓶中，加入約40 mL 60%甲醇水超聲溶解30 min，溶液冷卻至室溫后用60%甲醇水定容至刻度，搖勻待用。

2.3 線性關(guān)系考察

精密移取混合對照品溶液適量，加60%甲醇水溶解并稀釋，制成適宜的5個濃度梯度的溶液，搖勻，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品的濃度（c）為橫坐標(biāo)，對照品峰面積（A）為縱坐標(biāo)，計算線性回歸方程，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3～8。

表3 原花青素B1線性關(guān)系測定結(jié)果表

表4 兒茶素線性關(guān)系測定結(jié)果表

表5 綠原酸線性關(guān)系測定結(jié)果表

表6 原花青素B2線性關(guān)系測定結(jié)果表

表7 表兒茶素線性關(guān)系測定結(jié)果表

表8 根皮苷線性關(guān)系測定結(jié)果表

2.4 定量限和檢測限

按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，采用對照品溶液稀釋，進(jìn)樣測定。分別以3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的濃度值為測定方法的檢出限和定量限。結(jié)果見表9。

表9 檢出限和定量限表

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，根據(jù)峰面積計算進(jìn)樣精密度，結(jié)果見表10。進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果說明儀器精密度良好。

表10 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品1（批號20180801）6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測定6份樣品的含量，計算精密度，結(jié)果見表11。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果說明該方法重復(fù)性良好。

表11 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表（%）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品1（批號20180801）粗粉適量，在同一實(shí)驗(yàn)室里，在不同的時間內(nèi)，由不同的實(shí)驗(yàn)者，在不同的儀器上，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，得實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，結(jié)果穩(wěn)定，見表12。

表12 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表（%）

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已測定含量的蘋果提取物樣品1（批號：20180801）共18份，每份精密稱量，稱量的結(jié)果見表8，配制成相對濃度80%、100%、120%三個濃度的供試品溶液各6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，按外標(biāo)法以峰面積計算，結(jié)果見表13。

表13 回收率試驗(yàn)考察結(jié)果表

續(xù)表13

續(xù)表13

結(jié)果表明，6個組分回收率都在98%～102%，符合要求。

2.9 樣品的測定

取樣品1～10適量，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)配制成待測溶液，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取各對照品適量，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計算即得，結(jié)果見表14。

表14 含量測定結(jié)果表（%）

測定結(jié)果顯示目前蘋果提取物主要產(chǎn)品中原花青素B1含量都在1.8%左右，兒茶素含量都在2%左右，綠原酸含量都在10%左右，原花青素B2含量都在4%左右，表兒茶素含量都在3.5%左右，根皮苷含量都在5%左右，可以以此作為蘋果提取物的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測定蘋果提取物中主要有效成分原花青素B1、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、根皮苷的含量，方法簡便，重復(fù)性好，可用于快速測定蘋果提取物中主要有效成分的含量，為蘋果提取物的質(zhì)量評價提供了新的科學(xué)參考依據(jù)。