郭曉彬 張萬松 肖卓裕 呂嫻媛 王鵬 楊誠 劉存東 周其趙

南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院泌尿外科（廣州 510630）

隨著不孕不育發(fā)病率的升高，生殖健康成為一個全球性的健康難題。調查顯示育齡夫婦中約有10%～15%患有不孕不育，其中接近一半由男性不育導致［1］。男性不育患者中絕大部分由于精子數(shù)量及活力顯著低下引起，即弱精子癥。弱精子癥的病因復雜多樣，發(fā)病機制尚未清楚［2］。既往的研究發(fā)現(xiàn)SEMG1基因（semenogelin I）編碼的蛋白質是男性精液中主要的蛋白質，功能是將射精精子包裹在一種凝膠狀的基質中，在射精后迅速被前列腺特異抗原PSA（prostate?specific antigen)酶解成小的多肽，這種蛋白酶解過程破壞了凝膠狀基質的性質，從而使精液液化，精子也獲得更多的運動能［3-4］。多項研究［5-7］表明SEMG1在弱精子癥患者精子中表達水平明顯升高，在弱精子癥發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。同時研究［4-8］表明SEMG1不僅表達于精囊及精子中，在附睪及睪丸中也有少量表達，但其在睪丸中表達所發(fā)揮的作用尚未清楚，在動物模型中睪丸SEMG1蛋白表達水平與弱精子癥的關系尚未明確。環(huán)磷酰胺（cy?dophosphamide，CP）是一種臨床常見的烷化劑類抗腫瘤藥物，廣泛應用于對各種血液系統(tǒng)疾病和實體腫瘤的治療［9］。研究表明CP能夠破壞生精細胞，導致各級精母細胞脫落，進而造成弱精的表現(xiàn)［10］，因此被廣泛用于弱精子癥動物模型的構建［11］。本研究使用環(huán)磷酰胺腹腔注射法成功構建弱精子癥大鼠動物模型，檢測發(fā)現(xiàn)弱精子癥大鼠睪丸中SEMG1蛋白的表達水平較對照組明顯升高，成功構建了睪丸中高表達SEMG1蛋白的弱精子癥大鼠模型。本研究將為進一步研究SEMG1在睪丸生精過程中的作用奠定了良好的動物模型基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物7～8周齡清潔級健康雄性SD大鼠，由南方醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供［實驗動物許可證號:SYXK（粵）2011-0074］。

1.2 主要儀器及試劑正置顯微鏡（Leica?DME日本），冰凍切片機（德國美康HM550）,電泳儀和電轉儀（Bio?Rad，美國），環(huán)磷酰胺由江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司生產(國藥準字H32020856，0.1 g/支，粉末狀)，購于本院門診藥房.總蛋白提取試劑盒（Beyotime，上海），蛋白濃度測定試劑盒（Beyo?time，上海），SEMG1、GAPDH單克隆抗體（abcam，美國），CASPASE-3、BCL2多克隆抗體（abconal，美國），HRP標記羊抗兔IgG（RayAntibody，北京），PVDF膜（BioTrace，墨西哥）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立、取材健康6～8周齡雄性體重約（340±10）g的SD大鼠30只，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23～25℃，每天自然光光照12 h，過程中大鼠均可自由攝食、飲水，適應性飼養(yǎng)5 d。大鼠被隨機分為空白對照組、陰性對照組和實驗組，每組10只。空白對照組不做任何處理，實驗組按60 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺,陰性對照組按60 mg/kg腹腔注射0.9%生理鹽水，每天1次，持續(xù)5 d。第30天時，頸椎脫臼處死大鼠，稱其質量，摘取大鼠雙側睪丸并稱量質量，睪丸指數(shù)=單側睪丸質量/大鼠質量，剪取附睪尾部置于細胞培養(yǎng)箱內讓精子游離，取精子懸液在光學顯微鏡下分別計數(shù)a級和b級精子數(shù)量，一側大鼠睪丸用10%多聚甲醛固定，另一側大鼠睪丸置于－80℃冰凍備用。

1.3.2 睪丸指數(shù)、精子密度及各級精子活力計數(shù)在6 cm培養(yǎng)皿中加入37℃預熱的生理鹽水1 mL，放入剪碎的附睪尾并將培養(yǎng)皿置入37℃溫箱孵育20 min制成精子懸液，緊接著用生理鹽水將精子懸液稀釋至100倍輕輕混勻，用吸管吸取5 μL懸液，光學顯微鏡下計算精子的密度，并在多個視野下觀察200個精子中a級和b級精子的數(shù)量。根據(jù)WHO標準，a級為快速向前運動的精子，b級為慢或呆滯的向前運動。

1.3.3 睪丸組織HE染色空白對照組，陰性對照組及實驗組睪丸組織置于10%中性甲醛溶液浸泡24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明石蠟包埋，石蠟切片機制備5 μm的連續(xù)切片，分別隨機選取各組睪丸組織石蠟切片3張，常規(guī)HE染色后顯微鏡下觀察睪丸組織生精結構形態(tài)學觀察并拍照。

1.3.4 蛋白質免疫印跡提取睪丸組織蛋白加入上樣緩沖液，沸水煮沸變性10 min，每個上樣孔加入40 μg樣品，10%SDS?PAGE凝膠電泳將蛋白質分離。電泳結束后，濕法轉印至PVDF膜上，轉膜結束后，用5%BSA室溫封閉1 h。相應的抗體按說明書進行稀釋，分別置于4℃過夜。TBS?T洗膜3次，每次10 min，加入二抗兔抗羊抗體室溫下孵育1 h，TBS?T徹底洗膜5次，每次5 min后，Bio?Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖。

1.4 統(tǒng)計學方法使用SPSS 17.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 環(huán)磷酰胺對大鼠質量、睪丸質量、睪丸指數(shù)和精子密度及活力的影響空白對照組，陰性對照組及實驗組之間大鼠質量差異無統(tǒng)計學（P＞0.05）。實驗組睪丸質量以及睪丸指數(shù)明顯低于空白對照組及陰性對照組（P＜0.001）；實驗組的精子數(shù)量及a、b級精子活力明顯低于空白對照組及陰性對照組（P＜0.001）。見表1。

表1 環(huán)磷酰胺對大鼠質量、睪丸質量、睪丸指數(shù)和精子密度及活力的影響Tab.1 Effects of cyclophosphamide on rat quality,testicular mass,testicular index,sperm density and viability±s

表1 環(huán)磷酰胺對大鼠質量、睪丸質量、睪丸指數(shù)和精子密度及活力的影響Tab.1 Effects of cyclophosphamide on rat quality,testicular mass,testicular index,sperm density and viability±s

注：***0.001

分組鼠質量（g）睪丸質量（g）睪丸指數(shù)（%）精子密度（×106/mL）200個精子中a級精子數(shù)200個精子中b級精子數(shù)a+b級精子百分比（%）空白對照組343.70±1.50 1.50±0.01 0.43±0.04 12.13±0.09陰性對照組342.90±1.40 1.51±0.01 0.44±0.04 12.44±0.13實驗組346.50±1.66 1.43±0.02***0.41±0.06***7.51±0.01***38.50±0.7638.70±0.6017.40±0.54***68.00±1.24 0.53±0.01 69.10±0.74 0.54±0.01 43.40±0.62***0.30±0.01***

2.2 環(huán)磷酰胺對大鼠睪丸形態(tài)結構的影響根據(jù)睪丸切片HE染色圖可以看到，空白對照組及陰性對照組睪丸生精小管結構完整，各級生精細胞層次分明，可見大量長形精子細胞（見圖1A、1B）。實驗組中可以看到各級生精細胞排列紊亂、細胞間隙增寬、數(shù)量明顯減少,管腔內精子數(shù)量明顯減少（圖1C）。

2.3 弱精子癥大鼠睪丸中SEMG1及CASPE?3及BCL?2蛋白表達水平變化Western blot結果顯示,與對照組相比，實驗組睪丸中SEMG1及CASPE?3蛋白表達水平升高（P＜0.05），BCL?2蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖2。

圖1 各組睪丸組織HE染色高倍鏡下的形態(tài)結構（×40）Fig.1 Morphological structure of HE stained in testis of each group（×40）

圖2 弱精子癥大鼠睪丸中SEMG1及CASPASE?3及BCL?2蛋白表達水平Fig.2 SEMG1，CASPASE?3 and BCL?2 protein expression levels in the testis of asthenozoospermia rats

3 討論

弱精子癥發(fā)生發(fā)展與多種因素有關，如：泌尿系感染［12］，精索靜脈曲張［13］等，但具體的分子機制尚未清楚。近年來，男性不育的研究取得一定的進展，如WANG等［14］發(fā)現(xiàn)DJ?1和NDUFS3之間的相互作用被破壞以及精子和睪丸DJ?1蛋白的下調可導致弱精子癥的發(fā)生。XU等［15］發(fā)現(xiàn)RNASET2可以通過抑制PKA/PI3K/鈣信號傳導途徑來降低精子活力。在本研究前期研究及多項研究中發(fā)現(xiàn)SEMG1在人弱精子癥患者精子中表達水平比正常精子明顯升高［5-6，16-17］，但尚未有研究報道該基因在弱精子癥鼠模型睪丸中的表達水平。本研究根據(jù)文獻報道［11］，使用環(huán)磷酰胺腹腔注射法構建弱精子癥大鼠模型。雖然實驗結果顯示不同組大鼠的質量無明顯差異，但實驗組睪丸質量及睪丸指數(shù)較對照組下降，該實驗結果與目前文獻報道一致［18］。同時觀察到腹腔注射環(huán)磷酰胺后大鼠精子密度及精子活力明顯降低，睪丸組織HE染色見睪丸生精小管中各級生精細胞排列紊亂，生精細胞數(shù)量減少。此外，腹腔注射環(huán)磷酰胺后大鼠睪丸中CASPASE?3表達水平升高，BCL2表達水平下降。Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase?3為關鍵的執(zhí)行分子；BCL2在哺乳動物細胞中可調節(jié)線粒體外膜通透性，大多數(shù)定位在線粒體外膜上，在受到信號刺激后轉移到線粒體外膜上，可抑制細胞凋亡。本研究結果表明，注射環(huán)磷酰胺后大鼠睪丸中Cas?pase?3表達水平升高，BCL2表達水平下降，這些結果表明大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后睪丸中的生精細胞凋亡增加。高學勇等［19］使用原位缺口末端標記法（TUNEL）檢測腹腔注射環(huán)磷酰胺后生精細胞的凋亡情況也得到了相同的結果，證明本研究弱精子癥大鼠模型構建成功。

Western blot檢測SEMG1蛋白在構建成功后的弱精子癥大鼠睪丸中的表達發(fā)現(xiàn)，SEMG1的表達水平明顯高于對照組（P＜0.001）。既往研究表明，SEMG1是精液中的主要蛋白質，與弱精子癥有密切的的關系，SEMG1基因失能或突變會導致男性不育。研究者利用計算機輔助運動軌跡分析、流式細胞術、共聚焦熒光顯微鏡等研究方法發(fā)現(xiàn)SEMG1降低精子活力是通過修飾精子細胞膜的結構，調節(jié)細胞膜跨膜電位，以時間依賴的方式增加精子細胞膜的滲透性，間接抑制精子的運動［20-22］。睪丸是精子發(fā)生的部位，睪丸內含有不同時期的生精細胞，本研究表明環(huán)磷酰胺腹腔注射后其代謝產物刺激各級生精細胞，使生殖細胞內SEMG1表達水平升高，從而使生殖細胞的細胞膜通透性增加，最終導致生殖細胞的凋亡增加。睪丸中包含各個時期的生殖細胞，腹腔注射環(huán)磷酰胺后睪丸中哪一時期的生殖細胞SEMG1升高或者所有時期的生殖細胞SEMG1蛋白表達均升高尚未清楚，有待進一步的研究。文獻報道［23］環(huán)磷酰胺可引起睪丸DNA損傷，誘導生殖細胞DNA畸形、斷裂或突變，導致精子DNA斷裂，最終導致雄性不育、誘發(fā)腫瘤、甚至子代畸形。本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射環(huán)磷酰胺后大鼠睪丸中凋亡蛋白CASPASE?3升高，抗凋亡蛋白BCL2表達降低，提示睪丸中的生殖細胞凋亡增加。有趣的是腹腔注射環(huán)磷酰胺后睪丸中SEMG1蛋白的表達水平也升高了，本研究首次報道了該蛋白在弱精子癥的大鼠睪丸中高表達。

綜上所述，本研究使用環(huán)磷酰胺腹腔注射法成功構建了睪丸中高表達SEMG1蛋白的弱精子癥鼠模型，為進一步研究SEMG1蛋白在睪丸中的生物學功能及其在弱精子癥中高表達的分子機制奠定了良好的動物模型保證。