朱丹實(shí),任曉俊,魏立威,劉 賀,*,李賀文,曹雪慧,郭 迪,勵(lì)建榮,*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.錦州市三寅食品有限公司,遼寧錦州 121013)

我國是蘋果生產(chǎn)大國,蘋果產(chǎn)量連年攀升。2015年蘋果產(chǎn)量已達(dá)4261.3萬噸[1],同比2014年的4092.3萬噸增加了4.13%。將蘋果加工為即食的果汁產(chǎn)品,既可以提高商品的附加值,也可以滿足人們快速生活節(jié)奏的要求。而穩(wěn)定性不佳和易褐變一直制約蘋果濁汁產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。在褐變控制方面,目前國內(nèi)外主要通過加工過程中添加VC等抗氧化劑、減少氧氣接觸以及加熱等手段控制酶促及非酶褐變[3-4]。而混濁穩(wěn)定性方面,雖然可以通過均質(zhì)、添加穩(wěn)定劑、改變粒子的電負(fù)性等手段加以改善,但始終沒有得到根本解決。

蘋果濁汁富含的多酚及果膠類物質(zhì)具有抑菌、抗氧化等多種生物活性[5-6],在抵抗心血管疾病、糖尿病、肥胖和癌癥方面都表現(xiàn)出良好效果[7]。伴隨濁汁的失穩(wěn),是營養(yǎng)物質(zhì)的損失。研究表明,蘋果濁汁對(duì)二甲肼誘發(fā)小鼠結(jié)腸癌具有明顯的預(yù)防效果,而分離獲得的蘋果多酚單體無此功能;蘋果濁汁在抑制致癌物誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞增殖和DNA傷害方面比清汁更有效[8-9]。蘋果果膠和多酚共同飼喂小鼠對(duì)其脂質(zhì)代謝具有比單獨(dú)飼喂更好的效果,說明二者具有一定的協(xié)同效應(yīng)[10]。近年來,蘋果濁汁的研究多集中在抑制氧化酶活性[11-12]及微生物的滅活[13-14]方面,而對(duì)蘋果濁汁穩(wěn)定性方面關(guān)注較少。本文綜述了蘋果濁汁中具有起云特性的云狀顆粒物體系的構(gòu)成,聚集和失穩(wěn)過程,以及云狀顆粒體系穩(wěn)定的主要影響因素,可為提高和維持蘋果濁汁的云狀穩(wěn)定性提供理論借鑒。

1 蘋果濁汁云狀顆粒體系的構(gòu)成

蘋果濁汁體系的溶劑主要由糖、果膠、有機(jī)酸及其鹽溶液組成,顆粒體系一般認(rèn)為是以帶正電的蛋白質(zhì)為核心,果膠分子吸附其上[15]。蘋果濁汁中顆粒因光散射形成了果汁的混濁狀態(tài)[16]。濁汁制備階段形成的顆粒體系因尺寸較小及靜電斥力作用可短期內(nèi)穩(wěn)定[17]。借助醋酸鈾負(fù)染色電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)濁汁霧狀物主要是由大小不一的球狀顆粒組成的支鏈狀聚集體,如圖1所示。

圖1 負(fù)染色的蘋果汁顆粒結(jié)構(gòu)[18] Fig.1 Haze particle structures by negative stained formed in apple juice注:1a=1 μm;1b～1c=10 μm。

果汁云狀顆粒體系構(gòu)成具有相似性。對(duì)楊梅汁云狀體系微觀結(jié)構(gòu)的研究表明,云狀體系中顆粒為球形和橢圓形并被半透明膜包圍。透射電鏡研究表明,顆粒有三個(gè)亞結(jié)構(gòu),該“核心”和云狀物的中間部分為多酚或 多酚/蛋白質(zhì)復(fù)合物[19]。蘋果濁汁顆粒物組分(Cloudy Particle Components,CPC)主要包括多酚、蛋白和果膠。不同原料來源蘋果濁汁云狀成分配比不同,總體來看,云狀顆粒物組分CPC含量占30.0～72.5 mg/100 mL,其中蛋白為5.0～15.0 mg/100 mL,果膠為2.5～62.5 mg/100 mL,多酚類物質(zhì)為11.0～17.5 mg/100 mL[8,20]。Zhao等[21-22]研究蘋果汁膜過濾性能的影響中發(fā)現(xiàn),蘋果濁汁中膠體顆粒主要有兩種尺寸,中心粒徑分布分別為1和5 μm左右。蘋果濁汁中可溶性果膠含量、蛋白質(zhì)/酚類復(fù)合物的形成、酚類的氧化聚合等都影響CPC的構(gòu)成和顆粒大小[23]。而CPC對(duì)于蘋果濁汁的顏色、風(fēng)味及流變學(xué)特性也起關(guān)鍵作用[24]。

蘋果果膠是一類具有不同分子量的多糖。不同分子量的果膠有著不同的理化性質(zhì),如半乳糖醛酸含量、酯化度、黏均分子量、透光率、吸光度等均有所不同。果膠分子的主鏈?zhǔn)?50～500個(gè)α-D-半乳糖醛酸基通過1,4糖苷鍵相連接而成的,在主鏈中相隔一定距離含有α-L-鼠李糖基側(cè)鏈。氣相色譜分析表明[25],蘋果果膠中除了半乳糖醛酸外還含有8種單糖,分別為鼠李糖、巖藻糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。仇農(nóng)學(xué)等[26]利用超濾法分離得到6種不同相對(duì)分子質(zhì)量的蘋果果膠,其中相對(duì)分子質(zhì)量大于30萬的占大多數(shù),達(dá)到68.04%,相對(duì)分子質(zhì)量在5000以下的較少,只有3.31%。蘋果果膠隨著相對(duì)分子質(zhì)量的減小,果膠的半乳糖醛酸含量隨之降低,但5000～10000 kD的果膠半乳糖醛酸含量較高。隨著蘋果果膠分子量的降低,酯化度也隨之相應(yīng)降低,但是各種分子量蘋果果膠仍為高酯果膠。不同提取方法獲得的蘋果果膠性質(zhì)差別較大,目前蘋果果膠主要從蘋果果渣中提取,而對(duì)蘋果汁中果膠類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析研究較少。

蘋果多酚包括多種酚類物質(zhì),可分為酚酸及其羥基酸酯類、糖類衍生物和黃酮類化合物(如兒茶素、表兒茶素、原花青素、二羥基查耳酮、黃酮醇配糖體等)[27]。陜西師范大學(xué)的鄧紅等[28]利用高效液相色譜指紋圖譜技術(shù)鑒定了10個(gè)批次不同來源蘋果濃縮汁中多酚物質(zhì),從多酚的12種共有峰中標(biāo)定了7種單體酚,分別是沒食子酸、4-羥基苯甲酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素和根皮苷。近年來,在根皮苷對(duì)蘋果汁的褐變[29]及摻偽檢測[30]方面研究較多。與蘋果汁混濁相關(guān)的多酚只占蘋果多酚的很少一部分。Siebert等[31]發(fā)現(xiàn)蘋果濁汁沉淀物中有兒茶素和原花青素的聚合體[31]。苑博等人[32]利用超高效液相色譜(UPLC)鑒定出蘋果汁中的主要多酚類物質(zhì)分別為沒食子酸(18.39 mg/L)和綠原酸(52.10 mg/L),在長期低溫保藏其含量有所下降。而Ana L. Ramos-Aguilar等人的研究表明[33],在蘋果汁加工過程中總酚和單體酚含量都有所增加。

起云活性蛋白(Haze-Active Proteins,HAP)是指和混濁有關(guān)的蛋白質(zhì),其自身或與酚類之間的相互作用是造成果汁后混濁的重要因素。蛋白質(zhì)/酚類化合物的聚合也是澄清蘋果汁后混濁的主要原因[34]。能形成此類聚合物的蛋白質(zhì)只占其總量的一小部分,據(jù)報(bào)道,分子量12、15、28[35]、25[36]和36 kDa[37]的蛋白與蘋果汁的后渾濁有關(guān),且脯氨酸和羥脯氨酸等疏水性氨基酸含量越高,起渾能力越強(qiáng)[38]。

2 云狀顆粒物的聚集及失穩(wěn)

蘋果濁汁中由多酚/蛋白/多糖構(gòu)成的云狀顆粒物組分(CPC)在貯藏過程中逐漸聚集、失穩(wěn),其聚合過程非常復(fù)雜。多酚具有多羥基結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的親水能力,富含脯氨酸的起云活性蛋白與多酚通過氫鍵及疏水相互作用締合[22],并對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)產(chǎn)生影響。Beveridge等[34]認(rèn)為蛋白質(zhì)和酚類化合物的聚合物是蘋果汁發(fā)生混濁的主要原因。由于多酚的氧化,形成了一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng),其氧化物相互作用、相互交聯(lián),同時(shí)與蛋白質(zhì)相互作用,形成了混濁和沉淀。氧化催化是形成蛋白質(zhì)-酚類聚合物的關(guān)鍵因素,但聚合物的形成與蛋白質(zhì)和酚類化合物的類型有關(guān)。大分子酚類化合物如縮合單寧是形成蛋白質(zhì)-酚類聚合物的主要酚類化合物。蛋白質(zhì)和多酚依據(jù)氫鍵、離子鍵、疏水鍵相互作用,二者的比例也影響聚合物的量。果膠與多酚通過氫鍵、疏水作用和靜電作用相結(jié)合[39]。蛋白與果膠也可以通過共價(jià)和非共價(jià)相互作用,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的界面活性和其他功能性質(zhì)[40]。

Siebert等[31]推測蘋果濁汁中的兒茶素和原花青素首先通過自身聚合或者氧化,聚合體再與蛋白質(zhì)相互作用,導(dǎo)致果汁混濁。茶飲料的后渾濁現(xiàn)象也主要是由于蛋白和多酚的聚集導(dǎo)致,對(duì)該體系的起渾過程研究較為深入。對(duì)茶飲料后渾過程研究表明[41],多酚/蛋白交互作用的第一階段主要通過芳香環(huán)的堆疊產(chǎn)生的疏水作用形成可溶性的多酚多肽復(fù)合物;第二階段,多個(gè)多酚分子與多肽結(jié)合,并通過分子間的協(xié)同作用形成多酚包被多肽狀態(tài),同時(shí)復(fù)合物大小倍增,并發(fā)生相變;第三階段,少數(shù)多肽二聚體克服了分子間的電荷排斥而相互聚合;最終,復(fù)合物變成更大團(tuán)聚體,并從液相分離沉淀。蛋白質(zhì)和多酚的比例、pH及溫度等都影響氫鍵、離子鍵和疏水相互作用的過程,進(jìn)而影響聚合物的形成[42]。

Scollary等[43]研究了紅酒中蛋白質(zhì)、原花青素和多糖之間的相互作用方式,可為蘋果濁汁CPC研究提供理論參考,如圖2所示,虛線表明氫鍵位點(diǎn)結(jié)合,雙箭頭表示疏水相互作用區(qū)域。多糖和多酚間同樣存在疏水相互作用,但作用位點(diǎn)尚不清楚。

圖2 蛋白質(zhì)、原花青素和多糖片段之間的相互作用示意圖[43]Fig.2 Representation of interactions between protein,proanthocyanidin and polysaccharide fragments

蘋果濁汁中CPC微粒在果汁這種膠體體系中震蕩運(yùn)動(dòng),不可避免地因相互碰撞增大其尺寸。此外,果汁中可溶性物質(zhì)可能因多種復(fù)雜因素而轉(zhuǎn)化成不溶的新顆粒,直接或間接促成或增大原有顆粒尺寸。因而,隨貯藏時(shí)間的延長,蘋果濁汁中CPC顆粒逐漸聚集成復(fù)雜的分形結(jié)構(gòu),進(jìn)一步變大、沉降,其膠體顆粒結(jié)構(gòu)見圖3。同時(shí),蘋果濁汁中果膠類物質(zhì)會(huì)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長和溫度的升高而有所降解,結(jié)合其他因素使果汁的粘度降低,最終導(dǎo)致果汁變清、分層等混濁穩(wěn)定性喪失現(xiàn)象的發(fā)生[45]。

圖3 蘋果汁膠體聚集顆粒的SEM圖像[44](2 μm)Fig.3 SEM image of colloidal aggregates in apple juice[44](2 μm)

3 云狀顆粒體系穩(wěn)定的影響因素

從物理化學(xué)學(xué)角度來看,蘋果濁汁體系可認(rèn)為是膠體系統(tǒng),其流變學(xué)特性取決于液相和固相特性。作為固相的CPC的顆粒尺寸、性狀、容積率、電粘效應(yīng)、果汁的修飾粘度等均影響膠體穩(wěn)定性[46]。目前嘗試保持濁汁穩(wěn)定性的主要手段包括均質(zhì)以降低顆粒粒徑,添加穩(wěn)定劑以增加果汁黏度[47],或增加果汁中懸浮顆粒負(fù)電荷以強(qiáng)化顆粒間斥力[16]。但降低粒徑無法解決其在貯存期聚集增長的問題,通過添加穩(wěn)定劑提高黏度改善濁汁穩(wěn)定性也有局限,過高黏度會(huì)降低產(chǎn)品的感官品質(zhì)。下面介紹幾個(gè)較為重要的穩(wěn)定性影響因素。

3.1 酸度

蘋果汁的酸度對(duì)出汁率、風(fēng)味、色澤、澄清度等重要參數(shù)均有影響[48]。蘋果汁中的有機(jī)酸主要為蘋果酸,并含有少量檸檬酸和奎寧酸[49]。Siebert等[42]認(rèn)為多酚化合物主要與富含脯氨酸和羥脯氨酸的蛋白結(jié)合,形成蛋白-酚類聚合物,它的形成與pH、乙醇含量、溫度有關(guān)。Yi等[50]認(rèn)為蘋果汁較低pH降低會(huì)加劇了多糖的水解作用。果膠類多糖作用于多酚/蛋白的聚集體,一定程度上可抑制其聚集沉淀。然而根據(jù)Zhao等[22]的研究,在低溫、較低pH和高濃度條件下,隨著果膠含量的增加,果膠顆粒之間也會(huì)通過氫鍵和疏水相互作用而發(fā)生聚集。

Thongkaew等[51]研究了多酚物質(zhì)(兒茶素/丹寧)與乳清分離蛋白或乳清分離蛋白/果膠復(fù)合物的相互作用的機(jī)制,如圖4所示,環(huán)境pH影響著多酚與蛋白的聚合進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的沉淀,果膠與蛋白的可形成絡(luò)合物從而減少蛋白沉淀。Mateus等[52]對(duì)葡萄籽多糖與蛋白相互作用的研究,認(rèn)為其多酚保護(hù)機(jī)制有兩種可能,一是帶電多糖/蛋白質(zhì)/單寧聚合形成三元復(fù)合物以增強(qiáng)溶解性;二是多糖與單寧發(fā)生分子締合,從而競爭性抑制其與蛋白質(zhì)的聚集。

圖4 多酚(PP)與蛋白(P)及果膠(PE)凝聚物相互作用的可能機(jī)制[51]Fig.4 Possible mechanism implicating polyphenol interactions with protein and proteinepectin coacervates

3.2 離子強(qiáng)度及帶電性質(zhì)

對(duì)于蘋果濁汁體系,分散的膠體粒子間的靜電斥力和水合作用對(duì)蘋果濁汁的粘度影響很大[53]。Benítez[17]研究了液體介質(zhì)的pH和離子強(qiáng)度對(duì)蘋果汁顆粒穩(wěn)定性的影響,作者采用擴(kuò)展DLVO理論對(duì)膠體相互作用進(jìn)行建模,并成功應(yīng)用于果汁穩(wěn)定性和黏度的預(yù)測。Ellerbee等[54]對(duì)橙汁穩(wěn)定進(jìn)行性的研究發(fā)現(xiàn),草酸銨通過螯合鈣離子阻止因果膠分子交聯(lián)而引起的混濁橙汁云狀體系的失穩(wěn),橙汁粒子尺寸受pH和貯藏時(shí)間的影響,這說明除了鹽橋作用,云狀體系中顆粒間的非共價(jià)和非靜電相互作用力同樣發(fā)揮作用。根據(jù)Xiang等[55]的研究,蘋果汁的帶電性質(zhì)對(duì)果汁的可溶性固形物、還原糖、總酚等也會(huì)有一定影響。

3.3 溫度及酶的作用

溫度會(huì)影響濁汁體系中酶的活性、蛋白與酚類物質(zhì)的聚合、果膠的溶解性等,進(jìn)而影響蘋果濁汁的穩(wěn)定性。雖然Paepe等[56]的研究表明,高溫會(huì)使蘋果濁汁中的酚類化合物降解,且溫度越高降解越多。但是較高溫度可以使有能力形成蛋白-酚類化合物的蛋白暴露更多的結(jié)合位點(diǎn),從而形成更多的蛋白-酚類聚合物。蘋果內(nèi)源果膠甲酯酶(PME)可使果膠脫去部分甲基,使其擁有更多負(fù)電荷并緊密包裹蛋白質(zhì)核,增強(qiáng)果汁的混濁穩(wěn)定性。但是酶作用過度,則形成低甲氧基果膠易與金屬離子形成凝膠而影響混濁穩(wěn)定性。此外,低甲氧基果膠容易被蘋果內(nèi)源性果膠酶(PG)水解,蛋白質(zhì)核暴露導(dǎo)致顆粒的靜電聚集[3]。用商業(yè)果膠酶處理,雖然可提高蘋果濁汁的得率和多酚含量,但會(huì)降低果汁粘度和云度[57]。

4 展望

蘋果濁汁云狀顆粒物組分主要包含蛋白質(zhì)、多酚和果膠類多糖,但這些組分構(gòu)成云狀體系的具體形式尚不明確,其加工及貯藏過程中會(huì)失去穩(wěn)定性而導(dǎo)致聚集的機(jī)理也未完全明晰,這些都需要科研人員繼續(xù)深入研究。今后,蘋果濁汁穩(wěn)定性機(jī)理研究應(yīng)重點(diǎn)從蘋果濁汁三元復(fù)合體系的精細(xì)結(jié)構(gòu)及失穩(wěn)過程著手,如:云狀顆粒體系的形成過程,蛋白/多酚/果膠的具體分子結(jié)構(gòu)及交互作用方式,濁汁顆粒體系與溶液的作用關(guān)系及在溶液中失穩(wěn)過程等方面開展深入研究。這些機(jī)理方面的研究,有助于揭示蘋果混濁汁中云狀顆粒物的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性影響機(jī)制,為推動(dòng)蘋果混濁汁產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展奠定理論基礎(chǔ)。