曹建, 萬(wàn)相斌, 杜記濤, 趙衛(wèi)杰, 陳廣龍, 趙智力, 董志闖, 孫淼淼, 李智△

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1普外科， 2病理科(河南鄭州 450000)

最新調(diào)查結(jié)果顯示中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率從2003年的12.8/10萬(wàn)，上升到2011年的16.8/10萬(wàn)，病死率從5.9/10萬(wàn)上升到7.8/10萬(wàn)[1]。K-ras蛋白是由KRAS基因編碼的一個(gè)質(zhì)量為21 kD小分子蛋白質(zhì)，KRAS基因是一個(gè)原癌基因，目前研究發(fā)現(xiàn)在肺癌、胰腺癌以及結(jié)直腸癌等實(shí)體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)K-ras蛋白的異常激活[2]。對(duì)于結(jié)直腸癌傳統(tǒng)化療的研究目前已經(jīng)進(jìn)入瓶頸，難以進(jìn)一步改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后。近兩年來(lái)隨著精準(zhǔn)醫(yī)療，個(gè)體醫(yī)療理念的提出及發(fā)展，對(duì)于發(fā)現(xiàn)腫瘤有效的治療靶點(diǎn)，篩選適合個(gè)體化治療的患者顯得至關(guān)重要。直接靶向K-ras蛋白是一種治療結(jié)直腸癌可靠的手段，但是直接靶向K-ras蛋白難度較大，因?yàn)镵-ras蛋白和GTP結(jié)合的比較緊密，而且二者經(jīng)常處于一種結(jié)合狀態(tài)，而且K-ras的活性位點(diǎn)缺乏像口袋一樣的藥物結(jié)合區(qū)域[3]，所以目前對(duì)于直接靶向K-ras蛋白的的研究結(jié)果并不樂(lè)觀，多個(gè)針對(duì)靶向ras蛋白的分子藥物的Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)表明并沒(méi)改善患者的總生存期，結(jié)果并不理想[4-6]。K-ras蛋白活化過(guò)程是由鳥(niǎo)苷酸交換因子催化KRAS-GDP到KRAS-GTP的過(guò)程，作為鳥(niǎo)苷酸交換因子(son of sevenlessl, SOS1)家族中的其中一員, SOS1蛋白是K-ras蛋白的激活蛋白[7]，目前也有研究嘗試干擾SOS1與K-ras結(jié)合來(lái)抑制K-ras蛋白活化[8]。本研究通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)了結(jié)直腸癌SOS1,K-ras蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，并著重分析了SOS1、K-ras蛋白的不同表達(dá)分組與結(jié)直腸患者預(yù)后之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌患者的生物靶向治療及預(yù)后判斷提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科2012年1月至2013年12月期間180例經(jīng)術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌的患者以及相應(yīng)癌旁5 cm以上結(jié)直腸黏膜組織標(biāo)本45例為研究對(duì)象,所有患者一般病歷資料及病理組織蠟塊均完整。排除切片及免疫組化染色過(guò)程中出現(xiàn)組織脫片或染色失敗的病例，最終可供統(tǒng)計(jì)分析病例數(shù)為156例。其中，女74例，男82例。年齡18～84歲，平均(59.7±0.65)歲，中位年齡61歲。按照2018年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)發(fā)布惡性腫瘤 TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期45例， Ⅲ期56例，Ⅳ期35例。腫瘤部位：右半結(jié)腸23例，左半結(jié)腸26例，直腸107例。中、高分化87例，低分化69例。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例。所有患者術(shù)前均未接受任何放化療、 內(nèi)分泌治療及靶向治療并全部接受結(jié)直腸癌根治術(shù)，有轉(zhuǎn)移灶患者均進(jìn)行同期或分期R0切除。

1.2 組織芯片制作 組織陣列儀(personal tissue arrayer)，美國(guó)Beecher公司生產(chǎn)。選用質(zhì)量好結(jié)直腸癌組織的病理玻璃切片和相應(yīng)的石蠟標(biāo)本，在顯微鏡下定位標(biāo)記出典型的病變部位，然后將根據(jù)標(biāo)記的HE切片在石蠟組織塊上找到相同部位并標(biāo),本研究每例石蠟標(biāo)本取1個(gè)點(diǎn)。在組織陣列儀上固定好空白石蠟陣列塊，在供體石蠟組織標(biāo)記的部位用直徑0.3 mm深度為2 mm的打孔針采集圓柱形組織塊(tissue core)，將組織塊移入受體蠟塊打好的孔中，距離第1個(gè)孔1 mm處打孔下第2個(gè)孔。重復(fù)上述步驟，制成組織芯片3張。將受體石蠟塊放在37℃的水浴中10～15 min后用一個(gè)載玻片下壓保持組織芯片的表面平整。使用切片輔助系統(tǒng)(Adhesive-coated Tape Sectioning System)對(duì)組織芯片蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，每張切片厚 3 μm。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 運(yùn)用聚合物免疫組化技術(shù)(MaxVisionTM試劑盒)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。K-ras (兔抗，Abcam，CA,USA,Cat number ab140621)抗體，工作濃度1∶2 400， 室溫孵育30 min，SOS1 (兔抗，Abcam，CA,USA,Cat number ab180772)抗體，工作濃度1∶200,室溫孵育30 min。染色技術(shù)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判讀 每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡(400倍)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色深度計(jì)分，(1)陽(yáng)性表達(dá)<5%為0分;(2)陽(yáng)性表達(dá)5%～24%為1分;(3)陽(yáng)性表達(dá)25%～49%為2分;(4)陽(yáng)性表達(dá)50%～74%為3分;(5)陽(yáng)性表達(dá)>75%為4分。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的著色深度:基本不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色3分。兩者得分相乘，<3分判定為表達(dá)陰性，其余判定為表達(dá)陽(yáng)性。所有切片均采用雙盲法由2位病理科主任醫(yī)師閱片，兩人結(jié)果一致則記錄結(jié)果如有爭(zhēng)議請(qǐng)第3位病理科醫(yī)生看片，以?xún)蓚€(gè)相同結(jié)果為準(zhǔn)。

1.5 隨訪 隨訪方式主要以電話隨訪和門(mén)診復(fù)查為主，隨訪時(shí)間至2018年2月28日，隨訪5～52.4個(gè)月，中位隨訪時(shí)間38.1個(gè)月，期間35例死亡，其中31例死于腫瘤相關(guān)事件，4例死于非腫瘤相關(guān)事件。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移要求有病理診斷或者典型的影像學(xué)及臨床表現(xiàn)，復(fù)發(fā)和生存時(shí)間按月記錄，以手術(shù)日至患者復(fù)發(fā)、死亡或最后一次就診(隨訪)時(shí)間為復(fù)發(fā)或生存期限。失訪，非腫瘤死亡及截止點(diǎn)生存病例按統(tǒng)計(jì)分析要求列為截尾數(shù)據(jù)處理。本研究已通過(guò)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理學(xué)要求，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用2檢驗(yàn)分析K-ras蛋白和SOS1蛋白在結(jié)直腸癌患者和癌旁組織中表達(dá)的差異以及K-ras蛋白和SOS1蛋白與臨床病理的關(guān)系，應(yīng)用GraphPad Prism 7.0軟件，采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)以及COX多因素分析分析K-ras蛋白和SOS1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙側(cè))。

2 結(jié)果

2.1 K-ras蛋白和SOS1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)關(guān)系 K-ras蛋白和SOS1蛋白在細(xì)胞質(zhì)及胞漿中均有表達(dá)。K-ras蛋白和SOS1蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性率高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。K-ras陽(yáng)性表達(dá)與患者性別2=4.405,P=0.036)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(2=9.471,P=0.002)以及TNM分期有關(guān)(2=6.177,P=0.013)。SOS1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤部位、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表1、2。

圖1 K-ras蛋白、SOS1蛋白在結(jié)直腸癌旁組織及癌組織的表達(dá)(S-P法)

表1 K-ras蛋白和SOS1蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁中的表達(dá)例(%)

2.2 K-ras和SOS1蛋白共表達(dá)對(duì)生存率的影響 K-ras蛋白和SOS1蛋白對(duì)結(jié)直腸癌患者4年OS均無(wú)相關(guān)性(Log RankP>0.05)。進(jìn)一步根據(jù)K-ras和SOS1蛋白的表達(dá)情況將病例分為4組：K-ras陰性SOS1陰性組(n=17)；K-ras陰性SOS1陽(yáng)性組(n=16);K-ras陽(yáng)性SOS1陽(yáng)性組(n=63)；K-ras陽(yáng)性SOS陰性組(n=60)。組間比較僅K-ras陽(yáng)性SOS1陽(yáng)性組與K-ras陽(yáng)性SOS陰性組之間結(jié)直腸癌患者4年總體生存率(overall survival，OS)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.381，95%CI:1.103～5.137，P=0.034 3)。COX多因素分析顯示：調(diào)整了性別、年齡、腫瘤分化程度、手術(shù)方式、是否行術(shù)后輔助化療、腫瘤T分期、腫瘤N分期、免疫組化分組等因素后，顯示腫瘤T分期(HR=2.118，95%CI: 1.109～4.046，P=0.023)、腫瘤N分期(HR=2.487，95%CI:1.103～5.610，P=0.028)及免疫組化分組(HR=2.795，95%CI：1.272～6.139，P=0.010)是結(jié)直腸癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)圖2，表3。

表2 K-ras蛋白和SOS1蛋白與結(jié)直腸癌患者臨床病理的關(guān)系(n=156) %

3 討論

結(jié)直腸癌是一組異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，其發(fā)生是一種多基因突變，多階段共同發(fā)展的過(guò)程。KRAS基因在結(jié)直腸癌中的突變率為35%～45%，其中KRAS基因常見(jiàn)突變形式為第2外顯子12、13位密碼子發(fā)生突變，產(chǎn)生異常K-ras蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)[9]。K-ras蛋白是MAPK信號(hào)通路上游的關(guān)鍵因子，活化的K-ras蛋白可以激活下游 RAS/RAF以及PI3K/Akt等下游信號(hào)分子，從而產(chǎn)生調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等一系列細(xì)胞生物學(xué)作用[10]。研究結(jié)果顯示K-ras蛋白在結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌等在內(nèi)的多種腫瘤組織中均存在異常激活[11-12]，K-ras蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性率明顯高于非癌組織[13]。在結(jié)直腸癌中，由K-ras蛋白介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)存在異常激活，KRAS基因突變型的晚期結(jié)直腸癌對(duì)抗EGFR靶向治療通常是無(wú)效的[14]。目前研究證實(shí)SOS1基因突變會(huì)導(dǎo)致努南綜合征(Noonan syndrome,NS)發(fā)生，但是與人類(lèi)腫瘤發(fā)生的關(guān)系并不明確[15]。SOS1蛋白由SOS1基因編碼，又被稱(chēng)為鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)換因子，是K-ras蛋白的激活因子。當(dāng)胞外信號(hào)與受體結(jié)合后，生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2)，作為接頭分子，與激活的受體結(jié)合，再與SOS1的C端富于脯氨酸的序列相互作用形成受體-Grb2-SOS1復(fù)合物。SOS1與受體或受體底物蛋白上的Tyr磷酸化位點(diǎn)結(jié)合導(dǎo)致胞漿蛋白SOS1向膜轉(zhuǎn)位，并在Ras附近形成高濃度的SOS1，SOS1與Ras-GDP結(jié)合，促使GTP取代Ras上的GDP，使Ras由失活態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)，激活Ras蛋白，形成活性Ras-GTP復(fù)合物使K-ras蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)[16]。近年來(lái)，關(guān)于靶向SOS1蛋白來(lái)抑制K-ras蛋白激活，從而抑制MAPK信號(hào)通路活化的一些初期研究報(bào)道也取得了比較令人滿(mǎn)意的效果[17]。

圖2 K-ras蛋白和SOS1蛋白對(duì)結(jié)直腸癌患者4年生存率的影響

項(xiàng)目回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差瓦爾德自由度顯著性O(shè)R值95.0%置信區(qū)間T分期(T1-2-T3-4)0.7500.3305.16210.0232.1181.109～4.046N分期(N0-N1-3)0.9110.4154.82210.0282.4871.103～5.610免疫組化分組1.0280.4026.55010.0102.7951.272～6.139

Leshchiner等[18]研究的SAH-SOS1 A小分子化合物可以與SOS1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合K-ras結(jié)合位點(diǎn)，從而達(dá)到抑制K-ras蛋白活化的目的，在結(jié)直腸癌、胰腺癌KRAS基因野生或者突變細(xì)胞系中，都發(fā)現(xiàn)了SAH-SOS1A可以有效降低K-ras蛋白介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的下游的Akt、Erk1/2蛋白磷酸化程度，同時(shí)在果蠅的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，也得出了相同的結(jié)果。以上基礎(chǔ)研究表明，SOS1可能是個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。但在臨床上SOS1,K-ras蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況及與結(jié)直腸癌患者預(yù)后之間的關(guān)系目前還鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示K-ras在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性率高于癌旁組織，這與其他研究是一致的。此外，SOS1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性率也高于癌旁組織。K-ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更晚的腫瘤TNM分期相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)SOS1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)有關(guān)。以上結(jié)果提示K-ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)可能與結(jié)直腸癌疾病晚期進(jìn)展有關(guān)。

我們根據(jù)K-ras、SOS1蛋白在結(jié)直腸癌表達(dá)的免疫組化結(jié)果對(duì)病例進(jìn)行了分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在K-ras、SOS1同時(shí)陽(yáng)性組的結(jié)直腸患者與K-ras陽(yáng)性SOS1陰性組的4年OS相比，預(yù)后更差，多因素分析結(jié)果表明腫瘤T分期、N分期及免疫組化分組是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這與SOS1促進(jìn)K-ras活化，進(jìn)而激活MAPK信號(hào)通路的理論結(jié)果是相吻合的。因此，聯(lián)合檢測(cè)這兩種蛋白可以對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。此外，對(duì)于K-ras、SOS1共陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者，靶向SOS1治療可能會(huì)改善這一類(lèi)患者預(yù)后。