鄧慧敏， 熊英， 傅穎媛， 況南珍△

1南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(江西南昌 330006); 2江西省疾病預(yù)防控制中心疾病檢驗(yàn)所(江西南昌 330029)

手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)作為一種兒童傳染性病，好發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等多個(gè)部位出現(xiàn)皰疹，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等并發(fā)癥，病情嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患兒死亡[1]。HFMD由糞-口途徑傳播，柯薩奇病毒A16型(Cox A16)和腸道病毒71型(EV71)是其最為常見病原體來源[2]。與Cox A16相比，EV71具有神經(jīng)毒性作用，能引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病和死亡，已有相關(guān)死亡病例被報(bào)道[3]。EV71是正二十面體的球形結(jié)構(gòu)，由近7 500 bp的單股正鏈RNA基因構(gòu)成，編碼11個(gè)蛋白(結(jié)構(gòu)蛋白VP1-4和非結(jié)構(gòu)蛋白2A-C，3A-D)[4]。近幾年研究已證實(shí)EV71的毒力主要與結(jié)構(gòu)蛋白VP1相關(guān)，VP1的表達(dá)水平也在一定程度上代表病毒的復(fù)制能力，但至今EV71的靶點(diǎn)——神經(jīng)毒性的抗原決定簇尚未被查證。目前，臨床上也沒有特效的疫苗和抗病毒藥物來預(yù)防治療EV71引起的HFMD，主要以對(duì)癥治療(免疫球蛋白靜脈注射)為主，從而控制HFMD的發(fā)展和并發(fā)癥[5]。天然植物中發(fā)現(xiàn)了許多具有抗病毒活性的有效成分，可應(yīng)用于病毒感染類疾病的治療[6-7]。金邊瑞香主要包括香豆素類、木脂素類、雙黃酮類三大化合物，具有抗炎[8-10]、抗氧化[11-12]、治療糖尿病[13-14]、保護(hù)神經(jīng)[15]和缺血再灌注損傷恢復(fù)[16-17]等藥理作用。瑞香素(daphnetin, DAP)系香豆素類化合物，是從天然植物金邊瑞香中提取的活性成分，本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事該活性成分的研究，已經(jīng)證實(shí)了瑞香素具有抗腫瘤[18]、抗炎[19]等作用，但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于瑞香素的抗病毒作用。因此，本實(shí)驗(yàn)室2013—2016年立足本省盛產(chǎn)資源，主要探討瑞香素體外抗EV71復(fù)制的影響，為瑞香素治療EV71感染的HFMD提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD細(xì)胞)由江西省疾病預(yù)防控制中心病毒所提供。

1.1.2 病毒株 EV71(編號(hào)：SZK2141/2012)由江西省疾病預(yù)防控制中心病毒所提供并分離培養(yǎng)，在人RD細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過3次凍融后離心(12 000×g，10 min),取上清，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 藥物 瑞香素購(gòu)自上海士峰生物科技有限公司，純度≥98%。利巴韋林(ribavirin, RVB)購(gòu)自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份公司，純度≥98%。

1.1.4 試劑和儀器 含鏈霉素青霉素高糖MEM培養(yǎng)液(北京Solarbio科技有限公司)；胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；DMSO(天津大茂化學(xué)試劑廠)；Cell Counting Kit-8(上海BestBio貝博生物)；0.25%胰酶(美國(guó)GIBCO公司)；EV71核酸測(cè)定試劑盒(上海之江生物科技有限公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(湖南長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司)；凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；倒置顯微鏡(XSZ-D重慶光學(xué)儀器廠)；紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 嚴(yán)格按照細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作要求，對(duì)RD細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)、傳代至第3代，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。RD細(xì)胞的培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的MEM 高糖培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 病毒擴(kuò)增 10%胎牛血清MEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)RD細(xì)胞，至細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底后，2%胎牛血清MEM維持培養(yǎng)基，接種200 μL EV71病毒液，置37℃、5%CO2孵育至細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)達(dá)“+++～++++”(細(xì)胞病變達(dá)75%～100%)。經(jīng)過3次凍融后離心(4℃，12 000×g，10 min)，去除細(xì)胞碎片，取上清，分裝，每支0.5 mL，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒滴定 取1×105·mL-1的RD細(xì)胞100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿成單層后(約48 h)，接種病毒；將病毒原液用MEM維持培養(yǎng)基按10倍倍比稀釋(10-1，10-2，……10-8)100 μL/孔，加入已吸去培養(yǎng)基的96板中，嚴(yán)格按照要求培養(yǎng)，每日鏡下觀察細(xì)胞病變情況，培養(yǎng)7 d，確定細(xì)胞不出現(xiàn)明顯病變的最低稀釋濃度, 運(yùn)用Karber法計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。公式如下：lgTCID50=L-D(S-0.5) (L：最高稀釋度的對(duì)數(shù)；D：稀釋度對(duì)數(shù)之間的差；S：陽(yáng)性孔比率總和。)

1.2.4 瑞香素毒性檢測(cè) 按“1.2.3”方法常規(guī)培養(yǎng)RD細(xì)胞48 h至單層貼壁狀態(tài)；將瑞香素溶解于10 μL DMSO中，再用MEM維持培養(yǎng)基稀釋，使瑞香素的終濃度為40、30、25、20、15、12.5、10、7.5、6.25、5、3.125 μg/mL。各取100 μL加入到已經(jīng)棄去培養(yǎng)液的RD細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)4孔正常細(xì)胞孔(MEM維持培養(yǎng)基代替藥物組)和空白對(duì)照孔(只加MEM維持培養(yǎng)基的調(diào)零組)，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)結(jié)束前3 h于每孔加入10 μL CCK8溶液。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值(OD)。按以下公式計(jì)算RD細(xì)胞的存活率；得出瑞香素最大無毒濃度(TC0)，并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS的回歸法計(jì)算50% 細(xì)胞毒性濃度(TC50)。細(xì)胞存活率(%)=(藥物作用組平均OD值-空白對(duì)照組OD值)/(正常細(xì)胞組平均OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%

1.2.5 瑞香素體外抗EV71檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)為：(1)正常細(xì)胞組：不加藥物及EV71干預(yù)RD細(xì)胞；(2)病毒對(duì)照組：EV71+RD細(xì)胞；(3)瑞香素組：不同濃度的瑞香素+EV71+RD細(xì)胞(瑞香素濃度根據(jù)“1.2.4”測(cè)定的TC0和TC50為15、12.5、10、7.5、5、3.75、2.5、1.875、1.25、1 μg/mL)；(4)陽(yáng)性藥物組：50 μg/mL RVB +EV71+RD細(xì)胞。將100 μL RD細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h后，吸棄上清液，分兩種給藥方式進(jìn)行：(1)病毒感染后給藥：除正常細(xì)胞組加100 μL MEM維持培養(yǎng)基外,其余3組均加入100TCID50病毒100 μL吸附1 h，吸去病毒液后，病毒對(duì)照組更換成100 μL MEM維持培養(yǎng)基；瑞香素加入100 μL含不同濃度的瑞香素的MEM維持培養(yǎng)基；陽(yáng)性藥物組100 μL 50 μg/mL RVB的MEM維持培養(yǎng)基。37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。(2)病毒感染時(shí)給藥：將各組藥物(不同濃度的瑞香素及50 μg/mL RVB)與100TCID50病毒混合于MEM維持培養(yǎng)基中37℃孵育2 h，將100 μL混合液接種在RD細(xì)胞上。將兩種給藥方式下的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)結(jié)束前3 h于每孔加入10 μL CCK8溶液。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值。按以下公式計(jì)算病毒抑制率。病毒抑制率(%)= (藥物作用組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值)/ (正常細(xì)胞組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值)×100%

1.2.6 病毒載量的測(cè)定 同上培養(yǎng)RD細(xì)胞48 h，根據(jù)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用兩種作用方式(即病毒感染后給藥、藥物與病毒同時(shí)加入)；并根據(jù)“1.2.5”結(jié)果設(shè)定瑞香素濃度為15、10、7.5、5、2.5 μg/mL)；利用EV71核酸測(cè)定試劑盒(Real-time-PCR)檢測(cè)病毒載量。循環(huán)設(shè)置：45℃ 10 min，95℃ 15 min，再按95℃ 15 s至60℃ 60 s，循環(huán)40次，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃，反應(yīng)體系為25 μL。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴定 TCID50法測(cè)定繁殖的EV71病毒滴度，將有病變的孔標(biāo)記，按公式計(jì)算。結(jié)果顯示，EV71病毒滴度為10-5.9/0.1 mL，即將EV71病毒稀釋10-5.9倍后接種100 μL可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用病毒的濃度為100TCID50。

2.2 瑞香素對(duì)RD細(xì)胞存活率的影響 不同濃度的瑞香素作用RD細(xì)胞72 h，有不同的作用效果。瑞香素濃度為3.125～25 μg/mL時(shí)，鏡下細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，細(xì)胞存活率較正常細(xì)胞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)瑞香素為20 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率分別降至83.55%和65.66%，低于正常細(xì)胞組；而瑞香素濃度為30 μg/mL和40 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率分別降至59.00%和48.04%，明顯低于正常細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，瑞香素最大無毒濃度(TC0)為15 μg/mL，通過回歸法計(jì)算出TC50為33.47 μg/mL。見表1、圖1。

瑞香素濃度(μg/mL)存活率4048.04±0.02?3059.00±0.01?2565.66±0.022083.55±0.0315106.61±0.0712.5103.81±0.0910106.46±0.067.5108.25±0.116.25108.75±0.015107.16±0.173.125103.50±0.090(正常細(xì)胞組)100.00±0.11

*與正常細(xì)胞組比較P<0. 05

*與正常細(xì)胞組比較 P<0.05，n=4

2.3 瑞香素對(duì)病毒EV71 抑制率的影響 采用不同濃度瑞香素作用病毒感染細(xì)胞，觀察瑞香素對(duì)病毒EV71 抑制率的影響。根據(jù)2.2結(jié)果設(shè)定瑞香素濃度為15、12.5、10、7.5、5、3.75、2.5、1.875、1.25、1 μg/mL。

2.3.1 病毒感染后加藥 上述濃度瑞香素作用后，對(duì)EV71病毒感染均有一定的抑制效果，且呈劑量依賴性。瑞香素濃度為1～3.75 μg/mL時(shí)，病毒抑制率在17.58%～34.97%；瑞香素濃度為5～10 μg/mL時(shí)，病毒抑制率在55.73%～69.31%，瑞香素濃度為12.5、15 μg/mL時(shí)，病毒抑制率為86.39%、82.00%，與正常細(xì)胞組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，瑞香素濃度為7.5～15 μg/mL時(shí)，而與陽(yáng)性藥物組(50 μg/mL RVB)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2-A。

2.3.2 病毒感染時(shí)加藥 上述濃度瑞香素和EV71病毒混合培養(yǎng)后，對(duì)EV71病毒都有一定的抑制效果。瑞香素濃度為1～10 μg/mL時(shí)，其病毒抑制率在11.03%～46.46%之間；而瑞香素濃度為12.5、15 μg/mL的病毒抑制率分別為97.25%、69.06%，與正常細(xì)胞組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。瑞香素濃度為12.5 μg/mL時(shí)，與陽(yáng)性藥物組(50 μg/mL RVB)比病毒抑制率亦明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，瑞香素濃度為3.75～10，15 μg/mL時(shí)，與陽(yáng)性藥物組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2-B。

藥物濃度(μg/mL)病毒感染后期病毒感染期瑞香素1582.00±0.308 69.06±0.390瑞香素12.586.39±0.20997.25±0.040?瑞香素1069.31±0.25138.56±0.410瑞香素7.562.88±0.13246.46±0.370瑞香素555.73±0.24534.29±0.390瑞香素3.7534.97±0.35238.39±0.270瑞香素2.529.75±0.30321.32±0.300瑞香素1.87527.37±0.40511.03±0.300瑞香素1.2524.00±0.32212.34±0.290瑞香素1 17.58±0.00012.63±0.0000(正常細(xì)胞組)100.00±0.227100.00±0.230RVB 5090.10±0.10846.09±0.020

*與陽(yáng)性藥物組比較P<0.05

A：病毒感染后期；B：病毒感染期；◇與陽(yáng)性藥物組比較 P<0.05

2.4 瑞香素對(duì)病毒載量的影響 采用RT-PCR進(jìn)一步觀察瑞香素對(duì)病毒載量的影響。根據(jù)2.3結(jié)果設(shè)定瑞香素濃度為15、10、7.5、5、2.5 μg/mL。

2.4.1 病毒感染后加藥 濃度為15、10 μg/mL的瑞香素在EV71病毒感染后用藥對(duì)EV71有較好的抑制效果，其病毒載量下降，與病毒對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表3、圖3-A。

2.4.2 病毒感染時(shí)加藥 濃度為15、10、7.5 μg/mL的瑞香素與EV71病毒混合培養(yǎng)后，對(duì)EV71病毒有較好的抑制效果，其病毒載量下降，與病毒對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表3、圖3-B。

瑞香素濃度(μg/mL)病毒載量病毒感染后期病毒感染期158.16±0.060△8.20±0.067△108.07±0.060△8.06±0.066△7.58.15±0.0668.14±0.046△58.63±0.0568.34±0.0802.58.53±0.0938.27±0.1940(病毒對(duì)照組)8.50±0.0148.445±0.036

△與病毒對(duì)照組比較P<0.05

A：病毒感染后期；B病毒感染期；△與病毒對(duì)照組比較 P<0.05

3 討論

近些年，以EV71感染為主的HFMD在亞太地區(qū)的發(fā)病率、病死率呈上升趨勢(shì)，中國(guó)作為人口第一大國(guó)，嬰幼兒多，全國(guó)多個(gè)地點(diǎn)爆發(fā)過HFMD，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)關(guān)注的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。EV71感染的HFMD多是重癥病情，嚴(yán)重時(shí)可致死。目前EV71感染的致病機(jī)制尚不明確，未找到關(guān)鍵致病基因，相對(duì)臨床應(yīng)用于治療EV71的相關(guān)藥物(免疫球蛋白、RVB和Pleconaril等)在體內(nèi)只有抗病毒活性，不具備抑制EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)。隨著篩選和分離技術(shù)的提高，從中草藥中篩選和提取抗 EV71 藥物成分已成為近些年國(guó)內(nèi)研究EV71的治療熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的中藥毒副作用小、具有調(diào)節(jié)免疫功能、抑制病毒復(fù)制和鎮(zhèn)痛抗炎等多重療效，研究意義重大。研究表明，小蘗堿以劑量依賴性抑制EV71的活性，主要是通過下調(diào)MRK/ERK信號(hào)通路和抑制EV71產(chǎn)生的自噬表達(dá)來完成的[5]。袁琦等[20]利用體外實(shí)驗(yàn)CPE法檢測(cè)出紅景天甲醇冷浸提取物具有抗EV71病毒的活性。穿心蓮內(nèi)酯磺酸鹽(喜炎平注射液)通過調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的直接免疫調(diào)節(jié)活性，提高機(jī)體的免疫力，從而保護(hù)小鼠免受致死性EV71攻擊[21]。

本實(shí)驗(yàn)室多年來對(duì)金邊瑞香及瑞香素進(jìn)行了系列研究[18-19,22-25]，前期已經(jīng)證實(shí)的瑞香素的抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等相關(guān)藥理作用，本研究則從另一個(gè)角度——“抗病毒”出發(fā)，為瑞香素的藥用價(jià)值提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)成功地進(jìn)行了病毒EV71擴(kuò)增與滴定，并用CPE、CCK8、RT-PCR檢測(cè)不同濃度的瑞香素對(duì)EV71的抑制率，結(jié)果顯示：瑞香素對(duì)RD細(xì)胞的TC50為33.47 μg/mL，TC0為15 μg/mL。選取無毒范圍的瑞香素濃度作用于病毒感染的不同階段，結(jié)果表明瑞香素在病毒感染期與感染后期均有不同的抑制效果。病毒感染后加入濃度為12.5、15 μg/mL瑞香素，其病毒抑制率為86.39%、82.00%,顯示其在該濃度下對(duì)病毒有很好的抑制作用，且瑞香素濃度為7.5～15 μg/mL時(shí)，與陽(yáng)性藥物組比無顯著性差異，顯示其在較低的濃度下對(duì)病毒仍能具有與RVB相似的抑制效果。而在病毒感染期，瑞香素濃度為12.5、15 μg/mL的病毒抑制率分別為97.25%、69.06%，同樣對(duì)病毒有很好的抑制作用，且瑞香素濃度為12.5 μg/mL時(shí)，與陽(yáng)性藥物組相比抑制率亦明顯升高，在濃度為低至3.75 μg/mL時(shí)，亦能達(dá)到與RVB有相似的抑制作用。同時(shí)，對(duì)這兩階段提取培養(yǎng)液上清進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，濃度為15、10 μg/mL的瑞香素在EV71感染細(xì)胞后再用藥處理，能有效降低病毒載量；而以濃度為15、10、7.5 μg/mL瑞香素與EV71病毒混合作用于細(xì)胞，同樣具有降低病毒載量的作用，均對(duì)EV71的復(fù)制有較好的抑制效果。由此可見，瑞香素在體外有明確的抗EV71病毒作用，其結(jié)果為進(jìn)一步研究其藥效提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

目前有研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)是抗EV71治療的另一重要手段，其中巨噬細(xì)胞，干擾素(IFN)可均具有較強(qiáng)的抑制病毒作用，通過免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答，降低小鼠病死率的作用[26]。而本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)瑞香素具有較好免疫調(diào)節(jié)作用，可提高Foxp3+Treg細(xì)胞水平，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞[19]。因此，用瑞香素治療EV71感染為主的HFMD具有較好的開發(fā)前景，可為抗EV71藥物提供了潛在可能性。隨著瑞香素濃度的升高，對(duì)EV71的抑制作用逐漸增強(qiáng)，但是當(dāng)濃度超過一定值時(shí)，抑制率也不再上升，可能與瑞香素對(duì)RD細(xì)胞產(chǎn)生的雙向調(diào)節(jié)作用有關(guān)。由此可見，瑞香素在體外有明確的抗EV71病毒作用，可望為治療EV71感染的HFMD，以及瑞香素抗病毒分子機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。