李瑩 劉琦 歐三桃 吳蔚樺 甘林望

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科（四川瀘州 646000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）作為終末期腎病，是糖尿病患者的主要死亡原因之一［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，Lnc RNA）異常表達在DN等多種疾病中扮演著重要角色［4-5］。然而，LncRNA在DN的炎癥過程中的功能和作用機制仍未揭開神秘面紗。

LncRNA作為一類長度超過200個核苷酸的功能性RNA，LncRNA可在多水平調(diào)控基因表達，與miRNA、mRNA或蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控等［6-7］。研究表明，LncRNA的表達與許多內(nèi)分泌和代謝疾病密切相關［8-9］，而在DN方面的研究還處于起步階段。課題組前期通過基因芯片發(fā)現(xiàn)LncRNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1（KCNQ1 overlapping transcript 1，KCNQ1OT1）在DN患者血清中明顯高于正常對照組，本研究擬進一步探討LncRNA KC?NQ1OT1在DN中的作用及意義，通過本研究為闡明DN的發(fā)病機制提供新的理論基礎，為DN的治療和預后分析提供新的生物學標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2015年1月至2017年12月于我院就診的137例糖尿病患者，77例Ⅱ型糖尿?。═2D）患者（無DN病史，無蛋白尿）中，60例T2D合并DN（30例微量白蛋白尿，30例大量蛋白尿），同時收集于我院體檢中心就診的60例非糖尿病健康者作為對照組，收集所有研究對象的外周血液標本同時收集樣本臨床資料，研究對象一般資料見表1。研究對象中包括77例T2D患者（無DN病史，無蛋白尿）作為T2D組，60例T2D合并DN（30例微量白蛋白尿，30例大量蛋白尿）作為DN組，60例非糖尿病健康者作為對照組，3組患者的年齡、性別、平均血壓、糖尿病病程、體質(zhì)指數(shù)（BMI）之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），甘油三酯在DN組較T2D組及對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而T2D組及對照組間甘油三酯的量差異無明顯差異（P＞0.05）；DN組患者的蛋白尿及血清肌酐較T2D組及對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DN組患者的腎小球濾過率（eGFR）明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而T2D組及DN組兩組患者的糖化血紅蛋白較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在通過本院倫理委員會批準，研究對象知情同意的同時采集靜脈血液標本5 mL，將收集的血液標本靜置于4℃冷藏30 min后，室溫下3 000 r/min離心15 min，留取上層血清，置于-80℃冰箱備用。

1.2 Real?time PCR分析LncRNA KCNQ1OT1的表達水平應用TRIzol（美國Invitrogen公司產(chǎn)品）試劑提取血清中總RNA。將提取的總RNA，參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品］說明書提供的方法將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix［寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品］，以cDNA為摸板，進行qRT?PCR。根據(jù)目標基因設計合成相應上下游引物進行PCR擴增，以P53作為內(nèi)參照。KCNQ1OT1上游引物5′?CCCAGAAATCCACACCTCGG?3′；下游引物 5′?TCCTCAGTGAGCAGATGGAGA?3′；P53 上游引物5′?TACATGGGCCGAGGCAAGATAA?3′；下游引物5′?ATAGCCCAGGGAAGTGAAGGTGTC?3′。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；（95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃30 s）×40 個循環(huán)。以 2?ΔΔCt值表示 LncRNA KC?NQ1OT1的表達水平。

表1 研究者的一般臨床資料Tab.1 Baseline characteristics of subjects ±s

表1 研究者的一般臨床資料Tab.1 Baseline characteristics of subjects ±s

臨床特征性別（男/女）年齡（歲）平均血壓（mmHg）甘油三酯（mmol/L）空腹血糖（mmol/L）糖尿病病程（年）BMI（kg/m2）蛋白尿（mg/24 h）血清肌酐（mmol/L）eGFR［mL/（min·1.73 m2）］糖化血紅蛋白（%）T2D（n=77）39/38 60.2±10.0 86.0±12.0 1.5±0.7 8.5±1.7 15.5±5.0 25.7±4.8 6.7±3.4 65.7±9.0 95.7±9.0 8.7±3.0 DN（n=60）29/31 64.0±7.4 96.2±10.0 2.8±0.4 8.9±1.3 18.0±6.7 26.9±5.5 1236.7±49.0 120.8±35.0 65.0±12.0 9.4±2.2 Control（n=60）28/32 62.8±6.1 84.2±5.0 1.2±0.5 4.5±0.9 24.9±3.6 3.8±1.8 50.8±11.4 105.0±13.0 4.1±0.6 P值0.920 0.690 0.173 0.020 0.007 0.792 0.690＜0.001 0.001 0.019 0.030

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用t檢驗或One?way ANOVA分析，用表示；LncRNA KCNQ1OT1與各臨床病理參數(shù)之間的關系使用Chi?Square檢驗；ROC分析評估LncRNA KCNQ1OT1作為DN的生物標志物潛能的分析；Pearson′s線性回歸法分析KC?NQ1OT1與蛋白尿、腎小球濾過率及其他臨床病理特征的相關性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA KCNQ1OT1在T2D、DN患者及健康對照組中的表達QRT?PCR檢測LncRNA KC?NQ1OT1在T2D組、DN組及健康對照組患者中的差異表達，結(jié)果提示與健康對照組比較，LncRNA KCNQ1OT1在T2D、DN患者中的表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（F=19.790，P＜ 0.001，圖1）；進一步分析發(fā)現(xiàn)，DN組患者LncRNA KCNQ1OT1的表達較T2D患者明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（t=25.570，P＜ 0.001，圖1）。

2.2 LncRNA KCNQ1OT1在不同量蛋白尿中的表達進一步檢測不同程度蛋白尿患者LncRNA KCNQ1OT1的表達，結(jié)果提示LncRNA KCNQ1OT1在DN合并大量蛋白尿患者血清中的表達較DN合并微量蛋白尿患者及T2D患者（正常尿蛋白）明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（F=17.630，P＜0.001，圖2）。在DN患者中，合并大量蛋白尿患者的LncRNA KCNQ1OT1表達較合并微量蛋白尿患者明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（t=13.620，P＜0.001，圖2）。

圖2 LncRNA KCNQ1OT1在不同量蛋白尿中的表達Fig.2 Association of LncRNA KCNQ1OT1 levels with the degree of albuminuria

2.3 LncRNA KCNQ1OT1的表達與析糖尿病腎病患者的蛋白尿及腎小球濾過率的相關性Pearson′s線性相關系數(shù)分析血清LncRNA KCNQ1OT1的表達與DN患者的蛋白尿中及腎小球濾過率的相關性，結(jié)果提示血清LncRNA KCNQ1OT1的表達與蛋白尿的表達量呈正相關關系（r=0.690，P＜0.001，圖3A）；而與腎小球濾過率呈負相關關系（r=-0.780，P＜ 0.001，圖3B）。

圖3 Pearson′s線性相關系數(shù)分析血清LncRNA KCNQ1OT1的表達與糖尿病腎病患者的蛋白尿中及腎小球濾過率的相關性Fig.3 Pearson′s coefficient correlation analysis was undertaken in patients with DN to determine the correlation between circulating LncRNA KCNQ1OT1 levels and albuminuria，eGFR

2.4 受試者工作特征曲線（ROC）分析首先采用ROC分析在DN患者和T2D患者間LncRNA KCNQ1OT1作為DN患者血清標志物的潛能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ROC曲線下面積（AUC）為 0.861（95%CI：0.786～0.935，P＜0.001，圖4A）；進一步在DN和健康對照組間分析LncRNA KCNQ1OT1作為DN患者血清標志物的潛能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AUC為0.914（95%CI：0.828 ～ 0.980，P＜ 0.001，圖4B）。

3 討論

KCNQ1OT1，是一個位于KCNQ1位點的長鏈非編碼RNA基因［10］。KCNQ1OT1是一個印跡基因，只表達父源等位基因［11-12］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，印記基因的異常表達引發(fā)伴有復雜突變和表型缺陷的多種人類疾病，印記基因的異常與惡性腫瘤的發(fā)生相關［13］，也與炎癥及血管疾病相關［14］。

圖4 受試者工作特征曲線（ROC）分析LncRNA KCNQ1OT1作為判別DN患者血清標志物的潛能Fig.4 The receiver operating characteristic（ROC）analysis was used to assess the biomarker potential of LncRNA KCNQ1OT1

本研究結(jié)果提示KCNQ1OT1在T2D及DN患者中的表達較健康對照組明顯升高。KCNQ1OT1在合并大量蛋白尿的DN患者中的表達明顯高于合并微量蛋白尿患者。KCNQ1OT1的表達與蛋白尿的水平呈正相關關系，與腎小球濾過率呈負相關關系。在T2D與DN患者中KCNQ1OT1作為DN患者血清標志物的潛能的AUC為0.861，在DN患者與健康患者中KCNQ1OT1作為DN的AUC為0.914。以上研究結(jié)果提示KCNQ1OT1的高表達與T2D患者DN的發(fā)展有關，有望成為預測DN患者預后的生物標志物。本研究首次報道了KC?NQ1OT1在DN患者血清中高表達，其表達與DN患者蛋白尿的量及腎小球濾過率相關，本研究將進一步豐富DN的發(fā)病機制，為DN靶基因治療提供新的靶點，為尋找DN診斷及預后的生物學標志物的研究提供依據(jù)，為解決臨床棘手的DN提供一種新策略。但影響DN的因素很多，其具體的發(fā)病機制及診斷及預后療效評估尚需進一步深入研究。