費(fèi)靜 王長(zhǎng)黎 李雷激

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（四川瀘州 646000）；2自貢市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（四川自貢643000）

面癱是臨床常見(jiàn)病，屬于針灸的Ⅰ級(jí)病譜［1］且療效確切［2］，但具體機(jī)制尚不明確。神經(jīng)元胞體是整個(gè)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)中心，是損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的基礎(chǔ)［3］。嚴(yán)重的周圍面神經(jīng)損傷，會(huì)引起中樞面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡［4］。面神經(jīng)損傷后的修復(fù)是多因素綜合作用的結(jié)果。細(xì)胞信號(hào)分子如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子、黏附分子等在面神經(jīng)再生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。上皮鈣黏素（E?cadherin，E?cad）屬鈣黏素超家族黏附分子，其生物功能的發(fā)揮需要第二信使Ca2+的參與［5］，通過(guò)直接的黏附作用在神經(jīng)元修復(fù)過(guò)程中參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持和信號(hào)傳遞。鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）是最重要的鈣調(diào)蛋白，通過(guò)與Ca2+的特異性結(jié)合，促進(jìn)DNA、mRNA等遺傳物質(zhì)的合成，從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂再生［6］。

關(guān)于E?cad和CaM在周圍神經(jīng)再生過(guò)程中是否發(fā)揮作用，以及電針通過(guò)上述兩種分子介導(dǎo)的周圍面神經(jīng)再生的作用方式和途徑，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就該問(wèn)題提出設(shè)想，試圖揭示E?cad和CaM在周圍神經(jīng)再生過(guò)程中的功能以及兩者之間的關(guān)系，以進(jìn)一步探索穴位電針治療周圍性面癱的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立新西蘭大白兔52只，6～8個(gè)月齡，體質(zhì)量（2.5± 0.25）kg，雌雄不限，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)：SCXK（川）2013?17］，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。將其隨機(jī)分成正常組（4只）、手術(shù)組（24只）和電針組（24只）。正常組不作任何處理；手術(shù)組、電針組均制作右側(cè)面神經(jīng)上頰支壓榨性損傷的病理摸型［7］：3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉動(dòng)物，取右耳屏前至下頜角下緣作“S”形切口，鈍性分離出面神經(jīng)上頰支，止血鉗全鉗夾持面神經(jīng)頰支30 s，松開30 s，再鉗夾30 s，鉗夾的總時(shí)間為1 min，鉗夾部分的面神經(jīng)長(zhǎng)約2 cm，手術(shù)顯微鏡下觀察，損傷程度符合Sunderland損傷Ⅳ度?？p合切口、復(fù)蘇、分籠飼養(yǎng)，預(yù)防感染。

1.2 電針干預(yù)手術(shù)組于造模后不作治療，自然康復(fù)。電針組術(shù)后2 h開始行穴位電針干預(yù)。取穴［7］：翳風(fēng)：下頜升支后緣中點(diǎn)向后0.5 cm。頰車；咬肌最隆起之處。四白：眶下孔下方0.5 cm。地倉(cāng)：口角外側(cè)1.0 cm。陽(yáng)白：眶上緣中點(diǎn)以上約1.0 cm。顴繆：經(jīng)外眥垂線之顴骨顳突下緣凹陷處。穴位配對(duì)：翳風(fēng)-顴繆、頰車-地倉(cāng)、陽(yáng)白-四白。采用0.25 mm×0.25 mm無(wú)菌毫針，按上述穴位配對(duì)連接青島鑫升G6805?1A型治療儀，設(shè)置治療參數(shù)：電壓2 V，頻率18～20 Hz，疏密波，由低頻往高頻調(diào)，以頰肌輕微顫動(dòng)且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能忍受的程度為宜。治療時(shí)長(zhǎng)為30 min，每天1次。

1.3 取材正常組直接取材；手術(shù)組和電針組分別于術(shù)后1、4、7、14、21、28 d取材（每組在各時(shí)間點(diǎn)取4只）。RT?qPCR取材方法：耳緣靜脈注射空氣處死動(dòng)物，離斷兔頭，剪開頭骨，顳骨向外側(cè)骨折，保留右側(cè)位聽(tīng)神經(jīng)根作為術(shù)側(cè)標(biāo)記。于冰臺(tái)上去除小腦四疊體，從腦橋上緣開始至腦橋下緣3 mm切取腦橋組織，分為3塊，每塊厚度≤3 mm，-80℃冰箱凍存。切片標(biāo)本的取材方法：腹腔麻醉動(dòng)物后經(jīng)腹切口暴露腹主動(dòng)脈后結(jié)扎，剪開胸骨，進(jìn)入胸腔，0.9%生理鹽水500 mL經(jīng)心灌注至右心房流出液不含血性液，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛400 mL作預(yù)固定。依RT?qPCR取材方法獲得含面神經(jīng)元的腦干組織，10%福爾馬林固定24 h。

1.4 HE染色HE試劑盒（G1120，Solarbio）。按以下順序操作：組織蠟塊切片→脫蠟水化→自來(lái)水5 min→蘇木素10 min→自來(lái)水5 min→氯化氫無(wú)水乙醇15 s→自來(lái)水10 min→1∶400氨水15 s→自來(lái)水5 min→伊紅30 s→梯度酒精脫水→二甲苯透明→中性樹脂封片。

1.5 免疫組化SABC法染色（SABC?POD試劑盒，SA1022，Boster）。按以下順序操作：切片脫蠟水化→3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗→0.01 mol/L枸櫞酸鹽（pH 6.0），熱修復(fù)抗原→5%BSA室溫封閉20 min→37℃孵育一抗1.5 h→二抗，室溫20 min，PBS浸洗→SABC，室溫 20 min，PBS洗5 min×4次→DAB室溫顯色10 min→蘇木素復(fù)染→脫水，透明，封片。

1.6 RT?qPCR采用RNAsimple Total RNA Kit［天根生化科技（北京）有限公司］提取實(shí)驗(yàn)材料中的RNA，紫外線分析儀分別測(cè)定在260 nm和280 nm處的紫外光吸收值（OD值），以O(shè)D260/280來(lái)計(jì)算總RNA的純度。本組實(shí)驗(yàn)的所有標(biāo)本OD260/280值在1.72～1.94之間，具有實(shí)驗(yàn)意義。由重慶生工科技有限公司設(shè)計(jì)并合成PCR引物（表1），以β?actin為內(nèi)參基因。按PrimeScriptTMRT Master Mix說(shuō)明書制備10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液以及20 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃30 s，1循環(huán)；PCR反應(yīng) 95℃ 5S，58 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；繪制融解曲線 95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。E?cad與CaM的融解曲線均為單一吸收峰，引物特異性較高。由StepOne Plus Real?time PCR System輸出CT值，按2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行分析，RT?qPCR各樣本的CT值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。E?cad和CaM的表達(dá)情況采用方差分析進(jìn)行組間兩兩比較。E?cad與CaM的關(guān)聯(lián)性采用直線相關(guān)分析。免疫組化數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間不同時(shí)間點(diǎn)的比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列Tab.1 The PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的右側(cè)口角下垂、眼裂增大、耳下垂、胡須倒伏、眼瞼閉合不全等周圍性面癱表現(xiàn)。至術(shù)后14 d，手術(shù)組和電針組差別不明顯。術(shù)后21 d，2組均有一定程度好轉(zhuǎn)，但均未完全恢復(fù)，電針組較手術(shù)組輕。術(shù)后28 d，除手術(shù)組仍有1只動(dòng)物雙側(cè)口角不對(duì)稱外，2組動(dòng)物靜息狀態(tài)均未見(jiàn)面癱表現(xiàn)，但進(jìn)食時(shí)手術(shù)組患側(cè)口角運(yùn)動(dòng)受限。

2.2 HE染色通過(guò)HE染色，在光鏡下確定面神經(jīng)元的位置并觀察其形態(tài)變化。面神經(jīng)元位于腦橋組織的中下部分靠近腹正中線偏外側(cè)，低倍鏡下表現(xiàn)為大多角形運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞成團(tuán)聚集。

2.3 RT?qPCR結(jié)果

2.3.1 E?cad和CaM mRNA相對(duì)表達(dá)量的分析術(shù)后7 d，手術(shù)組E?cad mRNA表達(dá)出現(xiàn)高峰，至14 d后逐漸降低；而電針組術(shù)后7 d出現(xiàn)高表達(dá)量，維持1周并緩慢上升，至14 d出現(xiàn)表達(dá)高峰。2組CaM mRNA的表達(dá)均先平穩(wěn)上升、于14 d至表達(dá)高峰后再平穩(wěn)下降，且電針組的表達(dá)量及上升趨勢(shì)明顯高于手術(shù)組。將3組E?cad和CaM mRNA在各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明電針可促進(jìn)面神經(jīng)元中E?cad 和CaM mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖1、2。

2.3.2 E?cad和CaM mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析電針組和手術(shù)組的相關(guān)系數(shù)分別為r=0.619和r=0.420，均P＜0.05，說(shuō)明2組計(jì)量資料存在關(guān)聯(lián)性，E?cad和CaM mRNA在面神經(jīng)元的相對(duì)表達(dá)量正相關(guān)。

2.4 免疫組化結(jié)果E?cad及CaM陽(yáng)性表達(dá)位于面神經(jīng)元細(xì)胞核、細(xì)胞漿、軸突、樹突，呈棕黃色，見(jiàn)圖3。除術(shù)后14 d，2組E?Cad細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），與手術(shù)組相比，電針組E?Cad的細(xì)胞數(shù)目在術(shù)后顯著增多并于術(shù)后21 d至表達(dá)高峰，見(jiàn)圖4。2組CaM陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后電針組CaM陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯多于手術(shù)組，且在術(shù)后14 d到達(dá)表達(dá)高峰（P＜0.001），見(jiàn)圖5。

圖1 各時(shí)間點(diǎn)E?cad mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of E?cad mRNA in three groups at each time point

圖2 各時(shí)間點(diǎn)CaM mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of CaM mRNA in three groups at each time point

3 討論

面神經(jīng)再生是當(dāng)今的一大難題，藥物、手術(shù)等治療方式存在著一定的局限性，針刺治療為WHO推薦的治療周圍性面癱的首選方法［8］。電針療法選取神經(jīng)主干或分支通過(guò)（或接近）的穴位，將針刺與微量低頻脈沖式電流刺激相結(jié)合，具有治療目標(biāo)明確的特點(diǎn)［9-11］。俞建輝［12］、張中一等［13］將電針療法應(yīng)用于周圍性面癱的臨床治療，認(rèn)為電針的治療效果顯著優(yōu)于藥物治療和傳統(tǒng)針灸療法。在本實(shí)驗(yàn)中，電針組兔右側(cè)口角下垂、耳下垂、胡須倒伏、眼瞼閉合不全等面癱癥狀較手術(shù)組恢復(fù)提前且完全，明確了電針治療周圍性面癱的有效性，與既往研究一致［14］。

面神經(jīng)再生最重要的因素是保持面神經(jīng)元的活性，由胞體供給營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)［15］。神經(jīng)再生的微環(huán)境中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、黏附分子等信號(hào)分子在面神經(jīng)元的恢復(fù)中起著重要的作用；另外，Ca2+、Na+等短時(shí)間內(nèi)通過(guò)離子通道大量轉(zhuǎn)運(yùn)，與神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)密切相關(guān)［16］。

圖3 面神經(jīng)元CaM、E?cad免疫染色（×200）Fig.3 Facial motoneurons in CaM，E?cad immunostaining（× 200）

圖4 E?cad免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分析Fig.4 Analysis of E?cad positive cell numbers by immunohistology

黏附分子主要位于神經(jīng)元胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)中，以受體?配體結(jié)合的形式，介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間、細(xì)胞與細(xì)胞之間相互識(shí)別、黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［17］。E?cad屬于Ⅰ型經(jīng)典鈣依賴性跨膜糖蛋白，通過(guò)與Ca2+特異性結(jié)合介導(dǎo)同型細(xì)胞連接黏附［18］。Calmodulin是細(xì)胞內(nèi)高度保守、廣泛存在的一類重要的單鏈鈣離子受體蛋白，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、促進(jìn)遺傳物質(zhì)合成、調(diào)節(jié)第二信使CaMP的合成和分解［19-20］。

圖5 CaM免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分析Fig.5 Analysis of CaM positive cell numbers by immunohistology

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立右側(cè)面神經(jīng)上頰支壓榨性損傷的動(dòng)物模型，以穴位電針為干預(yù)，發(fā)現(xiàn)電針能上調(diào)E?cad和CaM mRNA在面神經(jīng)元中表達(dá)，并延長(zhǎng)了表達(dá)高峰期，且電針組E?cad和CaM免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也高于手術(shù)組，說(shuō)明穴位電針可促進(jìn)中樞面神經(jīng)元E?cad和CaM的合成和分泌，并能維持其高表達(dá)，從而促進(jìn)面神經(jīng)元功能的恢復(fù)。從E?cad與CaM表達(dá)的關(guān)聯(lián)性來(lái)看，上述兩種分子均依賴Ca2+的“激活”，E?cad的功能從與第二信使Ca2+結(jié)合發(fā)生分子構(gòu)象改變開始［21］，而CaM與Ca2+結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞電壓依賴性Ca2+通道等離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的易化和失活，介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)［22-23］?？赡苁牵車嫔窠?jīng)外周損傷致逆向中樞面神經(jīng)元變性，Ca2+的內(nèi)流啟動(dòng)修復(fù)過(guò)程，并與E?cad結(jié)合使之發(fā)揮其生物學(xué)功能。同時(shí)，Ca2+的內(nèi)流可誘導(dǎo)CaM的表達(dá)量增高，進(jìn)而對(duì)離子通道進(jìn)行調(diào)控。三者之間相互作用，共同促進(jìn)面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能恢復(fù)。但電針治療對(duì)胞內(nèi)Ca2+的濃度變化以及介導(dǎo)的三者之間的具體調(diào)控機(jī)制，尚需要進(jìn)一步的研究探索。