肖力 高平明 劉志剛 周杏 羅威耀 潘志偉 賈德勤

佛山市婦幼保健院兒科（廣東佛山528000）

手 足 口 病（hand?foot?and?mouth disease，HFMD）是由腸道病毒感染引起的急性傳染病，多發(fā)于學(xué)齡前兒童，尤其3歲以下兒童高發(fā)，表現(xiàn)為發(fā)熱和手足、臀部、口腔等部位的皮疹、皰疹。少數(shù)患兒可發(fā)展為重癥，可合并腦干腦炎、腦膜腦炎、肺出血、心肌炎、休克等，導(dǎo)致較高的病死率［1?2］。多數(shù)認(rèn)為［3?4］HFMD 發(fā)展到重癥過程，與感染后機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)及免疫紊亂密切相關(guān)。

而在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)中，β?內(nèi)啡肽（β?en?dorphin，β?EP）及其受體拮抗劑納絡(luò)酮的研究近年逐漸深入。有資料表明：β?EP參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、感染、休克、呼吸衰竭、心肌損害及免疫紊亂等各種病理生理過程［5?7］，而其受體拮抗劑納洛酮能有效阻斷這一進(jìn)程，緩解各種不良影響。

具體到重癥HFMD發(fā)展及診療過程中，有研究［4，8?9］顯示神經(jīng)免疫學(xué)指標(biāo)，如 β?EP、免疫球蛋白、白細(xì)胞亞群等與病情進(jìn)展密切相關(guān)，神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)紊亂是重要原因之一，但納洛酮在重癥HFMD治療中的應(yīng)用與效果評估，及其阻斷病程進(jìn)展機(jī)理，相關(guān)研究尚少見報(bào)道。故本研究從神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的角度，觀察重癥HFMD患兒納絡(luò)酮治療前后的的β?EP、免疫球蛋白、白細(xì)胞亞群水平等神經(jīng)免疫學(xué)指標(biāo)動態(tài)變化，以探討重癥手足口病的可能發(fā)病機(jī)制及納洛酮作為重癥患兒有效治療對策之一的理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象按衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南》2010版診療標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取2012年10月至2016年10月在廣東省佛山市婦幼保健院兒科住院的重癥HFMD患兒60例，所有病例均無其他慢性病史，診療常規(guī)按照診療指南進(jìn)行。

1.2 方法確診為重癥的患兒60例隨機(jī)分成常規(guī)治療組30例及納絡(luò)酮治療組30例，兩組間在年齡、性別、體質(zhì)量、病情等方面均無差異性。常規(guī)治療組按衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南》2010版常規(guī)治療，納絡(luò)酮治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加予納絡(luò)酮治療1周，方法為0.01～0.03 mg/（kg·次），每日2次，連續(xù)1周。兩組對象治療前后取靜脈血，測定血清IgG、IgA、IgM以及T淋巴細(xì)胞亞群水平，同時留取離心血清及腦脊液置?80℃冰箱保存統(tǒng)一檢測β?EP濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測人外周血T細(xì)胞亞群SAP法檢測試劑盒，由北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司提供；IgG、IgA、IgM檢測試劑盒由北京利德曼生化股份有限公司提供；β?EP試劑盒由廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司提供，廠家為CUSABIO，ELISA方法檢測，所有標(biāo)本一批測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。包括t檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)、方差分析等，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納絡(luò)酮治療組在納洛酮治療前后血清、腦脊液神經(jīng)免疫學(xué)指標(biāo)變化重癥患兒納絡(luò)酮治療前后血清、腦脊液β?EP呈顯著下降，IgA顯著升高，CD3、CD8、CD4/CD8均顯著變化，提示免疫功能在納洛酮治療后有顯著改善（表1）。

2.2 納絡(luò)酮治療組與常規(guī)治療組治療后血清、腦脊液神經(jīng)免疫學(xué)指標(biāo)變化納絡(luò)酮治療組與常規(guī)治療組在兩種方案治療后的對比中，納絡(luò)酮治療組血清、腦脊液β?EP均顯著降低，而IgA、IgM顯著升高，CD3、CD4/CD8顯著升高，CD8顯著下降，提示納洛酮治療相比常規(guī)治療，對β?EP降低與免疫功能改善有明顯作用（表2）。

2.3 重癥患兒納洛酮治療與常規(guī)治療比較臨床癥狀明顯改善見表3。

表1 納絡(luò)酮治療組在納洛酮治療前后血清、腦脊液β?EP以及免疫功能變化Tab.1 The changes of serum,cerebrospinal fluid and immunity function before and after Naloxone treatment in Naloxone treatment group±s

表1 納絡(luò)酮治療組在納洛酮治療前后血清、腦脊液β?EP以及免疫功能變化Tab.1 The changes of serum,cerebrospinal fluid and immunity function before and after Naloxone treatment in Naloxone treatment group±s

組別治療前治療后t值P值血清β-EP（pg/mL）1 421.2±34.2 358.3±21.4 11.241＜0.01腦脊液β-EP（pg/mL）1 633.3±52.1 574.4±72.5 15.471＜0.01 IgG（g/L）7.227±1.872 8.142±1.224 1.145＞0.05 IgA（g/L）0.268±0.014 0.481±0.117 3.421＜0.05 IgM（g/L）1.213±0.125 1.345±0.284 1.023＞0.05 CD3 46.13±5.21 64.48±4.88 4.342＜0.05 CD4 31.22±4.20 34.53±3.21 0.724＞0.05 CD8 42.42±3.75 28.30±3.00 3.713＜0.05 CD4/CD8 0.76±0.25 0.92±0.23 2.722＜0.05

表2 納絡(luò)酮治療組與常規(guī)治療組治療后血清、腦脊液β?EP以及免疫功能變化Tab.2 The changes of serum,cerebrospinal fluid and immunity function after treatment in Naloxone treatment group and conventional treatment group±s

表2 納絡(luò)酮治療組與常規(guī)治療組治療后血清、腦脊液β?EP以及免疫功能變化Tab.2 The changes of serum,cerebrospinal fluid and immunity function after treatment in Naloxone treatment group and conventional treatment group±s

組別常規(guī)治療組納絡(luò)酮治療組t值P值血清β-EP（pg/mL）1 213.2±42.2 358.3±21.4 10.311＜0.01腦脊液β-EP（pg/mL）1 365.2±51.4 574.4±72.5 17.234＜0.01 IgG（g/L）6.821±1.421 8.142±1.224 1.524＞0.05 IgA（g/L）0.211±0.132 0.481±0.117 4.221＜0.05 IgM（g/L）0.813±0.112 1.345±0.284 5.103＜0.05 CD3 41.13±3.25 64.48±4.88 4.822＜0.05 CD4 33.33±4.21 41.23±3.23 2.456＞0.05 CD8 62.22±3.23 28.30±3.00 5.123＜0.05 CD4/CD8 0.52±0.43 0.92±0.23 4.702＜0.05

表3 常規(guī)治療組與納絡(luò)酮治療組臨床療效比較Tab.3 The comparison of clinical effect between conventional treatment group and Naloxone treatment group±s

表3 常規(guī)治療組與納絡(luò)酮治療組臨床療效比較Tab.3 The comparison of clinical effect between conventional treatment group and Naloxone treatment group±s

組別常規(guī)治療組納洛酮治療組t值P值發(fā)熱（d）4.2±2.1 3.4±1.7 1.35＞0.05嘔吐（d）3.3±1.5 1.7±1.2 2.41＜0.05嗜睡（d）4.2±1.8 2.7±1.1 3.14＜0.01肢體抖動（d）3.2±1.4 1.8±1.1 2.23＜0.05治療后腦脊液壓力（mmHg）184±25 56±12.3 3.023＜0.05氣促（d）5.2±2.1 3.5±1.7 1.724＞0.05住院時間（d）11.3±2.5 7.5±2.3 2.722＜0.05

3 討論

HFMD是由多種腸道病毒引起的常見傳染病。患兒大多病情較輕，其中少數(shù)發(fā)展為重癥的，認(rèn)為所感染病原多為腸道病毒71型（EV71）。自從1997年馬來西亞發(fā)生EV71病毒感染以來，亞太地區(qū)出現(xiàn)了EV71的大流行，EV71感染已成為這些地區(qū)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。在這些流行病期間，許多兒童和嬰兒死于嚴(yán)重的并發(fā)癥，表現(xiàn)主要為腦干腦炎、腦膜腦炎、神經(jīng)源性肺出血、頑固性休克等，有較高的病死率［10?11］。在這些并發(fā)癥中，腦干腦炎是最重要的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，因?yàn)樗鼤?dǎo)致神經(jīng)源性肺出血/水腫導(dǎo)致死亡。盡管最近在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了EV71受體，如清道夫受體B2和P選擇糖蛋白配體1，但不清楚EV71感染主要涉及腦干的原因。

有關(guān)重癥HFMD發(fā)展機(jī)制的研究，一直是研究的焦點(diǎn)，尤其是神經(jīng)免疫學(xué)機(jī)制在其中所起作用，報(bào)道不多，尚有不少值得探究之處。一般認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)在感染因子刺激下釋放β?EP，其中部分β?EP進(jìn)入血液，部分直接進(jìn)入腦脊液，故病情越重，血漿、腦脊液中的β?EP含量越高。β?EP作為活性最強(qiáng)的內(nèi)源性神經(jīng)肽，除在外傷保護(hù)、心腦血管和呼吸節(jié)律調(diào)節(jié)方面起作用外，也對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有顯著抑制作用，進(jìn)而加重腦損害，導(dǎo)致后續(xù)系列的病理進(jìn)程，臨床上逐漸出現(xiàn)意識喪失、呼吸和心力衰竭、缺氧青紫及反復(fù)抽搐等，最終導(dǎo)致死亡。筆者前期研究表明［9］，重癥HFMD患兒相比較普通患兒，血漿、腦脊液的β?EP均呈顯著升高，臨床癥狀體現(xiàn)為持續(xù)病情加重、肢體抖動、抽搐、精神萎靡乃至意識障礙等，有的合并呼吸和循環(huán)系統(tǒng)受累或者衰竭表現(xiàn)，如肺水腫、肺出血、心衰、休克等，從而提示監(jiān)測重癥患兒血漿、腦脊液β?EP的水平有助臨床病情的判斷和指導(dǎo)危重?fù)尵取?/p>

納洛酮是阿片受體純拮抗劑，能解除阿片類藥物中毒癥狀和非常量β?EP產(chǎn)生的病理和生理效應(yīng)，故納洛酮在臨床應(yīng)用廣泛，包括對休克、神經(jīng)系統(tǒng)疾患、藥物中毒等的治療以及心腦肺復(fù)蘇等。在重癥HFMD治療方面，楊蓮榮等［12］觀測到手足口病合并腦炎患兒腦脊液中β?EP含量較正常對照組明顯升高，高壓氧綜合治療后不但β?EP顯著降低，且療效更好；王肖茜等［13］應(yīng)用納洛酮治療手足口病合并腦炎患兒，也有一定臨床療效。本研究結(jié)果顯示：重癥患兒納洛酮治療前后，血漿、腦脊液β?EP水平均顯著下降，納洛酮可通過拮抗β?EP對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用，阻斷內(nèi)源性阿片肽繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程，增加腦灌注，保證腦干、腦實(shí)質(zhì)等重要部位的血流供應(yīng)，減輕腦水腫、腦細(xì)胞死亡，促進(jìn)損傷神經(jīng)恢復(fù)功能。從本研究納洛酮治療重癥患兒臨床療效來看，在嘔吐、嗜睡、肢體抖動、氣促、腦脊液壓力、住院時間等關(guān)鍵臨床指標(biāo)上均有顯著改善，提示納洛酮治療的科學(xué)性、有效性，反過來證明β?EP確實(shí)在一定程度參與了重癥手足口病的發(fā)展過程，尤其是β?EP與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的密切相關(guān)性。

至于重癥手足口病患兒的免疫功能狀態(tài)，有許多研究結(jié)果認(rèn)為：體液免疫應(yīng)答主要在早期，或發(fā)生臟器損傷［14］；而在發(fā)展到重癥過程中，細(xì)胞免疫方面，CD8升高，CD3、CD4、CD4/CD8均有顯著的下降，提示細(xì)胞免疫紊亂主要發(fā)生在手足口病進(jìn)展到重癥過程階段。此外，免疫紊亂除體現(xiàn)在外周免疫系統(tǒng)外，也直接反映在中樞神經(jīng)組織的炎癥免疫介導(dǎo)上，閉書文等［15］用免疫組化方法檢測尸檢病例的中樞神經(jīng)組織中T、B、NK和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的分布與數(shù)量，發(fā)現(xiàn)HFMD死亡患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)符合炎癥性病變，炎癥細(xì)胞CD3、CD4、CD8T細(xì)胞及B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)在中腦、腦橋、延髓和脊髓明顯增多，從而提示中樞系統(tǒng)內(nèi)的T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫以及巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞參與的固有免疫共同參與了HFMD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的局部免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示：重癥HFMD確實(shí)出現(xiàn)CD3、CD4、CD4/CD8的全面下降，CD8顯著升高，與BROOKS等［16］通過動物實(shí)驗(yàn)得出在宿主反應(yīng)的急性期（感染后11 d）內(nèi)，CD4 T淋巴細(xì)胞減少，CD8 T淋巴細(xì)胞逐步上升的結(jié)果相符。COX等［17］在研究腸道病毒71型在發(fā)病過程中的免疫與病理機(jī)制時也發(fā)現(xiàn)機(jī)體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫紊亂與病毒?宿主的相互作用有關(guān)。從而提示，細(xì)胞免疫紊亂是重癥HFMD發(fā)生的重要參與機(jī)制之一，也為如何從免疫重平衡入手阻斷重癥HFMD提供了思路。

結(jié)合神經(jīng)免疫兩大系統(tǒng)，早在1977年BASE?DORKY就提出了“神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說”，其主要內(nèi)容就是免疫與神經(jīng)兩大系統(tǒng)間存在相互的信息交流。有研究表明，神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)免疫功能的途徑是多方面的，包括內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽在內(nèi)的神經(jīng)免疫肽就在免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用，王曉青等［18］發(fā)現(xiàn)納洛酮可抑制CD4淋巴細(xì)胞的分化、成熟，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫失衡狀態(tài)的作用。本研究結(jié)果反映出內(nèi)啡肽拮抗劑納洛酮在重癥患者的治療應(yīng)用后體液免疫、細(xì)胞免疫及β?EP的顯著變化及臨床癥狀明顯改善，體現(xiàn)了神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的紊亂參與了HFMD發(fā)展到重癥的過程，具體路徑為納洛酮通過拮抗β?EP以及調(diào)節(jié)免疫失衡達(dá)到減緩腦損傷、阻斷重癥進(jìn)程的作用。提示納洛酮可作為重癥患兒有效治療對策之一。

至于免疫紊亂、β?EP的持續(xù)升高以及整體機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境失衡，到底多大程度上參與重癥手足口病發(fā)病進(jìn)程，更詳細(xì)的相互影響機(jī)制如何，尚有待深入研究。除神經(jīng)系統(tǒng)受累外，重癥手足口病的其他幾大主要癥狀，如肺水腫、肺出血、心衰、休克等，也與機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境的失衡、紊亂密切相關(guān)。PENG等［19］探討了嚴(yán)重手足口病患者神經(jīng)源性肺水腫（NPE）的危險(xiǎn)因素，通過薈萃分析方法進(jìn)行敏感性分析和發(fā)表偏倚評估。結(jié)論認(rèn)為：嗜睡在患有嚴(yán)重手足口病的兒童中是NPE的首要危險(xiǎn)因素，其次是嘔吐、心動過速、高血壓、呼吸節(jié)律變化、肢體震顫以及非典型皮疹和高血糖。前兩位的危險(xiǎn)因素也同樣提示神經(jīng)免疫紊亂與NPE密切相關(guān)。深入具體機(jī)制是否與β?EP變化、細(xì)胞免疫紊亂等相關(guān)，有關(guān)研究亦值得更深入的探討。

另外，重癥手足口病的治療方面，對于EV71感染嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如腦干腦炎，一般建議選用靜脈注射免疫球蛋白和米力農(nóng)等治療。從臨床療效反饋來看，結(jié)果符合預(yù)期，亦體現(xiàn)了從免疫再平衡入手，通過阻斷重癥手足口病發(fā)病發(fā)展過程，緩解神經(jīng)免疫介導(dǎo)的病理生理進(jìn)程，以達(dá)到治療的目的。