俞艷萍, 費(fèi)志強(qiáng), 陸璐

1深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院、深圳市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科(廣東深圳 518035); 2香港大學(xué)深圳醫(yī)院骨科(廣東深圳 518000)

鼻咽癌與其他頭頸部惡性腫瘤不同，其發(fā)病與EB病毒相關(guān)且病理類型以低分化或未分化類型為主，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移而影響治療效果[1-2]。鼻咽癌治療以放射治療(放療)為主，近年來同步放化療綜合治療在鼻咽癌中的應(yīng)用亦較多，但療效不一，有待進(jìn)一步改善[3]。對(duì)鼻咽癌患者放化療敏感性的早期評(píng)估有助于臨床選取合理方法對(duì)鼻咽癌進(jìn)行治療，并改善其療效。鼻咽癌的發(fā)生涉及多個(gè)基因的調(diào)節(jié)，真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eIF4E)已被多個(gè)研究證實(shí)與鼻咽癌密切相關(guān)[4-5]。然而目前eIF4E表達(dá)與鼻咽癌放化療療效的關(guān)系研究仍較少。因此， 本研究檢測(cè)了晚期鼻咽癌患者鼻咽癌組織eIF4E蛋白和mRNA表達(dá)情況，并分析了其與放化療敏感性的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 取2007年1月1日至2008年12月30日于我院進(jìn)行活檢的30例晚期鼻咽癌患者鼻咽癌組織標(biāo)本為癌癥組。納入標(biāo)準(zhǔn)：鼻咽癌組織標(biāo)本來源患者均經(jīng)病理檢查確診，鼻咽癌患者組織取樣前未經(jīng)任何抗癌治療，性別不限，年齡≥18歲，TNM分期為Ⅲ期或Ⅳ期。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并其他呼吸系統(tǒng)疾病、肝腎功能損傷、治療前經(jīng)抗癌治療患者等?；颊呔霞{入標(biāo)準(zhǔn)，且無患者排除。并以同期30例活檢鼻咽黏膜慢性炎癥組織為對(duì)照組，對(duì)照組患者亦均無其他明顯內(nèi)外科疾病。研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，且兩組患者均已簽署知情同意書。兩組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙率等基線資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2 治療方法 癌癥組患者均常規(guī)行放化療綜合治療，患者均根據(jù)具體臨床分期和耐受狀況進(jìn)行2～3周期的新輔助化療，方案為順鉑100 mg/m3,d1～d3和紫杉醇135 mg/m3，d1靜脈滴注化療。此外癌癥組患者亦均接受放療，GTV-T 和GTV-N的PTVs劑量在66～70.95 Gy/31～33F，CTV-1高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)(GTV外擴(kuò)5～10 mm范圍，包括鼻咽腔黏膜及黏膜下5 mm范圍)PTV為60～66 Gy/30～33F，CTV-2腫瘤侵犯區(qū)域PTV為54～55 Gy/30～33F。

1.3 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.3.1 組織eIF4E蛋白表達(dá)情況檢測(cè) 采用免疫組化法染色檢測(cè)鼻咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎癥組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。將獲得的標(biāo)本均分成兩等份，取其中一份通過甲醛溶液固定并行石蠟包埋，

項(xiàng)目例數(shù)性別(例)男女年齡(歲)體質(zhì)指數(shù)(kg/m2)吸煙率[例(%)]癌癥組30181247.22±13.8821.18±4.2622(73.33)對(duì)照組30201046.35±15.6920.98±3.8520(66.67)2/t值0.2870.2280.1910.318P值>0.05>0.05>0.05>0.05

將石蠟標(biāo)本切制成厚度為4 μm連續(xù)切片后在二甲苯中浸泡10 min脫蠟，在100%、95%、90%、80%和70%濃度酒精中依次脫水去除二甲苯。3%過氧化氫溶液浸泡30 min后常規(guī)進(jìn)行抗原熱修復(fù)，滴加氧化酶阻斷劑孵育10 min后滴加相應(yīng)一抗，37℃保溫30 min后在4℃冰箱中放置過夜。第2天取出后去除一抗，滴加相應(yīng)二抗，37℃保溫30 min后去除二抗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗生物素抗體37℃保溫30 min后去除三抗，行蘇木精染色后返藍(lán)脫水，向標(biāo)本滴加樹脂并加蓋玻片封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察照片，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為染色陽(yáng)性，以陽(yáng)性細(xì)胞<50%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞>50%為陽(yáng)性，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3.2 組織eIF4E mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)鼻咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎癥組織eIF4E mRNA 相對(duì)表達(dá)量，取相應(yīng)標(biāo)本，常規(guī)提取總RNA，根據(jù)日本TOYOBO公司操作指導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，引物序列見表2，常規(guī)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行32個(gè)循環(huán)的95℃變性3 min, 72℃退火30 s，32個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min，用三蒸水代替cDNA模版作為陰性對(duì)照，以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果分析，其中mRNA含量=2-ΔΔCT,ΔΔCT=CT目的基因-CTGAPDH。

表2 引物序列

1.3.3 療效評(píng)價(jià) 放化療完成后由主治醫(yī)師根據(jù)放化療敏感性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分析癌癥組患者放化療敏感性。

1.4 評(píng)價(jià)方法 放化療敏感性評(píng)價(jià)[6]：根據(jù)鼻咽和頸部淋巴結(jié)病灶的垂直直徑變化進(jìn)行放化療敏感性評(píng)估，其中病灶完全消失為完全緩解(CR)，腫瘤最大垂直直徑較治療前減少50%以上為部分緩解(PR)，腫瘤最大垂直直徑較治療前增加25%以上或出現(xiàn)新病灶為疾病進(jìn)展(PD)，介于PR和PD之間為疾病穩(wěn)定(SD)，其中CR和PR歸入化療高反應(yīng)，SD和PD歸入化療低反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)或校正2檢驗(yàn)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布并采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用Spearman相關(guān)分析法分析鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量與放化療敏感性的關(guān)系，并采用診斷試驗(yàn)四格表和受試者操作特性曲線(ROC)分析鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)其放化療敏感性的價(jià)值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組鼻咽黏膜慢性炎癥組織比較，癌癥組鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1～2。

2.2 癌癥組放化療敏感性分析 癌癥組化療效果為CR、PR、SD和PD的患者分別為5例、17例、6例和2例，放化療高反應(yīng)和低反應(yīng)患者分別22例和8例。

2.3 癌癥組放化療高反應(yīng)和低反應(yīng)患者的鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 與癌癥組放化療高反應(yīng)患者比較，放化療低反應(yīng)患者鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量均較高(P<0.05)。見表4。

表3 兩組eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

圖1鼻咽癌組織eIF4E蛋白表達(dá)(SP，×400)

圖2 鼻咽黏膜慢性炎癥組織eIF4E蛋白表達(dá)(SP，×400)

放化療敏感性例數(shù)蛋白陽(yáng)性表達(dá)[例(%)]mRNA 相對(duì)表達(dá)量[(x±s)]高反應(yīng)2212(54.55)0.891±0.062低反應(yīng)88(100.00)0.968±0.0752/ t值2校正=5.455t校正=2.848P值<0.05<0.05

2.4 晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量與放化療敏感性的關(guān)系分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量與其放化療敏感性均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.887、-0.895，P<0.05)。

2.5 晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)其放化療敏感性的價(jià)值分析 晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)其放化療敏感性的準(zhǔn)確性均較高。見表5、6和圖3。

3 討論

近年來隨著居住環(huán)境的變化以及生活方式的改變，各類呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生率不斷增加。鼻咽癌是常見呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)南方城市的發(fā)病率較高[7-8]。

表5 晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率預(yù)測(cè)放化療敏感性的價(jià)值 %

表6 晚期鼻咽癌組織eIF4E mRNA 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)放化療敏感性的價(jià)值 %

圖3晚期鼻咽癌組織mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)其放化療敏感性價(jià)值的ROC曲線

由于鼻咽癌的發(fā)病位置隱蔽，且早期癥狀復(fù)雜而無特異性，鼻咽癌早期診斷率不高，多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期惡性腫瘤[9]。鼻咽癌的治療以放療為主，其對(duì)藥物治療不敏感，多數(shù)為改善全身癥狀和減輕放療不良反應(yīng)，而近年來新輔助化療聯(lián)合放療在臨床中的應(yīng)用較多且可取得一定的效果[10-11]。但臨床仍可見部分晚期鼻咽癌患者放化療效果欠佳，甚至出現(xiàn)死亡等不良預(yù)后情況。本研究亦關(guān)注了晚期鼻咽癌患者放化療敏感性，本研究結(jié)果顯示，晚期鼻咽癌放化療患者中有8例患者為低反應(yīng)，療效不佳，而在放化療高反應(yīng)患者中亦多數(shù)為PR，CR者甚少，晚期鼻咽癌患者放化療敏感性較差，因此改善晚期鼻咽癌患者放化療效果仍是目前急需解決的問題。

通過相關(guān)基因檢測(cè)評(píng)估惡性腫瘤治療效果和作為惡性腫瘤治療依據(jù)為目前熱門研究課題。鼻咽癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展均涉及多個(gè)抑癌基因的失活和致癌基因的激活，其中eIF4E為促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展的重要基因[12]。eIF4E為24 kD多肽，在蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮限速蛋白的作用，在人類多種惡性腫瘤中均可見eIF4E過表達(dá)現(xiàn)象，而eIF4E過表達(dá)可導(dǎo)致各編碼癌蛋白和促癌因子mRNA翻譯表達(dá)的明顯增強(qiáng)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。國(guó)內(nèi)外均已有多個(gè)研究證實(shí)了eIF4E在鼻咽癌中的促進(jìn)作用[13-15]。本研究亦檢測(cè)了晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，相對(duì)于鼻咽黏膜慢性炎癥組織，晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)了明顯的升高，進(jìn)一步證實(shí)了eIF4E在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。

然而目前關(guān)于eIF4E在鼻咽癌療效評(píng)估中的應(yīng)用研究較少。本研究比較了癌癥組放化療高反應(yīng)和低反應(yīng)患者的鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，與晚期鼻咽癌放化療高反應(yīng)患者比較，放化療低反應(yīng)患者鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量均較高，提示晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量與其放化療敏感性可能相關(guān)。進(jìn)一步的Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量與其放化療敏感性均呈負(fù)相關(guān)，而診斷試驗(yàn)四格表和ROC曲線進(jìn)一步分析證實(shí)晚期鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)其放化療敏感性的準(zhǔn)確性分別為60.00%和76.67%，對(duì)于eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)和mRNA 相對(duì)表達(dá)量較高，尤其是高于0.816的晚期鼻咽癌患者需警惕放化療效果不良，及時(shí)調(diào)整放化療方案以改善療效，減少鼻咽癌相關(guān)死亡等不良預(yù)后的發(fā)生。

綜上所述，晚期鼻咽癌組織eIF4E基因表達(dá)水平較高且其高表達(dá)水平可能預(yù)示放化療敏感性較差，需及時(shí)調(diào)整治療方案以盡可能提高晚期鼻咽癌療效，改善預(yù)后。然而本研究的樣本量偏小，鼻咽癌組織eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)可能受到患者合并疾病、取樣和檢測(cè)操作等多方面因素的影響，明確晚期鼻咽癌組織eIF4E基因表達(dá)情況與其放化療敏感性的關(guān)系尚需進(jìn)一步大樣本量全面研究。