馬艷梅 王瀟飛 王文莙 楊媛媛 徐遠(yuǎn)義 黃允寧

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系（銀川 750004）；2寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科（銀川 750001）

隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，胃癌的預(yù)后有了很大的改善，但其仍然是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因之一。腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌死亡的主要原因［1］，腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌患者的5年生存率僅為2%［2］。所以能有效抑制胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移對(duì)提高胃癌的生存率非常重要。

硫酸右旋糖酐（Dextran Sulfate，DS）是一種大分子硫酸右旋糖酐衍生物，本課題組前期的實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用DS可以顯著減少裸鼠胃癌腹膜腔種植轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量及體積［3］，也逐步探索了DS抑制胃癌腹膜轉(zhuǎn)移一些可能的分子機(jī)制［4-5］。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與TGF?β/Smad4信號(hào)通路有著密切的關(guān)系，本研究將探討DS是否通過影響TGF?β/Smad4信號(hào)通路而抑制胃癌的轉(zhuǎn)移，并為DS抑制胃癌的腹膜種植轉(zhuǎn)移提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑胃癌細(xì)胞株（MGC?803），由上海華東師范大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。RPMI?1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清，購自FUMENG GENE公司；胰蛋白酶?EDTA消化液、青鏈霉素購自北京Leagene生物公司。

1.1.2 藥物DS購自Sigma公司，將DS溶于磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），配制濃度為0.3%，用22 μm的過濾器滅菌后，用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.1.3 抗體小鼠抗人單克隆TGF?β抗體，購自abcam公司；兔抗人多克隆Smad4抗體購自protein?tech生物公司；兔抗人多克隆E?cadherin抗體，購自Santa Cruz公司；小鼠抗人單克隆N?cadhenrin抗體，購自cellsignal公司；抗β?tubulin鼠單克隆抗體購自中國北京康為世紀(jì)公司；山羊抗兔、山羊抗小鼠熒光抗體、DAPI、山羊血清購自自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC?803細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于無菌恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中，每兩天更換培養(yǎng)液一次，每3天傳一代，當(dāng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，收集并計(jì)數(shù)，種于60 mm培養(yǎng)皿中，接種數(shù)為2×106/皿，共八個(gè)皿。觀察細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組加入PBS，實(shí)驗(yàn)組加入0.3%DS，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2、8、12、24 h，分別收集各組細(xì)胞備用。

1.2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組加入PBS，實(shí)驗(yàn)組加入0.3%DS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，消化、計(jì)數(shù)后，分別以1 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板中，重復(fù)3孔。繼續(xù)培養(yǎng)2周，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染色15 min。計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的集落形成數(shù)。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時(shí)，用1 000 μL的槍頭比著直尺劃橫線，PBS沖洗3次，拍照。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別加入無血清培養(yǎng)基和0.3%DS，重復(fù)3孔，培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)將預(yù)制小室從-20℃中取出，再水化后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均按5×104/孔接種于上室，下室為含有10%FBS的完全培養(yǎng)基，重復(fù)3孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察，拍照，計(jì)數(shù)。

1.2.5 免疫熒光雙染細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，Triton?100孵育20 min，3%過氧化氫反應(yīng)15 min，山羊血清封閉20 min，孵育不同種屬來源的一抗置于4℃冰箱過夜，設(shè)陰性對(duì)照，熒光二抗孵育置于37℃溫箱、避光60 min，加DAPI，封片。在400倍鏡下隨機(jī)選取的5個(gè)視野，采圖。TGF?β和Smad4主要分布于胞質(zhì)和胞核，TGF?β蛋白用紅色熒光標(biāo)記，Smad4蛋白用綠色熒光標(biāo)記，DAPI發(fā)藍(lán)色熒光用來標(biāo)記細(xì)胞核。應(yīng)用Image?Pro Plus軟件測(cè)定光密度（optical density，OD）值，各組均取5張圖的平均光密度值，應(yīng)用Adobe Pho?toshop CS5合并圖片。

1.2.6 Western blot裂解蛋白，EP管冰上放置5 min，振蕩30 s，重復(fù)5次，然后離心去除細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，換新的EP管分裝蛋白。應(yīng)用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，100℃煮蛋白10 min。配膠、上樣、進(jìn)行SDS?PAGE膠電泳，切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育。用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影、曝光。應(yīng)用Image J軟件測(cè)量各條帶的灰度值，以β?tubulin為內(nèi)參，用四個(gè)時(shí)間點(diǎn)目的蛋白與內(nèi)參蛋白表達(dá)灰度值的比值來表示相對(duì)蛋白量。

1.2.7 RT?PCR檢測(cè)TGF?β、Smad4的mRNA表達(dá)水平用試劑盒分別提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（OMEGA）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物均為上海生工生物公司合成，TGF?β引物，F(xiàn)：5′?AACCCACAACGAAATCTAT?GAC?3′，R：5′?GCTGAGGTATCGCCAGGAAT?3′，擴(kuò)增片段為205 bp。Smad4引物，F(xiàn)：5′?AACTTTCCC?AACATTCCT?3′，R：5′?TGCTGCTGTCCTGGCTGA?3′，擴(kuò)增片段為113 bp。GAPDH引物，F(xiàn)：5′?AGG?TCCACCACTGACACGTT?3′，R：5′?GCCTCAAGAT?CATCAGCAAT?3′，擴(kuò)增片段為310 bp。用Image J進(jìn)行灰度值分析，以目的條帶比內(nèi)參條帶灰度值表示相應(yīng)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組不同時(shí)間TGF?β、Smad4的mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且存在方差齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行各時(shí)間點(diǎn)兩組間比較。結(jié)果P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DS抑制人胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

2.1.1 DS對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1），對(duì)照組克隆形成數(shù)為（257.7±3.528），實(shí)驗(yàn)組克隆形成數(shù)為（142.3±9.025），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明DS可以減弱胃癌細(xì)胞的增殖。

2.1.2 DS對(duì)人胃癌細(xì)胞遷移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），0 h實(shí)驗(yàn)組劃痕距離為（296±3.055），對(duì)照組劃痕距離為（298.3±4.055），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。24 h實(shí)驗(yàn)組劃痕距離為（295.3±2.028），而對(duì)照組劃痕距離為（213.3± 5.044），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。表明DS減弱了胃癌細(xì)胞的遷移能力。

2.1.3 DS對(duì)人胃癌細(xì)胞侵襲的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3），對(duì)照組從上室侵入下室的細(xì)胞數(shù)為（252.7±5.783），實(shí)驗(yàn)組侵襲的細(xì)胞數(shù)為（149.3±5.608），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），證明應(yīng)用DS可以顯著降低胃癌細(xì)胞的侵襲能力。

圖1 DS對(duì)MGC?803細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of DS on proliferation of MGC?803 cells

圖2 DS對(duì)MGC?803細(xì)胞遷移的影響Fig.2 Effect of DS on migration of MGC?803 cells

圖3 DS對(duì)MGC?803細(xì)胞侵襲的影響Fig.3 Effect of DS on invasion of MGC?803 cells

2.2 DS抑制胃癌細(xì)胞TGF?β表達(dá)、促進(jìn)Smad4表達(dá)

2.2.1 DS對(duì)人胃癌細(xì)胞TGF?β、Smad4蛋白表達(dá)的影響熒光顯微鏡下可見，TGF?β蛋白表達(dá)處發(fā)紅色熒光，主要分布于胞質(zhì)和胞核，Smad4蛋白表達(dá)處發(fā)綠色熒光，主要分布于胞質(zhì)和胞核。將圖片合并后可見紅綠光重疊處發(fā)黃色熒光，說明TGF?β與Smad4存在共定位現(xiàn)象（圖4A）。對(duì)照組TGF?β熒光亮度在2、8、12、24 h，呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)（0.054±0.003）、（0.064±0.004）、（0.063 ±0.002）、（0.065± 0.003），應(yīng)用DS后各時(shí)間點(diǎn)熒光亮度比對(duì)照組明顯降低（0.050±0.000 5）、（0.045±0.000 7）、（0.051±0.003）、（0.042±0.001），8、12、24 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P8＜0.005，P12＜0.01，P24＜0.001，圖4B），2 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組 Smad4熒光亮度（0.055±0.005）、（0.048±0.005）、（0.063±0.000 8）、（0.065±0.002）與對(duì)照組（0.036±0.003）、（0.025±0.004）、（0.034±0.001）、（0.045± 0.002）相比呈逐步升高，2、8、12、24 h差異均 有統(tǒng) 計(jì)學(xué) 意義（P2＜0.01，P8＜0.005，P12＜0.001，P24＜0.005，圖4C）。

圖4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組2、8、12、24 h胃癌細(xì)胞TGF?β和Smad4的表達(dá)Fig.4 The expressions of TGF?β and Smad4 in gastric cancer cells were detected by immunofluorescence assay in the control group and the experimental group at 2，8，12 and 24 hours（× 400）

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5A。對(duì)照組TGF?β蛋白2、8、12、24 h高表達(dá)（0.55± 0.01）、（0.63±0.04）、（0.69±0.04）、（0.74±0.03），應(yīng)用DS后表達(dá)均降低（0.51±0.02）、（0.50±0.01）、（0.37±0.04）、（0.26±0.02），4個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜0.05，P8＜0.005、P12＜0.001，P24＜0.001，圖5B）。對(duì)照組Smad4蛋白2、8、12、24 h表達(dá)量明顯減少（0.70±0.01）、（0.53±0.03）、（1.03±0.05）、（0.44±0.03），而應(yīng)用DS后實(shí)驗(yàn)組Smad4蛋白表達(dá)逐漸增高（0.88±0.07）、（1.16±0.02）、（1.31±0.08）、（0.72±0.10），各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P2＜0.05、P8＜0.001，P12＜0.01，P24＜0.05圖5C）。表明DS可以抑制胃癌細(xì)胞TGF?β蛋白表達(dá)、促進(jìn)Smad4蛋白表達(dá)。

圖5 Western blot分別檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組2、8、12、24 h TGF?β和Smad4的表達(dá)Fig.5 Western blot was used to detect the expression of TGF?β and Smad4 in the control group and the experimental group at 2，8，12 and 24 hours

2.2.2 DS對(duì)人胃癌細(xì)胞TGF?β、Smad4mRNA表達(dá)的影響RT?PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6A。應(yīng)用DS后檢測(cè)TGF?β、Smad4的mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組TGF?β低表達(dá)（0.23±0.01）、（0.46±0.11）、（0.20 ±0.001）、（0.49±0.003）與對(duì)照組（0.25±0.01）、（1.03± 0.01）、（0.51±0.02）、（0.86±0.01）相比2、8、12、24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均減少，8、12、24 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P8＜0.05，P12＜0.005，P24＜0.001，圖6B），2 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組Smad4在2、8、12、24 h表達(dá)量均明顯減少（0.60±0.02）、（0.80±0.02）、（0.56±0.03）、（0.51±0.03），而應(yīng)用DS后2、8、12、24 h，實(shí)驗(yàn)組Smad4表達(dá)逐漸增高（0.91±0.02）、（1.05±0.02）、（0.67±0.02）、（1.21±0.01），四個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜0.001，P8＜0.001，P12＜0.05，P24＜0.001，圖6C）。表明 DS 可以抑制人胃癌細(xì)胞TGF?β mRNA表達(dá)、促進(jìn)Smad4 mRNA表達(dá)。

2.3 DS對(duì)人胃癌細(xì)胞EMT的影響Western blot結(jié)果見圖7A。對(duì)照組2、8、12、24 h胃癌細(xì)胞中E?cadherin低表達(dá)，（1.32±0.04）、（1.25±0.02）、（1.28± 0.05）、（1.24±0.03），應(yīng)用DS后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)E?cadherin表達(dá)增高，（1.91±0.04）、（1.96±0.01）、（1.79± 0.07）、（2.15± 0.04），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜0.001，P8＜0.001，P12＜0.001，P24＜0.001，圖7A）。對(duì)照組N?cadherin在胃癌細(xì)胞中2、8、12、24 h均高表達(dá)（1.20±0.14）、（1.09±0.08）、（1.23±0.16）、（1.37±0.11），應(yīng)用DS后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)N?cad?herin表達(dá)降低，（0.58±0.09）、（0.72±0.05）、（0.49 ±0.03）、（0.41±0.04），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜0.001，P8＜0.005，P12＜0.005，P24＜0.001，圖7B）。

3 討論

胃癌是我國癌癥死亡的第二大原因，約占所有癌癥死亡人數(shù)的17.6%［6］，盡管隨著診療技術(shù)的提高，其病死率在全球范圍內(nèi)有所下降，但患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后仍然較差。腹膜轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良的重要臨床指征，在轉(zhuǎn)移性胃癌中，超過55%～60%的患者存在腹膜腔轉(zhuǎn)移［7］。腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌患者不能進(jìn)行根治性手術(shù)，而由于靜脈化療藥物分布不充分，腹膜屏障阻滯及腫瘤化療耐藥，化療效果有限［8］。因此，迫切需要開發(fā)預(yù)防及治療胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移藥物，以改善胃癌患者的預(yù)后，而DS正是具有這種潛力的藥物。

圖6 RT?PCR檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組2、8、12、24 h 胃癌細(xì)胞TGF?β和Smad4的表達(dá)Fig.6 RT?PCR was used to detect the expression of TGF?β and Smad4 in gastric cancer cells of control group and experimental group at 2，8，12 and 24 hours

圖7 Western blot檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組2、8、12、24 h 胃癌細(xì)胞N?cadherin和E?cadherin的表達(dá)Fig.7 Western blot analysis of N?cadherin and E?cadherin expression in gastric cancer cells of control group and experimental group at 2，8，12 and 24 hours

本組的細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Tran?swell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲顯著被抑制，證明了DS可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

TGF?β/Smad4信號(hào)通路控制著細(xì)胞膜至細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［9］。

TGF?β1可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的浸潤能力，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［10］。胰腺導(dǎo)管腺癌衍生的細(xì)胞表現(xiàn)出特別高的TGF?β1表達(dá)，癌癥晚期階段，TGF?β在腫瘤組織中積聚，最終導(dǎo)致EMT、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移形成［11］。研究［12］表明，胃癌患者血清和癌組織中TGF?β1高表達(dá)并與淋巴結(jié)受累和不良預(yù)后相關(guān)。本研究通過細(xì)胞免疫熒光雙染、Western blot、RT?PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中TGF?β的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞中TGF?β在蛋白水平和mRNA水平均呈現(xiàn)高表達(dá)，而應(yīng)用DS后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TGF?β的表達(dá)明顯降低，且隨著作用時(shí)間的延長這種抑制作用更為顯著，表明DS可能通過抑制TGF?β的表達(dá)，來抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Smad4作為Smads蛋白家族的重要成員，是TGF?β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵組件。研究表明，Smad4缺失使得非小細(xì)胞肺癌小鼠模型腫瘤體積的增大和惡性程度增高，還可引發(fā)自發(fā)性肺腫瘤形成并促進(jìn)其的生長［13］。ZHENG 等［14］的研究表明，胃癌中Smad4呈低表達(dá)，且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Smad4可以抑制胃癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，說明Smad4在胃癌發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌功能。本研究通過細(xì)胞免疫熒光雙染、western blot、RT?PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)胃癌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)Smad4的表達(dá)，結(jié)果顯示，對(duì)照組Smad4在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈低表達(dá)，表明在胃癌細(xì)胞中Smad4可能是一種抑癌基因，這與ZHENG等［14］研究結(jié)果一致。而應(yīng)用DS后，Smad4表達(dá)顯著增高，表明DS通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞Smad4的表達(dá)，而發(fā)揮抑癌作用。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transi?tion，EMT）與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在此過程中上皮細(xì)胞的極性喪失，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)接觸減少，遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)上皮表型丟失而逐漸獲得間質(zhì)表型［15］。發(fā)生 EMT 的標(biāo)志是 E?cad?herin表達(dá)降低，伴隨著N?cadherin或Vimentin表達(dá)的增加［16］。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測(cè)了上皮標(biāo)志物 E?cadherin和間充質(zhì)標(biāo)志物 N?cadherin，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)E?cadherin低表達(dá)而N?cadherin均為高表達(dá)，而應(yīng)用DS后不同時(shí)間點(diǎn)E?cadherin表達(dá)增高，N?cadherin表達(dá)降低，證明DS可以抑制胃癌細(xì)胞的EMT。

綜上所述，DS可以顯著抑制人胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其可能的分子機(jī)制是DS通過影響人胃癌細(xì)胞TGF?β/Smad4信號(hào)通路，從而抑制胃癌細(xì)胞的EMT，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。