石 靜, 馬 洪*, 段曉峰

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是發(fā)生在口腔頜面部最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，占口腔頜面部腫瘤的80%以上且全球每年新發(fā)現(xiàn)的OSCC人數(shù)超過(guò)300 000例，死亡人數(shù)超過(guò)120 000例[1]。目前針對(duì)中晚期OSCC病人以手術(shù)治療為主，手術(shù)治療后患者面容及口腔功能會(huì)有嚴(yán)重的缺陷，影響其生活質(zhì)量、言語(yǔ)等?，F(xiàn)已有一些OSCC的診斷標(biāo)志物，幫助早期診斷OSCC，但腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因多因素共同造成的結(jié)果，因此仍需要更進(jìn)一步探討潛在的一些腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物。近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)與多種腫瘤包括乳腺癌、胃癌，卵巢癌等發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，本研究采用免疫組織化學(xué)和Real-Time qPCR法檢測(cè)CDK1基因和蛋白在OSCC中的表達(dá)，同時(shí)觀察不同分化程度、不同臨床分期及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CDK1 mRNA的表達(dá)水平，為OSCC的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本主要儀器及試劑

1.1.1標(biāo)本采集 收集2015年10月～2017年4月頜面外科手術(shù)切除的新鮮OSCC組織64例(OSCC組)，病理類型經(jīng)病理科證實(shí)。OSCC患者男45例、女19例，年齡<60歲26例、≥60歲38例，高分化癌40例、中或低分化癌24例，臨床分期Ⅰ或Ⅱ期35例、Ⅰ或Ⅱ29例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；另取20例正常組織標(biāo)本(正常對(duì)照組)。本研究獲醫(yī)院倫理學(xué)會(huì)審核同意。切取1～2 mm3大小組織，一部分立即用RNAlater液暫封，-80 ℃凍存，用于Real-Time PCR檢測(cè)CKD1 mRNA的表達(dá)；另一部分用福爾馬林固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)CKD1蛋白的表達(dá)。

1.1.2主要儀器及試劑 CFX connect Real Time System PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD CFX96，美國(guó))，S1000 PCR 熱循環(huán)儀(BIO-RAD，美國(guó))，YS100光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)，各種規(guī)格的微量移液器(Eppendorf，德國(guó))，Dynabeads mRNA DIRECTTMKit試劑盒(Abcam公司，美國(guó))，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Roche公司，美國(guó))，Light Cycler R480 SYBR Green I Master(Roche公司，美國(guó))；CDK1引物序列(上游 TAGCATCATCAGATGCACGC，下游 GTGTCCAGCAGTCGCACTAT；上海生工，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué) 采用免疫組織化學(xué)超敏二步法檢測(cè)組織切片中CDK1的表達(dá)。利用高溫高壓修復(fù)(0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，4 min)，一抗按1∶250比例稀釋，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。所有操作均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，陽(yáng)性染色主要表現(xiàn)為胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，采用雙盲法在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察切片，根據(jù)免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS)評(píng)估染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞的比例；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%、10%～30%、>30%分別計(jì)0、1、2分，染色強(qiáng)度無(wú)著色、淡黃色、棕黃色及以上分別計(jì)0、1、2分；根據(jù)兩者綜合計(jì)分，0～1分計(jì)陰性(-)，2～3分計(jì)陽(yáng)性(+)，4分計(jì)強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

1.2.2qPCR 利用Dynabeads mRNA DIRECTTMKit試劑盒，磁珠法提取組織mRNA，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。按Light Cycler R480 SYBR Green I Master說(shuō)明在冰上操作，配制10 μL反應(yīng)體系， SYBR Green I Master 5 μL，上下游引物4.0 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件為變性95 ℃，5 min，變性95 ℃，10 s，退火65 ℃，30 s 共64個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔取平均值，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于免疫組化CDK1蛋白表達(dá)與臨床病例特征關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)于熒光定量PCR數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDK1蛋白表達(dá)

64例OSCC組織中可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)不同染色程度的棕黃色顆粒，少部分胞核見(jiàn)黃染，CDK1陽(yáng)性率為82.81%；正?？谇火つぜ?xì)胞胞質(zhì)中也存在少量棕黃色顆粒，CDK1陽(yáng)性率為20.00%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，OSCC組CDK1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表1。

正常對(duì)照組 OSCC組圖1 兩組口腔組織CDK1蛋白的表達(dá)(×400)Fig.1 CDK1 protein expression in oral tissues in the two groups

分組nCDK1蛋白表達(dá)-+++陽(yáng)性率(%)χ2P正常對(duì)照組20162220.0027.56 <0.05OSCC組 6411242982.81

2.2 CDK1 mRNA表達(dá)

OSCC組及正常組織CDK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.301 3±1.033 7，0.656 3±0.175 0，OSCC組表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

(1)與正常對(duì)照組比較，P<0.01圖2 CDK1 mRNA在兩組口腔組織中的相對(duì)表達(dá)Fig.2 Relavtive expression of CDK1 mRNA in OSCC and Normal tissue

2.3 不同臨床特征OSCC組織中CDK1 mRNA的表達(dá)

中、低分化OSCC的CDK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于高分化OSCC(P<0.05)，并且Ⅲ、Ⅳ期OSCC組織中CDK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量也高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC組織中CDK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于未見(jiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)；但是CDK1 mRNA的表達(dá)在不同性別及年齡中，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 CDK1 mRNA的表達(dá)與OSCC臨床特征的關(guān)系Tab.2 The relationships between CDK1 mRNA expression and clinical characteristics in patients with OSCC

3 討論

細(xì)胞周期主要通過(guò)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKS)的活化進(jìn)行調(diào)控。CDKS功能的失調(diào)在許多腫瘤中均有報(bào)道，推測(cè)CDKS因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2-4]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1) 為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一，其是CDC2基因編碼的相對(duì)分子質(zhì)量為3.4×104的蛋白質(zhì)。CDK1與cyclinB組成的復(fù)合物(即有絲分裂促進(jìn)因子，MPF), 促使細(xì)胞周期從 G2期進(jìn)入M 期，是影響細(xì)胞有絲分裂的主要因素[5-6]。CDK1是細(xì)胞周期的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)分子，在細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)制的紊亂有著密切的關(guān)聯(lián)，認(rèn)為腫瘤是一種細(xì)胞周期性疾病[7]。CDK1在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌中是影響臨床預(yù)后的標(biāo)志物[8]。因此，推測(cè)CDK1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有潛在的相關(guān)性。本研究在OSCC組織中，檢測(cè)出CDK1蛋白和基因的表達(dá)水平均增高，可能與大量癌細(xì)胞的增殖、惡性程度以及侵襲性的增加有關(guān)，可能有望成為判斷OSCC臨床預(yù)后的標(biāo)志物。

本研究中免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示64例OSCC組CDK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于20例正常對(duì)照組，同時(shí)qPCR結(jié)果顯示OSCC中CDK1 mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，這與CDK1在其他腫瘤病變?nèi)缥赴9]、乳腺癌[10]、卵巢癌[11]、肝癌[12]等中的報(bào)道相一致，其作用機(jī)制均是CDK1的含量增高，引起腫瘤細(xì)胞的增殖和發(fā)展。同時(shí)進(jìn)一步分析比較不同臨床特征OSCC患者中CDK1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，中、低分化OSCC中的CDK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于高分化的OSCC，Ⅲ, Ⅳ期OSCC組織中CDK1相對(duì)表達(dá)量也高于Ⅰ、Ⅱ期OSCC組織，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC組織的CDK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，推測(cè)CDK1可作為判斷OSCC臨床預(yù)后的一個(gè)標(biāo)志物，但是在性別以及年齡的分組中無(wú)明顯差異，推測(cè)隨著OSCC組織分化程度的降低以及臨床分期的進(jìn)展，CDK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量就越高，腫瘤惡性程度隨之升高，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，加重侵襲性，臨床預(yù)后較差。

基于本次實(shí)驗(yàn)，推測(cè)CDK1的高表達(dá)在OSCC中可能加速細(xì)胞周期G2/M期的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。有關(guān)于CDK1更精準(zhǔn)的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)早期診斷及精準(zhǔn)治療做準(zhǔn)備。