鄧方閣， 虢慧芝, 林琳, 李韜

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、廣州呼吸健康研究院、呼吸疾病國家重點實驗室、呼吸疾病國家臨床研究中心(廣東廣州 510120)； 2深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院超聲科(廣東深圳 518001)； 3廣州市第八人民醫(yī)院放射科(廣東廣州 510060)

靜脈血栓栓塞癥包括深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis, DVT)與肺栓塞，兩者是發(fā)生在不同部位的同一種疾病[2-3]，由于DVT的臨床經(jīng)過隱匿且缺乏特異性，近80%的DVT患者常無臨床癥狀，尤其是DVT發(fā)生在肢體遠(yuǎn)端患者[3]，而在各種疾病死亡患者中，尸檢發(fā)現(xiàn)72%有DVT[4]。肺栓塞的誤漏診率很高，約70%以上，目前已成為猝死類疾病的第三大死因。90%以上的肺栓塞栓子是來自下肢DVT，因此早期發(fā)現(xiàn)并及時診治DVT可有效預(yù)防肺栓塞死亡[5]。同時，近年來，許多研究團隊都提出，當(dāng)臨床高度可疑DVT患者及對于DVT的高?；颊邥r，建議采用最簡單的無創(chuàng)的檢測方法以早期明確或排除DVT[6]。由于目前缺乏有效簡便的DVT篩查手段，本研究于2016年7—10月通過體外經(jīng)典結(jié)扎法構(gòu)建新西蘭白兔后肢股靜脈栓塞模型，通過對模型兔外周血炎癥因子檢測、局部股靜脈炎癥核因子-κB(NF-κB)免疫組化檢測以及紅外熱成像技術(shù)(infrared thermal imaging, IRTI)檢測，明確這種新型功能成像技術(shù)在DVT篩查中的應(yīng)用價值，以尋找DVT早期無創(chuàng)診斷新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心購置健康普通級新西蘭白兔6只(生產(chǎn)許可號為SCXK(粵)2014-0035)，均雄性，體重范圍2.4～2.8 kg。實驗前1周適應(yīng)性正常飼養(yǎng)。研究采用自身對照，均以右側(cè)結(jié)扎股靜脈為實驗側(cè)，以左側(cè)不結(jié)扎股靜脈為假手術(shù)對照側(cè)。

1.2 模型制備 3%戊巴比妥鈉溶液1 mL/kg進(jìn)行耳緣靜脈注射麻醉，密切觀察麻醉過程中生命體征，手術(shù)過程中視動物清醒情況而補充麻醉劑。實驗兔取仰臥位固定，充分暴露兔的腹部區(qū)和雙側(cè)后肢內(nèi)側(cè)。備皮、消毒后，在右側(cè)后肢近心端，沿股靜脈走向在股靜脈搏動最明顯處斜切(切口約4 cm長)，逐層分離皮下及肌肉組織、股三角處分離并游離股靜脈(約2.5 cm長)，4號手術(shù)絲線在游離股靜脈中間處結(jié)扎后逐層縫合。同樣方式切開和游離左側(cè)股靜脈，但不結(jié)扎股靜脈直接縫合。術(shù)后每天觀察和記錄模型兔的狀態(tài)及雙側(cè)后肢。

1.3 實驗室檢測 分別在術(shù)前、術(shù)后即刻、術(shù)后12、48 h采集外周血，進(jìn)行白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)炎癥因子檢測。

1.4 紅外熱成像檢測

1.4.1 紅外熱成像檢測儀 廣州呼研所紅外科技有限公司生產(chǎn)HYIR I-1206紅外熱像儀(廣東省高新技術(shù)產(chǎn)品)，儀器參數(shù)為：320×240紅外非制冷焦平面鏡頭、光譜響應(yīng)為8～14 μm、空間分辨率為1.3 mrad、溫度分辨率為0.05℃、采集速度達(dá)到每秒連續(xù)30幀圖像。檢測條件為標(biāo)準(zhǔn)室溫下(23±2)℃，保持相對濕度60%左右，且無陽光直射及空氣對流。

1.4.2 紅外熱成像圖采集 將實驗兔置于距紅外鏡頭約80 cm處，采集視野中心點為兔腹部與雙側(cè)后肢區(qū)中心交叉點，且視屏完整納入兔的腹部及后肢，分別在術(shù)前(T1)、術(shù)后即刻(T2)和術(shù)后48 h (T3) 3個時相點采集紅外熱成像圖。

1.4.3 紅外熱成像圖的分析 以股靜脈回流區(qū)域為局部興趣區(qū)(region of interest, ROI)設(shè)定是以手術(shù)段股靜脈為中心范圍大約3 cm×4 cm(長×寬)的區(qū)域。對所采集的紅外熱成像圖進(jìn)行紅外熱像輻射軌跡的定性分析，即利用不同顏色標(biāo)識不同溫度相對用從低溫到高溫的色階，觀察所采集對象的色階分布所代表的紅外軌跡進(jìn)行定性評價。

1.5 病理學(xué)檢查 T3時點紅外檢測完畢后，靜脈注入過量戊巴比妥鈉溶液處死兔，分離雙側(cè)股靜脈，大體觀察血栓形成節(jié)段及對側(cè)相同正常節(jié)段股靜脈血管是否有血栓形成，然后組織固定、切片，進(jìn)行NF-κB的免疫組化檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件，炎癥因子(IL-6、IL-8、TNF-α)含量均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對不同檢測時點進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物建?；厩闆r 6只實驗兔一般狀態(tài)良好，精神尚可，無出現(xiàn)呼吸困難、氣促、嗆咳、休克等肺動脈栓塞癥狀；除右側(cè)栓塞側(cè)肢體略有腫脹和活動略受限外，均未見肢體發(fā)黑、淤血等其他明顯的并發(fā)癥。

2.2 外周血炎癥因子表達(dá)水平 術(shù)前、術(shù)后各時間點的炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α均沒有明顯變化，各時間點間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3 紅外熱成像定性分析 通過對所獲取的紅外熱成像表達(dá)顯示，在術(shù)前(T1)時點，兩側(cè)紅外表達(dá)基本呈相對對稱性分布；術(shù)后即刻(T2)時點，兩側(cè)的體表溫度均較T1時點降低，但雙側(cè)表達(dá)呈不對稱性分布，呈現(xiàn)出結(jié)扎側(cè)較對照側(cè)異常溫度增高的紅外輻射軌跡；術(shù)后48 h(T3)時點的紅外輻射軌跡與T2時點相似，呈現(xiàn)典型的不對成性，但是，對照側(cè)紅外熱輻射軌跡表達(dá)已經(jīng)與T1時點相吻合，而結(jié)扎側(cè)則出現(xiàn)更為顯著的異常高溫。見圖1。

A：手術(shù)前；B：術(shù)后即刻；C：術(shù)后48 h

2.4 病理學(xué)結(jié)果 術(shù)后48 h解剖兔雙側(cè)股靜脈行大體觀察，發(fā)現(xiàn)，實驗結(jié)扎側(cè)血管圓鼓，呈暗紫色，明顯可見血栓充滿靜脈管腔，而對照側(cè)血管則扁塌，未見明顯血栓形成。股靜脈免疫組化檢測顯示，實驗結(jié)扎側(cè)股靜脈可見NF-κB陽性表達(dá)，而對照側(cè)股靜脈則未見NF-κB的表達(dá)。見圖2。

A：對照側(cè)股靜脈；B：實驗側(cè)股靜脈NF-κB陽性(箭頭)

圖2股靜脈結(jié)扎完全栓塞模型股靜脈區(qū)免疫組化NF-κB表達(dá)(×200)

3 討論

肺栓塞是目前繼心肌梗死和中風(fēng)后的第三大猝死原因，盡管DVT本身不致命，但是肺栓塞的栓子90%以上來自DVT。當(dāng)DVT的栓子一旦脫落，就會順著血循環(huán)流至肺循環(huán)中，阻塞到比栓子狹小的肺動脈中進(jìn)而導(dǎo)致肺栓塞，如果沒有發(fā)現(xiàn)和治療肺栓塞其致死率高達(dá)70%[7]，且目前DVT的發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢[8]，因此早期發(fā)現(xiàn)和診斷DVT意義重大并越來越受到重視[9-10]。

目前診斷DVT的方法很多，D-二聚體檢測是首要的初篩手段，但陰性排除且特異性差，低于500 ng/mL可以排除DVT，但是高于500 ng/mL就不一定是DVT，因為炎癥、腫瘤等都會導(dǎo)致其增高。血管造影是診斷DVT的公認(rèn)金標(biāo)準(zhǔn)，但是檢查有創(chuàng)，有1%的并發(fā)癥；需要經(jīng)驗豐富的醫(yī)生，且費用高。多普勒靜脈血管加壓超聲檢測是無創(chuàng)評價DVT的首選方法[3]，特異性高但檢測費時，且與DVT的敏感度、儀器的精敏度及實施檢測醫(yī)生的水平密切相關(guān)，特別對于肥胖及下肢肢體水腫等患者的檢測具有局限性。

近十年，隨著計算機、圖像處理、光電子等技術(shù)進(jìn)步，醫(yī)用IRTI作為一種新型便捷、非接觸、無輻射、無創(chuàng)傷、非侵襲的功能成像技術(shù)，最初是被用于軍事，之后逐漸用于工業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[11-15]，且具有檢測方便(如同照相)，檢查時間短(5～10 min)，費用低廉等優(yōu)勢。IRTI主要是通過紅外采集鏡頭將人體所輻射出來的紅外線接收后，在電腦上形成灰度圖，以標(biāo)識不同色階標(biāo)識從低溫到高溫的不同溫度，進(jìn)而把人體表面不可見的熱場信息與分布以人眼可見的圖像顯示出來，通過觀察和分析所采集對象的色階分布所代表的紅外輻射軌跡進(jìn)行定性評價以診斷疾病，因此這是一項綠色、絕對安全的新型輔助檢測技術(shù)。

人體體表溫度與機體血流關(guān)系密切，肢體表面溫度取決于外周血管血流量[16-17]。IRTI作為一種新型無輻射無損傷的非侵襲技術(shù)，通過遙感接收肢體所輻射出來的紅外線，得到表皮溫度和熱場信息，進(jìn)而了解肢體的血流量，當(dāng)肢體局部表皮溫度出現(xiàn)異常時，通常是提示該區(qū)域血流狀態(tài)異常[18-19]。前期研究以單純注射凝血酶構(gòu)建兔股靜脈DVT模型，以多普勒靜脈加壓超聲及超聲下靜脈血管造影檢測為對照，我們明確肯定了IRTI在股靜脈DVT中特定紅外熱成像軌跡及其在DVT早期發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用價值[20]。由于靜脈血栓形成DVT只是栓塞早期一個階段性病理改變，而股靜脈完全栓塞時的紅外熱成像軌跡表達(dá)與股靜脈DVT(即部分血栓形成時)的紅外表達(dá)是否一致還有待進(jìn)一步確定，因此在本研究中采用單純結(jié)扎股靜脈來模擬靜脈完全栓塞的經(jīng)典方法。本研究分別在術(shù)前(T1)、術(shù)后即刻(T2)及術(shù)后48 h (T3) 3個時點進(jìn)行紅外熱成像檢測，通過對所獲取的3個時點的紅外輻射軌跡進(jìn)行定性分析，明顯可見，通過這種體外單純靜脈結(jié)扎法所模擬的股靜脈完全栓塞模型具有獨特性紅外輻射軌跡，即：盡管T2時點雙側(cè)的紅外表達(dá)均較T1時點(基線溫值)降低，但是雙側(cè)的紅外表達(dá)已經(jīng)呈現(xiàn)出典型的不對成性分布，相比對照側(cè)，結(jié)扎側(cè)呈現(xiàn)為異常溫度增高的紅外熱輻射軌跡；而且在T3時點時，盡管其紅外輻射軌跡與T2時點相似，即呈現(xiàn)出典型的不對成性，但是，對照側(cè)的紅外輻射表達(dá)已經(jīng)與T1時點時的基線溫值相吻合，而結(jié)扎側(cè)則出現(xiàn)了更為顯著的異常高溫。這種靜脈完全栓塞的紅外表達(dá)軌跡與凝血酶所致的靜脈血栓形成的紅外輻射軌跡略有不同，這將有助于DVT的診斷與早期發(fā)現(xiàn)，同時也進(jìn)一步說明了，這種利用傳統(tǒng)經(jīng)典結(jié)扎法模擬的靜脈完全栓塞模型的紅外輻射軌跡與所采用模型的制備方式所具有的病理生理學(xué)變化密切相關(guān)，其病理生理學(xué)基礎(chǔ)是紅外輻射軌跡形成的主要機制。

此外，在本研究中還進(jìn)行了相關(guān)炎癥因子檢測，通過對外周血炎癥因子檢測并未發(fā)現(xiàn)異常，然而結(jié)扎的股靜脈局部免疫組化NF-κB卻呈現(xiàn)陽性表達(dá)，同時肉眼可見的略有腫脹和活動受限，這些都進(jìn)一步表明，股靜脈栓塞時不會導(dǎo)致外周血的炎癥因子水平的增高，但局部股靜脈栓塞時則有炎癥反應(yīng)，這也解釋了為什么目前臨床DVT患者、尤其發(fā)生在肢體遠(yuǎn)端患者經(jīng)常會漏診的主要原因。