黃超有 李璽 韓錚 朱珊珊

1廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院乳腺甲狀腺外科（廣州 511400）；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院乳腺甲狀腺外科（廣州 510630）

乳腺癌是國(guó)內(nèi)女性最常見(jiàn)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性身心健康［1］，其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸受到多種因素調(diào)控，上皮?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchy?mal transition，EMT）是其中重要因素［2］。EMT 可顯著促進(jìn)腫瘤局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］，其還與腫瘤化療耐藥和腫瘤干細(xì)胞形成密切相關(guān)［4］。研究表明Prefoldin（PFDN）亞型PFND1直接參與調(diào)控細(xì)胞骨架重排［5］，而細(xì)胞骨架重排又是EMT的重要環(huán)節(jié)［6］，但PFND1是否對(duì)乳腺癌癌細(xì)胞EMT過(guò)程產(chǎn)生影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬以乳腺癌BT474細(xì)胞株為材料，PFND1對(duì)乳腺癌癌細(xì)胞EMT過(guò)程的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器乳腺癌BT474細(xì)胞株，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所；pLKO.1慢病毒表達(dá)載體，購(gòu)自美國(guó) Sigma；PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），購(gòu)自日本TaKaRa；羊抗人PFDN1多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz；鼠抗人GAPDH單克隆抗體、兔抗人E?cadherin抗體、兔抗人N?cad?herin抗體、兔抗人vimentin抗體，購(gòu)自美國(guó)CST公司；Western一抗稀釋液、Western一抗二抗去除液，購(gòu)自碧云天生物；聚碳酯膜（PC）Transwell?嵌套（24孔板專用），購(gòu)自美國(guó) corning；LEGEND MI?CRO17離心機(jī)、LEGEND MACH 1.6R離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Thermo；-80℃超低溫冰箱，購(gòu)自日本SANYO；M5多功能酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Molecμlar Devices；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)ABI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)BT474細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的RPMI?1640培養(yǎng)基，并置于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2.2 慢病毒真核表達(dá)載體構(gòu)建使用pLKO.1慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建pLKO.1?sh?PFND1，并設(shè)1種對(duì)照片段，包裝生產(chǎn)相應(yīng)的慢病毒，感染BT474細(xì)胞株。根據(jù)載體種類將轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分成3組：轉(zhuǎn)染組，由含干擾片段質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；空白轉(zhuǎn)染組，由含對(duì)照片段質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；未轉(zhuǎn)染組，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

1.2.3 細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，血清饑餓過(guò)夜，胰酶消化后以無(wú)血清RPMI?1640重懸為單細(xì)胞懸液，濃度為1.0×105/mL及1.0×104/mL，分別用于Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 PFDN1及EMT標(biāo)志分子mRNA表達(dá)情況提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Real?time PCR 檢測(cè)PFDN1、E?cadherin、N?cadherin、Vimentin mRNA。根據(jù)2-△△CT方法計(jì)算各待測(cè)mRNA相對(duì)于內(nèi)參的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 PFDN1及EMT標(biāo)志分子蛋白表達(dá)情況提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，電泳、轉(zhuǎn)膜，采用Western blot法檢測(cè)PFDN1、E?cadherin、N?cadherin、Vimentin蛋白。以各蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值代表各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0處理數(shù)據(jù)，各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料按（）表示。多組間對(duì)比采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定低表達(dá)PFDN1的BT474細(xì)胞系驗(yàn)證與未轉(zhuǎn)染組對(duì)比，轉(zhuǎn)染組PFDN1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05），空白轉(zhuǎn)染組PFDN1 mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組BT474細(xì)胞系PFDN1 mRNA及蛋白表達(dá)情況對(duì)比Tab.1 Comparison of PFDN1 mRNA and protein expression in three groups（n=3） ±s

表1 3組BT474細(xì)胞系PFDN1 mRNA及蛋白表達(dá)情況對(duì)比Tab.1 Comparison of PFDN1 mRNA and protein expression in three groups（n=3） ±s

注：與轉(zhuǎn)染組對(duì)比，*P＜0.05；與空白轉(zhuǎn)染組對(duì)比，#P＜0.05

組別PFDN1 mRNA PFDN1蛋白轉(zhuǎn)染組空白轉(zhuǎn)染組未轉(zhuǎn)染組F值P值0.42±0.02 0.67±0.29*1.00±0.00*25.463 0.001 0.70±0.11 4.04±0.17*4.40±0.20*#451.233 0.000

2.2 3組細(xì)胞系侵襲及轉(zhuǎn)移能力對(duì)比細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)為（28.33±4.16）個(gè)，空白轉(zhuǎn)染組為（77.33±6.51）個(gè)，未轉(zhuǎn)染組為（81.00±8.00）個(gè)，轉(zhuǎn)染組上述細(xì)胞數(shù)明顯低于空白轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），見(jiàn)圖1。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)為（22.33±2.08）個(gè)，空白轉(zhuǎn)染組為（34.00±2.65）個(gè)，未轉(zhuǎn)染組為（37.00± 3.61）個(gè)，轉(zhuǎn)染組上述細(xì)胞數(shù)明顯低于空白轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 3組Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（×200）Fig.1 Transwell invasion test in three groups

2.3 3組細(xì)胞EMT標(biāo)志分子mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染組E?cadherin mRNA表達(dá)水平明顯高于空白轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，N?cadherin mRNA和Vimentin mRNA表達(dá)水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 3組細(xì)胞EMT標(biāo)志分子蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染組E?cadherin蛋白水平明顯高于其他兩組，N?cad?herin、Vimentin蛋白水平明顯低于其他兩組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表3。

圖2 3組Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（×200）Fig.2 Transwell migration test in three groups

表2 3組細(xì)胞EMT標(biāo)志分子mRNA表達(dá)情況對(duì)比Tab.2 Comparison of expression of EMT marker mRNA in three groups（n=3） ±s

表2 3組細(xì)胞EMT標(biāo)志分子mRNA表達(dá)情況對(duì)比Tab.2 Comparison of expression of EMT marker mRNA in three groups（n=3） ±s

注：與轉(zhuǎn)染組對(duì)比，*P＜0.05

組別轉(zhuǎn)染組空白轉(zhuǎn)染組未轉(zhuǎn)染組F值P值E?cadherin mRNA 5.33±2.31 1.33±0.58*1.00±0.00*9.235 0.015 N?cadherin mRNA 0.25±0.00 0.75±0.43 1.00±0.00*7.000 0.027 Vimentin mRNA 0.42±0.14 0.67±0.29 1.00±0.00*7.400 0.024

表3 3組細(xì)胞EMT標(biāo)志分子蛋白表達(dá)Tab.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups（n=3） ±s

表3 3組細(xì)胞EMT標(biāo)志分子蛋白表達(dá)Tab.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups（n=3） ±s

注：與轉(zhuǎn)染組對(duì)比，*P＜0.05

組別轉(zhuǎn)染組空白轉(zhuǎn)染組未轉(zhuǎn)染組F值P值E?cadherin 蛋白1.25±0.08 0.58±0.07*0.54±0.06*96.101 0.000 N?cadherin 蛋白0.61±0.07 0.94±0.06*1.07±0.10*27.357 0.001 Vimentin蛋白0.47±0.08 0.91±0.14*1.13±0.17*18.514 0.003

圖3 3組細(xì)胞EMT標(biāo)志分子蛋白表達(dá)情況對(duì)比Fig.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups

3 討論

腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌治療失敗和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要原因，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，乳腺癌患者生存率明顯下降［7］。如何降低乳腺癌早期復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，是我們的研究的重要課題。

EMT是影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要因素，在乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，均能夠發(fā)現(xiàn)EMT現(xiàn)象［8-9］。EMT過(guò)程中，細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，極性消失，細(xì)胞骨架重排，細(xì)胞侵襲和遷移能力增加［10］，此過(guò)程常伴隨一系列標(biāo)志分子的變化，包括上皮表型標(biāo)志分子E?cadherin下降，間質(zhì)表型標(biāo)志分子N?cadherin、Vimentin等上升［11］。本研究構(gòu)造穩(wěn)定低表達(dá)PFDN1的轉(zhuǎn)染組，顯示轉(zhuǎn)染組E?cadherin表達(dá)水平明顯高于空白轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組，而N?cadherin、Vimentin表達(dá)水平明顯低于空白轉(zhuǎn)染組及為轉(zhuǎn)染組，提示PFDN1可能與乳腺癌EMT有關(guān)。經(jīng)Transwell細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)，也能夠證實(shí)抑制PFND1表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯下降。

PFDN是一組輔助伴侶蛋白，既往多項(xiàng)報(bào)道證實(shí)該組蛋白與腫瘤進(jìn)展有關(guān)：FAROOQ等［12］指出其在HepG2肝癌細(xì)胞株中，與組蛋白去乙酰化酶1有高親和力，而后者有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用；PFDN4在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞侵襲能力有關(guān)［13］；RIESTER等［14］報(bào)道顯示尿路上皮癌患者PFDN2高表達(dá)多預(yù)示著較差的預(yù)后；本研究前期也觀察到乳腺癌組織中PFDN1表達(dá)明顯強(qiáng)于正常乳腺組織。針對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT的報(bào)道還顯示，PFDN1與肺癌細(xì)胞［7］、結(jié)直腸癌［15］細(xì)胞EMT過(guò)程有關(guān)，本研究則提示PFDN1還與乳腺癌EMT過(guò)程有關(guān)。上述既往報(bào)道推測(cè)PFDN1主要通過(guò)影響細(xì)胞骨架重組，進(jìn)而影響EMT過(guò)程。PFDN1的主要功能是捕獲未折疊多肽，協(xié)助其折疊并將其傳送至CCT，除底物傳送功能外，其還可以提高肌動(dòng)蛋白和微管蛋白折疊的效率，這是因?yàn)镻FDN1還能夠?qū)⒉糠终郫B的底物分子返回至CCT，以實(shí)現(xiàn)下一循環(huán)的折疊，故缺乏PFND1可能導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白和微管蛋白折疊效率下降。而微管是細(xì)胞骨架的主要成分之一，這說(shuō)明PFND1對(duì)細(xì)胞骨架重組效率有一定促進(jìn)作用，細(xì)胞骨架重組又是EMT的關(guān)鍵過(guò)程，因此PFND1可能通過(guò)影響細(xì)胞骨架重組，進(jìn)而影響乳腺癌EMT過(guò)程。

綜上，PFDN1能夠促進(jìn)乳腺癌BT474細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，抑制PFDN1表達(dá)可能有助于抑制乳腺癌EMT過(guò)程。但本研究?jī)H為體外研究，可能并不足以證實(shí)PFDN1對(duì)乳腺癌癌細(xì)胞EMT的影響，仍需后續(xù)研究補(bǔ)充。