彭峰， 彭奕華， 張宏華， 楊印樓

粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科(廣東韶關(guān) 512026)

非小細胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌常見的一種病變腫瘤，由于近年來環(huán)境的變化和人們自身的不良行為、如抽煙飲酒等導致其發(fā)病率日益上升，且病死率已躍居惡性腫瘤之首，其發(fā)病機制尚不明確且臨床無明顯癥狀，易出現(xiàn)誤診而使病情進入中晚期，嚴重影響患者的正常生活[1-2]，故如何正確地診治NSCLC患者并做出正確治療指導具有重要意義。有研究顯示，NSCLC的發(fā)病機制與其癌細胞的凋亡生長密切相關(guān)，而半胱氨酸蛋白酶4(Caspase-4)mRNA是促進腫瘤凋亡的主要因子，能夠?qū)毎牡蛲鲞M行調(diào)控。但有關(guān)Caspase-4與NSCLC的關(guān)系還有待進一步深入研究[3-4]。對此，本研究通過給予NSCLC患者檢測其Caspase-4表達，探討其在NSCLC的診治和預后評估中的應用，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月至2017年6月本院病理科NSCLC組織及其癌旁正常組織各100例。納入標準：(1)經(jīng)病理檢查確診為NSCLC；(2)所有患者均未接受任何抗癌治療；(3)患者及家屬簽署知情同意書；(4)無溝通障礙和精神病。排除標準：(1)心、肝、腎、腎上腺等重要器官嚴重性疾病；(2)妊娠及哺乳特殊人群；(3)入院前1個月內(nèi)有免疫、激素、抗生素等治療史；(4)拒絕或終止本次研究者。其中男53例，女47例，年齡23～80歲，平均(52.64±14.64)歲。癌癥TNM分期：Ⅱ期33例，Ⅲ期40例，Ⅳ期27例。癌癥類型：鱗癌37例，腺癌63例。本次研究已經(jīng)我院倫理委員會審批且通過，所有數(shù)據(jù)來源真實可靠。

1.2 方法 所有患者經(jīng)臨床確診為NSCLC并且均未進行放療、化療，利用常規(guī)手術(shù)切除NSCLC組織及其癌旁正常組織作為新鮮標本，采用免疫組化SP法檢測Caspase-4在組織中的mRNA陽性表達，所有標本經(jīng)10%甲醛固定和石蠟，包埋后，連續(xù)切片進行脫蠟，切片厚度均為4 μm，同時給予3%H2O2孵育滅活內(nèi)源性過氧化物酶、封閉非特異性抗原位點等預處理，加入實驗鼠抗人Caspase-4作為一抗，4℃孵育過夜，漂洗、復溫37℃，加生物素標記二抗工作液37℃孵育30 min，PBS緩沖液漂洗、DAB顯色后用蘇木素復染3 min，進行脫水待切片透明后用中性樹膠封固，高倍顯微鏡下鏡檢，PBS替代一抗作陰性對照。

1.3 指標觀察和標準 著色強度高于背景非特異性染色者為陽性。隨機選取瘤細胞分布密集區(qū)域的10個高倍鏡視野進行計數(shù)，根據(jù)SP法染色以細胞質(zhì)和細胞核中出現(xiàn)變異性染色的深淺進行評分，陽性強度以無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。根據(jù)組織染色細胞所占總細胞數(shù)百分比評分：陽性細胞數(shù)<5%為陰性(0分)，5%～25%(1分)，26%～50%(2分)，51%～75%(3分)，>75%(4分)。兩者評分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)；方便試驗操作和分析，用(-)代表陰性，(+)、(++)、(+++)代表陽性[5-6]。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以(%)表示，采用2檢驗，Z檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織Caspase-4的陽性表達比較 NSCLC組織Caspase-4陽性表達[83%(83/100)]明顯高于癌旁正常組織[0%(0/100)]，差異有統(tǒng)計學意義(2=135.36，P<0.001)。見圖1。

圖1 NSCLC組織Caspase-4陽性表達(DAB+酶底物染色，×400)

2.2 Caspase-4 陽性表達與NSCLC病理情況的關(guān)系 Caspase-4 陽性表達與組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；Caspase-4 陽性表達與性別、年齡、臨床分期無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 Caspase-4 陽性表達與NSCLC病理情況的關(guān)系例(%)

2.3 Caspase-4不同表達的患者生存預后比較 Caspase-4 表達陽性患者1年無進展生存率為60.00%(60/100)，明顯低于Caspase-4 表達陰性患者的86.00%(86/100)，差異有統(tǒng)計學意義(2=8.621，P<0.05)。見圖2。

3 討論

NSCLC是臨床上常見的一種惡性肺癌，其癌細胞生長分裂較慢，擴散轉(zhuǎn)移相對較晚，加之該病情無明顯表現(xiàn)，故多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，隨著近年來環(huán)境的變化和不良習慣導致NSCLC發(fā)病率逐漸上升，嚴重影響患者的健康生活和生命安全，故如何對NSCLC患者進行正確的診治及預后的分析具有重要的臨床意義[7-8]。

有研究顯示，NSCLC的發(fā)病機制與其腫瘤細胞的生存及凋亡有關(guān)，腫瘤細胞得以生存，患者的病情愈發(fā)嚴重[9-11]。而Caspase家族未活化時以酶原形式存在，成為活性酶時就是將其原結(jié)構(gòu)域切除，在死亡受體誘導的細胞凋亡中發(fā)揮主要作用，同時也是細胞凋亡的控制中心，其中Caspase-3活化是導致細胞凋亡的中心樞紐[12-14]。但隨著近年來醫(yī)學研究及技術(shù)的提高，Caspase-4作為一種突變蛋白已成為NSCLC的研究熱點，其機制可能通過抑制Fas介導的Caspase-3活化，從而導致細胞凋亡的抑制而發(fā)生癌變，但Caspase-4與NSCLC的因素分析還有待深入研究[15-16]。

對此，本研究通過免疫組織化學法檢測Caspase-4在組織中的mRNA陽性表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC組織Caspase-4 mRNA陽性表達明顯高于癌旁正常組織，而Kim等[17]、李舒等[18]的研究中也提示NSCLC的發(fā)展與Caspase-4表達有關(guān)，進一步提示NSCLC的發(fā)生、發(fā)展與Caspase-4表達密切相關(guān)。這可能由于Caspase-4參與肺細胞凋亡過程的調(diào)節(jié)，隨著NSCLC病情的發(fā)展，癌細胞會破壞肺部正常細胞的凋亡機制，腫瘤細胞的快速增長，從而激活Caspase-3抑制腫瘤細胞凋亡，繼而使Caspase-4呈現(xiàn)高度表達[19-20]。同時本研究通過對Caspase-4相關(guān)因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caspase-4 陽性表達與性別、年齡、臨床分期無關(guān)，這可能由于性別、年齡、臨床分期與肺部細胞的凋亡無直接關(guān)系，但Caspase-4陽性表達與組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，王傳艷等[21]、姬斌等[22]的研究提示Caspase家族與癌組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移協(xié)同變化有關(guān)，為上述結(jié)論提供了重要的依據(jù)。這有可能由于鱗癌是發(fā)生在鱗狀上皮細胞，腺癌是發(fā)生在腺上皮細胞，故后者的細胞增殖較前者強，從而使腺癌細胞中抑制Caspase-4特異性活化，降低細胞內(nèi)凋亡信號，從而使細胞正常凋亡受阻。而分化程度代表腫瘤的惡性程度，其分化程度越低則意味著腫瘤細胞與正常組織相差較大，表明腫瘤細胞的增殖較為嚴重，進一步提示肺部細胞生存環(huán)境的凋亡機制紊亂，從而引起Caspase-4的異常表達。同時患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則意味著腫瘤的發(fā)展可能進入晚期，腫瘤細胞通過血管侵入淋巴管，促使淋巴細胞增殖、分化，其機制可能是機體無法使腫瘤細胞正常凋亡而發(fā)生侵襲，從而進一步提出設想，這可能是Caspase-4能夠有效地切割其原結(jié)構(gòu)域，從而破壞了Caspase-4賴以生存的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)環(huán)境，抑制腫瘤細胞的凋亡[23-24]。此外，Caspase-4表達陽性患者1年無進展生存率為60.00%，明顯低于Caspase-4 表達陰性患者的86.00%，表明Caspase-4的表達可作為NSCLC患者的預后生存指標，這有可能由于Caspase-4高度表達會破壞細胞凋亡過程，加劇腫瘤細胞的增殖與分化，繼而使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，而劉小敏等[25]的研究結(jié)論也明確Caspase家族是癌細胞的預后重要因素之一，進一步提示醫(yī)師應對可疑NSCLC患者進行Caspase-4 表達檢測，把控患者的病情發(fā)展，同時給予患者可對抗Caspase-4高度表達的藥物，提高患者的預后生存。

本研究仍存在一定不足，如樣本量較少不足以代表所有案例，但Caspase-4在NSCLC組織中的mRNA陽性表達與組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存預后有關(guān)，檢測其表達可能可作為NSCLC診治和預后的重要評估指標。