苜蓿DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種SSR分子標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建

閔學(xué)陽(yáng)，劉文獻(xiàn)，張正社，等

摘要：目的：植物特異性、一致性和穩(wěn)定性（distinctness，uniformity and stability，DUS）測(cè)試是植物新品種保護(hù)、授權(quán)以及品種真實(shí)性判斷的重要技術(shù)基礎(chǔ)，但由于其周期長(zhǎng)、易受環(huán)境影響以及穩(wěn)定性差等因素，阻礙了新品種授權(quán)的效率。本文利用自主開發(fā)的SSR分子標(biāo)記分析了33個(gè)苜蓿DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種的遺傳多樣性，并進(jìn)行了 DNA指紋圖譜構(gòu)建，以探索用于苜蓿品種快速鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的分子技術(shù)手段。方法：利用表型差異較大的苜蓿品種對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，最終篩選出主帶明顯、多態(tài)性豐富和穩(wěn)定性好的10對(duì)SSR核心引物，并對(duì)33個(gè)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照擴(kuò)增條帶的分子量從大到小編號(hào)讀取，相同遷移位置有帶的記為1，無(wú)帶的記的為0，建立“0，1”矩陣。根據(jù)“0，1”矩陣統(tǒng)計(jì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的總條帶數(shù)（total bands，TB）、多態(tài)性條帶數(shù)（polymorphic bands，PB）、多態(tài)性條帶比率（percentage of polymorphic bands，PPB）、預(yù)計(jì)雜合度（expected heterozygosity，He）和多態(tài)信息量（polymorphic information content，PIC）。利用10對(duì)SSR核心引物對(duì)33個(gè)苜蓿DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析，并為每份標(biāo)準(zhǔn)品種建立唯一標(biāo)識(shí)的指紋代碼。結(jié)果：利用篩選出的 10對(duì)SSR核心引物對(duì)33個(gè)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)：（1）每對(duì)引物多態(tài)性條帶數(shù)量（PB）從1（MtTFSSR-20和 MTRmiR078）到 9（MtTFSSR-10）不等，平均值為 4.2；10對(duì) SSR引物的多態(tài)性比率（PPB）從25%（Mt-TFSSR-20）到90%（MtTFSSR-10）不等，平均值為 56.7%；多態(tài)信息含量（PIC）范圍為 0.56（MTRmiR078）到 0.87（MtTFSSR-19，Ms50），平均值為 0.75；每個(gè)標(biāo)記預(yù)計(jì)雜合度（He）為 0.64（MTRmiR078）到0.88（MtTFSSR-19，Ms50），表明本研究中的33個(gè)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)品種具有豐富的遺傳多樣性。其中，MtTFSSR-10、MtTFSSR-19和Ms-50引物在苜蓿品種遺傳多樣性分析及品種鑒定中具有較大的潛力。（2）不同引物鑒別苜蓿品種的能力不同，其范圍在1～7個(gè)品種之間。利用不同引物組合可以大大提高對(duì)不同品種的鑒別能力。例如，MtTFSSR-10和 MtTFSSR-19可以分別鑒定7個(gè)和3個(gè)品種，當(dāng)以上兩對(duì)引物分別與引物MtTFSSR-19和MtTFSSR-41組合后，鑒別品種的數(shù)量可增加至16個(gè)和12個(gè)。采用以上10對(duì)SSR引物對(duì)33個(gè)品種進(jìn)行分析，14個(gè)品種具有特征譜帶，僅用1個(gè)特征引物即可將該品種與其他品種區(qū)分開，因此在對(duì)品種鑒定時(shí)可優(yōu)先采用相應(yīng)特征引物進(jìn)行快速鑒定。（3）將10對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果組合在一起，可得到由“0”和“1”組成的數(shù)字圖譜。構(gòu)建的 33條圖譜形成了能夠唯一標(biāo)識(shí)單個(gè)品種的特異圖譜，可作為不同品種的分子身份號(hào)碼。（4）根據(jù) 10對(duì)核心引物在 33個(gè)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)品種的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)不同引物間的相關(guān)性進(jìn)行分析。其中，MTRmiR079與 MtTFSSR-20之間相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.94；而Ms-50與MtTFSSR-20之間相關(guān)性最小，為-0.09，其擴(kuò)增的帶型差異最大。根據(jù)引物間擴(kuò)增結(jié)果的相關(guān)性高低，可進(jìn)一步輔助篩選用于苜蓿品種鑒定的優(yōu)化引物組合。同時(shí)，利用 10對(duì)引物在不同品種中擴(kuò)增產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的分子量大小對(duì)每個(gè)品種的 DNA指紋圖譜進(jìn)行作圖，從而可以更直觀的比較不同品種間的差異。結(jié)論：本研究利用 10對(duì)篩選的SSR核心引物構(gòu)建了 33個(gè)苜蓿 DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA指紋圖譜，可在分子水平輔助鑒別不同苜蓿品種，解析苜蓿品種的遺傳多樣性。通過(guò)分析不同引物間擴(kuò)增結(jié)果的相關(guān)性，以及引物的特征譜帶，可進(jìn)一步輔助篩選用于苜蓿品種鑒定的引物組合和對(duì)特定品種的鑒定。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量的大小對(duì)每個(gè)品種的 DNA指紋圖譜進(jìn)行作圖，可直觀的對(duì)不同品種間的差異進(jìn)行比較，有助于苜蓿品種的快速和準(zhǔn)確鑒定。

來(lái)源出版物：草業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 26(11)： 47-56

入選年份：2017

土壤水分和施氮水平對(duì)紫花苜蓿苗期生長(zhǎng)的互作效應(yīng)分析

王茜，紀(jì)樹仁，沈益新

摘要：目的：土壤水分和施氮水平是影響作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素。雖然在干旱半干旱地區(qū)有關(guān)水分和施氮對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)及產(chǎn)量影響的研究已有很多報(bào)道，但土壤水分和氮素對(duì)其生長(zhǎng)的互作效應(yīng)尚不明確。近年來(lái)，我國(guó)南方農(nóng)區(qū)種植紫花苜蓿逐年增多，為明確長(zhǎng)江中下游農(nóng)區(qū)土壤水分與施肥對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的相互影響，本研究通過(guò)半控制盆栽試驗(yàn)測(cè)定分析了不同土壤水分條件下施肥對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)效應(yīng)。方法：試驗(yàn)采用兩因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置W1、W2和W33個(gè)土壤水分水平（分別為田間最大持水量的50%、70%和90%），N0、N1、N2和N34個(gè)施氮水平（分別追肥純氮0、90、180和270 kg/hm2）。采用稱重法控制土壤水分。測(cè)定的生長(zhǎng)性狀包括：株高，一次分枝數(shù)，葉面積，地上部干重；光合生理參數(shù)包括：葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）等；并同時(shí)測(cè)定葉片N含量。以葉片凈光合速率與氮含量的比值計(jì)算光合氮素利用率（PNUE），即：PNUE＝Pn/N；以葉片凈光合速率和蒸騰速率的比值計(jì)算水分利用率（WUE），即WUE＝Pn/Tr。結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果顯示，施氮量一定時(shí)，適當(dāng)提高土壤水分含量可以促進(jìn)紫花苜蓿苗期地上部生長(zhǎng)；但是，在不同土壤水分水平下，地上部生長(zhǎng)對(duì)施氮量的響應(yīng)有顯著差異。在W1水平下，N1的各生長(zhǎng)指標(biāo)高于其他施氮水平。在W2水平下，N1的各生長(zhǎng)指標(biāo)達(dá)到所有施氮水平的最大值。而在W3水平下，N2的各生長(zhǎng)指標(biāo)達(dá)到所有施氮水平的最大值。以不同土壤水分水平下地上部干重（y）和施氮量（x）建立3次回歸模型y＝ax3+bx2+cx+d模擬各土壤水分水平下獲得最高地上部干重所需的施氮量發(fā)現(xiàn)，施氮效應(yīng)隨土壤含水量提高而提高；地上部干重最大值對(duì)應(yīng)的施氮量隨土壤含水率提高逐漸增大。表明，隨著土壤水分含量提高，氮肥效應(yīng)增大，適宜的施氮量也可提高。水分利用率的結(jié)果顯示，少量施氮可促進(jìn) WUE的提高；施氮水平一定時(shí)，W2水平的WUE高于W1、W3水平。表明田間最大持水量70%左右是紫花苜蓿最適宜生長(zhǎng)的土壤含水量，在土壤水分水平偏高或偏低時(shí)，適量施氮可以提高 WUE。在施氮水平一定時(shí)，W3水平的PNUE均顯著高于W1水平。說(shuō)明適當(dāng)提高土壤水分含量可以促進(jìn)氮素的高效利用。多元線性回歸分析結(jié)果表明，土壤水分和施氮水平對(duì)地上部干重、WUE和PNUE呈正向互作效應(yīng)，但決定紫花苜蓿地上部干重、WUE和PNUE的主要因子為土壤水分水平。結(jié)論：在土壤含水量和施氮量2個(gè)因素中，決定紫花苜蓿地上部干物質(zhì)積累的主要因子為土壤含水量。同時(shí)，土壤水分和施氮水平對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)及地上部干物質(zhì)積累有顯著的互作效應(yīng)。紫花苜蓿的施氮效應(yīng)和氮素利用效率因土壤含水量升高而顯著增大；適宜施氮量也因土壤含水量升高而增大。適宜紫花苜蓿生長(zhǎng)的土壤含水量為田間最大持水量的70%左右，在土壤含水量較高的長(zhǎng)江中下游農(nóng)區(qū)，適當(dāng)追施氮肥有利于紫花苜蓿高產(chǎn)。

來(lái)源出版物：草業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 26(12)： 48-55

入選年份：2017